生物化学杂志。2011年10月28日；286(43): 37758–37767.
软骨中间层蛋白2（CILP-2）在关节软骨和半月板软骨中表达并在实验性骨关节炎中下调*
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比安卡·C·伯纳多
从‡默多克儿童研究所和
以下部门§儿科和
克里斯托弗·利特尔
这个¶澳大利亚新南威尔士州圣伦纳德市悉尼大学科林医学研究所皇家北岸医院雷蒙德·珀夫斯骨关节研究实验室，邮编：2065
乌维·汉森
这个‖德国明斯特大学医院生理化学和病理生物化学研究所，明斯特D-48149
约翰·贝特曼
从‡默多克儿童研究所和
**澳大利亚维多利亚州帕克维尔市墨尔本大学生物化学与分子生物学3052，
从‡默多克儿童研究所和
以下部门§儿科和
**澳大利亚维多利亚州帕克维尔市墨尔本大学生物化学与分子生物学3052，
这个¶Raymond Purves骨与关节研究实验室，悉尼大学科尔林医学研究所，皇家北岸医院，新南威尔士州圣Leonards，2065，澳大利亚，以及
这个‖德国明斯特大学医院生理化学和病理生物化学研究所，明斯特D-48149
1澳大利亚研究生奖获得者。
摘要
通过转录组分析确定小鼠永久关节软骨和瞬时生长板软骨之间的差异基因表达，我们确定了一个高表达基因，西尔普2关节软骨细胞表达差异。CILP-2与CILP-1（软骨中间层蛋白1）高度同源，CILP-1在关节软骨中间区表达，与软骨退行性疾病有关。我们证明了这一点西尔普2在发育过程中，mRNA在小鼠关节软骨表面的分布受到限制，随着发育成熟，局限于关节软骨和半月板软骨的中间区域。虽然细胞外CILP-2蛋白的定位与CILP-1大致相似，但CILP-2在成熟时似乎更局限于关节软骨细胞外基质的较深中间区。CILP-2经蛋白质水解处理，N个-糖基化，存在于人类关节软骨中。在手术诱导的小鼠骨关节炎中，西尔普1和西尔普2基因表达失调。然而，鉴于西尔普1表达增加，西尔普2基因表达下调，表明对机械诱导的关节失稳有不同的反应。小鼠骨关节炎软骨中CILP-2蛋白减少。超微结构分析也表明CILP-2可能与VI型胶原微纤维有关，因此可能介导区域和区域间关节软骨基质中基质成分之间的相互作用西尔普1和西尔普2在软骨组织中表达最丰富，在肌肉和心脏中可以检测到表达。
关键词：结缔组织，发育，细胞外基质，细胞外矩阵蛋白，基因表达，关节炎，关节软骨，软骨，软骨结构，骨关节炎
介绍
在肢体发育过程中，软骨细胞遵循不同的发育途径。在长骨骨骺表面形成的软骨细胞发育成永久性关节软骨细胞，并形成有效承重和关节运动所需的平滑关节软骨。另一组软骨细胞，即暂时性骨骺软骨细胞，被组织成生长板，并经历一个从静止细胞到增殖、前增生和最终肥大终末期软骨细胞的顺序成熟程序，软骨内骨化过程中软骨细胞被骨取代。软骨细胞的两个种群对骨骼的形成至关重要，软骨细胞的正常发育和功能受到干扰会导致软骨发育不良（参考文献。1–三).
软骨功能的重要决定因素之一是细胞外基质（ECM）三结构和组成。为了确定关节软骨的新ECM决定因素，我们比较了小鼠关节软骨和生长板软骨的基因表达谱。这些研究表明，阵列上差异表达最高的cDNA是一个Riken克隆，对应于西尔普2（软骨中间层蛋白，同种型2），最近报道为软骨细胞的产物(4,5). CILP-2与已知的软骨蛋白CILP-1高度同源(5). CILP-1是一种大的分泌性糖蛋白，被认为在软骨支架中发挥作用(6). 它是从人类关节软骨中分离出来的，据报道其表达局限于领土基质中关节软骨的中间区(6). CILP-1是两种多肽的原形式，在furin内蛋白酶一致性位点被切割成不同的N端和C端片段(7). 已证明CILP-1的N末端与TGFβ1结合并抑制其在体外(8)、和CILP1号机组mRNA由TGFβ1诱导(9). CILP-1水平已显示出随年龄增长而增加(6,10)早期骨关节炎患者(11). 单核苷酸多态性与CILP1号机组骨关节炎等肌肉骨骼疾病基因(12–14)和日本人群中的腰椎间盘疾病(8)提示CILP蛋白可能在软骨结构和疾病中起重要作用。与CILP-1相比，对CILP-2在软骨和非软骨组织中的mRNA和蛋白表达知之甚少。我们的研究表明西尔普2在发育过程中，mRNA在小鼠关节软骨表面的分布受到限制，随着发育成熟，局限于关节软骨和半月板软骨的中间区域。我们证明CILP-2是一种糖蛋白，与CILP-1类似，是蛋白质水解过程。CILP-2蛋白存在于人类关节软骨中，超微结构研究表明，CILP-2可能与含有VI型胶原的上层结构有关。重要的是，我们的研究表明，在机械性骨关节炎的小鼠实验模型中西尔普2基因表达下调，提示CILP-2在关节炎病理生理学中的丢失作用。此外，我们的研究首次表明西尔普1和西尔普2在骨骼肌中，提示CILP在非软骨组织ECM的结构和功能中具有额外的作用。
实验程序
解剖和RNA制备
按照前面对生长板软骨的描述，对小鼠关节软骨进行解剖和RNA提取(15). 简单地说，根据动物伦理学会的指导原则，处死14天龄（P14）的瑞士白鼠，并解剖股骨。将组织浸入tissue-Tek OCT包埋化合物（Sakura Finetechnical）中，在低温恒温器（Reichert-Jung）上切下（5μm），在分级乙醇系列中脱水，并进行空气干燥。然后将载玻片固定在倒置显微镜（Leica）上，并使用眼科手术刀（Feather）解剖关节软骨，以及增殖性、肥大前和肥大的生长板软骨(补充图S1). 使用PicoPure RNA分离试剂盒（Arcturus Bioscience）提取总RNA，并按照制造商的说明使用MessageAmp aRNA试剂盒（Ambion）分两轮线性扩增。
小鼠骨关节炎模型
动物实验得到了动物伦理委员会的批准。10周龄雄性C57BL6小鼠右膝内侧半月板失稳（DMM）诱发骨关节炎（OA）(16). 采用假手术（暴露内侧半月板-胫骨韧带，但不横断）的关节作为对照。手术后2周和6周处死动物(n个=每个时间点4）。解剖关节以暴露关节软骨，分离胫骨骨骺并放置在含有20%EDTA的RNALater（Ambion）中，在4°C脱钙72 h，然后嵌入OCT中并储存在−80°C。连续7μm冠状冰冻切片固定在乙醇中，空气干燥，未钙化的胫骨平台内侧关节软骨，来自先前指定的软骨颤动区域，甲苯胺蓝染色消失的区域进行激光显微解剖（Arcturus）。如上所述提取并扩增总RNA。
RT PCR分析
使用SuperScript III逆转录酶（Invitrogen）在50°C下以20μl的反应体积逆转录（RT）来自关节软骨和生长板软骨的5ng aRNA，持续1h。如前所述进行PCR(15)除此之外，扩增包括在94°C下变性30 s，在58°C下退火30 s，以及在72°C下延伸30 s的35个循环。引物序列西尔普1和西尔普2列在下面补充表S1.对于要比较的多问题RT-PCR西尔普1和西尔普2根据制造商的指示，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）分离总RNA。在RNA微微/纳米芯片（安捷伦技术生物分析仪）上评估RNA质量。
微阵列表达谱分析
先前已经描述过对生长板软骨的单个微细切片增殖区、前增生区和肥大区的cDNA微阵列分析(15). 使用印有15k NIA cDNA小鼠克隆集（澳大利亚基因组研究机构）的微阵列载玻片进行微细解剖关节软骨分析。使用重复的微阵列（具有重复RNA样品的Cy3/Cy5染料wap）对DMM操作和Sham操作小鼠软骨中扩增的RNA进行微阵列表达谱分析。将标记的RNA与44k全基因组寡核苷酸微阵列杂交（G4122A，安捷伦科技公司）。所有阵列均在Axon 4000B扫描仪上扫描，并使用GenePix Pro 4.1软件（Axon Instruments）提取特征。使用打印黄土归一化处理原始数据(17)使用limmaGUI软件(18,19). 平均对数2转换表达比率和B类-统计值（对数后验优势比(17,20)计算所有直接比较。
定量实时PCR
定量实时PCR（qPCR）用于验证Cilp2型关节和生长板软骨不同区域的混合扩增aRNA。基因特异性引物和预验证探针是使用在线软件（来自罗氏应用科学）设计的，如下所示补充表S1如前所述，使用Universal Probe Library System（Roche Applied Science）进行.qPCR(22). 使用比较C类T型方法(23)，使用地图1作为内部对照，因为它在生长板区和关节软骨之间没有差异表达。在DMM小鼠软骨的表达研究中，使用两个看家基因的几何平均表达对基因表达值进行标准化，Atp5b和10卢比。在DMM小鼠模型中，微阵列表达谱显示，这些管家基因在OA发病和进展期间没有变化（数据未显示）。
原位杂交
将14天龄瑞士白鼠的膝关节嵌入，并将8μm冰冻切片安装在SuperFrost Plus载玻片上就地使用反义进行杂交[35S] 如上所述的CTP-RNA探针(15). 为了制备探针，进行PCR扩增，包括在94°C下变性1分钟，在58°C下退火1分钟，以及在72°C下延伸1分钟，使用特定的引物集对探针进行PCR扩增西尔普1和西尔普2(补充表S1). 如前所述进行杂交和放射自显影(15).
抗体
在兔子（Millipore）中制备了针对CILP-2小鼠序列TLLDRRQQGSPHELE的多克隆抗血清。通过标准酶联免疫吸附试验和免疫斑点杂交（数据未显示），CILP-2抗血清以剂量依赖性的方式与肽抗原结合。使用1ml HiTrap进一步亲和纯化CILP-2多克隆抗体TM公司NHS激活的预填充柱（GE Healthcare）符合制造商的说明。纯化的CILP-2多克隆抗体通过标准酶联免疫吸附试验和免疫印迹测试，发现与软骨提取物中的抗原和CILP-2蛋白结合（数据未显示）。免疫CILP-2肽抗原前取同一只兔子的血清作为阴性对照。瑞典隆德大学Pilar Lorenzo博士慷慨提供了针对CILP-1 N端肽序列的兔抗人CILP-1抗体。
SDS-PAGE和免疫印迹
处死14天龄的瑞士白鼠，并从髋关节获取股骨头。如前所述，从软骨中提取蛋白质(24). 简单地说，10个股骨头溶解在1毫升的4个股骨头中米盐酸胍，50米米乙酸钠，pH 5.8，含10m米EDTA和微型抑制剂混合物（Roche Applied Science）在4°C下放置24小时。通过130006×克在4°C下保持20分钟。使用9体积的冰冷乙醇在−20°C下沉淀上清液过夜，然后在70%乙醇中洗涤一次，以去除残留的盐酸胍和其他盐。沉淀物在还原莱姆利样品缓冲液（Bio-Rad）中再次悬浮并变性，在10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后转移到ImmobilonTM公司-P聚偏二氟乙烯膜（Millipore）。如前所述进行免疫印迹(25)进行了一些修改。将膜在PBS中的5%脱脂奶粉中封闭1 h，然后在含有兔抗鼠CILP-2抗体（10μg/ml）的抗体缓冲液（含0.1%吐温20的PBS中0.5%脱脂奶粉）中孵育1 h在抗体缓冲液中以1:10000的稀释度加入并孵育1小时。洗涤后，用ECL Plus Western印迹检测系统（GE Healthcare）和使用X-Omat膜的放射自显影法产生信号。
N-糖苷酶F处理
对于N个-将40μg从软骨中提取的蛋白质（如上所述）再次悬浮在25μl磷酸盐缓冲液（0.02）中进行糖苷酶F消化米磷酸钠，pH 7.0，0.1%十二烷基硫酸钠，0.05米EDTA和0.5%Nonide P-40）并煮沸2分钟，然后5单位N个-向样品中添加糖苷酶F（罗氏应用科学）酶。在37°C的加热块中进行8小时的脱糖化。脱糖化后，样品在还原Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad）中变性，在7.5%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到Immobilon-P聚偏二氟乙烯膜。如上所述进行免疫印迹。
免疫组织化学
来自60至75岁尸体捐赠者的人类关节软骨来自国际医学进步研究所（Jessup，PA；肌肉骨骼基金会的一个部门）。将福尔马林固定石蜡包埋组织切片在二甲苯中脱蜡并重新水化。为了促进抗体渗透，用30μg/ml蛋白酶K在50 m米Tris，pH 6.0，5 m米氯化钙237°C下30分钟，以及0.2%透明质酸酶（牛，IV型；西格玛）在37°C条件下1小时。然后用0.3%的H处理切片2O（运行）2在PBS中灭活内源性过氧化物酶。在4°C下用1%山羊血清和1%牛血清在PBS中隔夜封闭后，用兔抗人CILP-2抗血清或非免疫血清（在PBS的1%牛血清中稀释1:200；抗体是瑞典隆德大学Pilar Lorenzo博士赠送的）对切片进行免疫标记，并使用Vectastain Elite ABC试剂盒（Vector Laboratories）进行检测。使用Sigma观察结合抗体快速TM公司DAB片剂（Sigma）和切片用苏木精复染。为了对小鼠组织进行免疫组织化学染色，在Leica CM1580低温恒温器上，在−20°C的温度下，将冷冻的、未固定的组织的连续切片切割成8-μm厚，并将其解冻安装在超霜加玻璃载玻片上。切片在4°C的HistoChoice®Tissue Fixative（Amersco）中固定15分钟，然后在PBS中清洗3次。按照石蜡切片的描述进行免疫组织化学，但切片用兔抗鼠CILP-2抗体或在PBS的1%BSA（w/v）中稀释1:500的免疫前血清进行免疫标记。
免疫电子显微镜
如前所述，从人类关节软骨中获得超结构聚集体碎片(26). 简而言之，将软骨切片两次均质化，共15个体积为150 m米氯化钠，2米米磷酸钠缓冲液，pH 7.4（PBS），含有蛋白酶抑制剂的混合物，低速离心澄清。该程序重复了两次。小份超分子碎片被发现在副膜上。用formvar覆盖并涂有碳的镍格栅漂浮在液滴上10分钟，以便吸附材料，随后用PBS清洗，并用PBS中2%（w/v）脱脂奶粉处理30分钟。接下来，将吸附材料与CILP-2多克隆抗体和VI型胶原单克隆抗体（AF 6210，Medicorp）在含有0.2%干乳的PBS中按1:100稀释反应2h。用PBS清洗五次后，将网格放在含有涂有兔抗体（18nm金粒子，Jackson ImmunoResearch）和小鼠免疫球蛋白（12nm金粒子）的胶体金粒子的0.2%（w/v）牛奶溶液上。最后，用蒸馏水清洗格栅，并用2%醋酸铀酰负染7分钟。在省略第一抗体的情况下进行对照实验。使用Philips EM 410电子显微镜在80kV下拍摄电子显微照片。
结果
Cilp2在体内关节软骨中差异表达的鉴定
15 K NIA小鼠克隆集的微阵列分析显示，与生长板软骨细胞相比，14天龄小鼠关节软骨软骨细胞上调了50个基因，上调幅度大于5倍（增殖区、前增生区和增生区）（表S2系列). 与生长板软骨相比，14天龄小鼠关节软骨中差异最大的基因是Riken克隆1110031K21。此未标记的克隆被标识为西尔普2.的差异表达西尔普2通过PCR分析验证关节软骨中西尔普2在关节软骨中检测到，但在生长板软骨中未检测到(A类). 定量RT-PCR证实西尔普2在关节中高表达～100倍与生长板软骨（数据未显示）。现场杂交分析显示西尔普214天龄小鼠关节软骨表面和中间区域以及整个半月板的mRNA，但生长板软骨中未检测到(B类). 序列分析表明，CILP-2与软骨基质分子CILP高度同源。CILP最初是从人类关节软骨中分离出来的，是一种大的分泌性糖蛋白，被认为在软骨支架中发挥作用(6).CILP公司与骨关节炎有关(12–14)最近，一名日本人患有腰椎间盘疾病(8)，以下简称CILP1号机组(5). 我们和其他人已经证明CILP-1和CILP-2的结构相似(5) (补充图S2)含有血小板反应蛋白1型（TSP-1）重复结构域和免疫球蛋白样结构域的两种多肽。这两种蛋白质都含有信号肽，推测N个-糖基化位点、形成二硫键的半胱氨酸残基和呋喃内蛋白酶共识位点，但只有CILP-1具有假定的磷酸结合环（P-loop）基序。
西尔普2在关节软骨中表达，但在生长板软骨中不表达。 A、，RT-PCR分析表明西尔普2在关节软骨中表达(自动控制)但不是在增殖期(公共关系)，自养前(酸碱度)和肥厚(H（H）)生长板软骨。对2周龄野生型小鼠的关节软骨、增生前增生和肥大生长板软骨进行显微解剖。对RNA进行分离、线性扩增、逆转录，并进行30轮PCR。Gapdh公司作为阳性对照。B类，使用反义探针测定西尔普2关节和生长板软骨中的mRNA。暗场图片显示西尔普2在关节软骨的表面和中间区域以及整个半月板软骨中表达。西尔普2生长板软骨中未检测到mRNA。未检测到与感测探针的杂交。国会议员半月板软骨；R（右），休息区；公共关系增殖区；酸碱度前高营养区；H（H）肥厚带；结核，小梁骨。比例尺，100微米。
Cilp1和Cilp2在小鼠关节软骨中有不同的mRNA和蛋白表达
The spatial distribution of西尔普1和西尔普2在发育中的小鼠膝关节在E16.5、新生儿和随后2周龄和8周龄的膝关节发育期间进行评估().现场进行杂交以比较mRNA分布，并使用CILP-2的310–324氨基酸序列的多克隆肽抗体与相应的免疫前血清作为阴性对照进行免疫组化。
的表达式西尔普1和西尔普2mRNA在小鼠软骨发育过程中的表达。 现场胚胎杂交(图16.5)，新生儿(P0)，2周(第14页)和8周(第56页)出生后的小鼠股骨。甲苯胺蓝染色小鼠股骨和胫骨关节软骨形态(A类)或苏木精和曙红(B–D类)在开发过程中的不同时间点：E16.5(A类)、P0(B类)，第14页(C类)和第56页(D类). 暗场和亮场图像表明西尔普1(E–H（E–H）)和西尔普2(I–L型)在关节软骨和半月板软骨中表达。未检测到与感测探针的杂交（数据未显示）。自动控制关节软骨；国会议员半月板软骨。比例尺，100微米。
在E16.5，原基主要是软骨，生长板的不同区域很清楚，分化和骨化正在进行，关节空化的过程已经开始。在这个发展阶段，西尔普1mRNA也定位于股骨和胫骨表面关节软骨，生长板软骨中没有mRNA(E类).西尔普2微阵列分析中未检测到早期软骨形成期间（E11.5–13.5）的表达(22)但在E16.5处发育中的关节开始空洞后表达(我).西尔普2在新形成的关节表面（关节软骨浅层）的细胞中检测到mRNA。在下面的骺软骨中未检测到表达。新生小鼠膝关节承受的负荷最小，次级骨化中心尚未开始发育。两者都有西尔普1和西尔普2mRNA局限于关节软骨和半月板软骨表面(,F类和J型)生长板软骨中未检测到这两种蛋白（数据未显示）。mRNA表达在西尔普1和西尔普2发生于出生后2周，即第二骨化中心发育后。西尔普1表达仍然局限于股骨和胫骨的关节软骨和半月板表面(G公司). 这与Cilp2、，它在股骨和胫骨关节软骨的中间区表达，并在半月板软骨中广泛表达(K（K）). 然而，到出生后8周，当小鼠接近骨骼成熟时西尔普1在关节软骨的中间区域检测到(H（H）)，与西尔普2(我). 同样地西尔普1和西尔普2半月板软骨在8周龄时相似(,A类和C类)，通过免疫组织化学在蛋白水平上证实(,B类和D类).
CILP-1和CILP-2蛋白在关节软骨中的分布。对新生儿进行免疫组织化学(P0（P0）)，2周(第14页)，8周(第56页)，3个月(第84页)、和6个月(第182页)老老鼠股骨。用免疫前血清对对照切片进行检测(A–D). 新生儿未检测到CILP-1蛋白(E类)或2周龄小鼠股骨(F类)，但在8周龄小鼠股骨中检测到(G公司)其中CILP-1免疫染色在整个关节软骨的浅层至中间区域呈细胞周。新生股骨中未检测到CILP-2蛋白(我)出现在2周龄小鼠股骨表面(J型)以及8周龄小鼠股骨的深部区域(K（K）). CILP-2蛋白仍存在于3-(H（H）)和6个月(我)老老鼠股骨。比例尺，50微米。
半月板软骨中CILP-1和CILP-2 mRNA和蛋白表达的分布。的亮场图像就地杂交西尔普1(A类)和西尔普2(C类)成年小鼠半月板软骨中的mRNA表达显示mRNA在表面区表达。未检测到与感测探针的杂交（数据未显示）。用抗CILP-1抗体检测半月板软骨(B类)或CILP-2(D类). 8周龄小鼠半月板纤维软骨基质中强烈存在CILP-1和CILP-2蛋白。CILP-1在半月板中心有细胞周定位(B类)CILP-2不仅在组织的中心，而且在半月板的外部区域也很明显(C类). 免疫前血清未发现染色(E类).比例尺，50微米。
新生小鼠膝关节CILP-1和CILP-2免疫染色未检测到蛋白(,E类和我). 在2周龄的膝关节中，CILP-2蛋白在关节软骨软骨基质的表层以及中间区的关节软骨区域间基质中检测到(J型). 在此阶段无法检测到CILP-1(F类). 随着发育成熟（8周龄），CILP-2蛋白出现在小鼠关节软骨的中深层区的区域间基质中(K（K）). 这与CILP-1形成对比，CILP-1在8周龄时主要在软骨基质的细胞周区检测到，从浅层区延伸到深层区(G公司). 在3个月和6个月大的小鼠中，进一步证实CILP-2在成熟软骨深层的特异性定位(,H（H）和我). CILP-1和CILP-2在关节软骨和半月板软骨中的定位表明，这些ECM蛋白可能是此类永久软骨的组成部分，而不是暂时生长板软骨。
CILP-2经过蛋白质水解、糖基化并整合到关节软骨ECM中
用强变性剂提取人类关节软骨，4米盐酸胍以前被证明能溶解CILP-1蛋白(6). 这与CILP-2蛋白的情况相同。用4米盐酸胍溶解了CILP-2蛋白，该蛋白是SDS-聚丙烯酰胺凝胶在还原条件下以～90 kDa迁移的主要带(A类). 鉴于CILP-2的全长分子量为125kDa，这表明关节软骨中的大多数CILP-2蛋白被裂解，很可能在furin裂解部位。CILP-1也是如此(6). CILP-1和CILP-2都需要被这种强变性剂溶解，这表明这两种蛋白都是软骨ECM的相互作用成分，与其他软骨ECM蛋白类似，如WARP(25)和苦参素-1(27).
CILP-2是软骨细胞外基质糖蛋白。 A类，对2周龄软骨盐酸胍提取物中的CILP-2进行免疫印迹分析，发现在～90 kDa处存在N末端片段。B类，对软骨蛋白提取物进行N个-糖苷酶治疗。反应产物被还原并在7.5%SDS-PAGE凝胶上溶解。将蛋白质印迹到PVDF膜上，并用CILP-2抗血清进行探测。流动性的相对变化N个-糖苷酶处理表明CILP-2含有N个-连接的低聚糖。
此外，CILP-2的相对迁移率随着N个-糖苷酶F(B类)，从～90至～80 kDa，确认CILP-2包含N个-连接的低聚糖。这一发现与生物信息学数据一致，表明推测N个-糖基化位点(补充图S3)，与CILP-1类似，其中高达10%的CILP-1含量可归因于N个-连接的低聚糖(6).
CILP-2与胶原VI ECM超微结构共调大
在人类关节软骨中，CILP-2蛋白在区域间基质中被检测到，位于中深层(B类)为了研究人软骨中CILP-2的超结构组织，利用本研究中产生的多克隆CILP-2抗体，通过免疫金电子显微镜在人软骨匀浆中观察到CILP-2。关节软骨的免疫金标记证实了CILP-2在该组织中的发生和分布。CILP-2位于无定形纤维外物质中(C类)与含有异型胶原的II纤维密切相关，可见为大的交叉带纤维(D类). 因为VI型胶原的表达与CILP-2的表达重叠，并且也局限于软骨细胞的细胞周基质(补充图S4)我们使用免疫金电子显微镜研究了CILP-2（18nm颗粒）和VI型胶原（12nm颗粒）在人类软骨样品中的定位。这表明许多CILP-2颗粒位于VI型胶原颗粒附近(,C类和D类)提示在人类关节软骨中，CILP-2可能与VI型胶原结合形成更大的多聚体超结构。
CILP-2在人类关节软骨提取物中的定位。 A类和B类在人类关节软骨中，CILP-2蛋白在区域间基质中，在中深层区域中被检测到(B类). 对照切片用CILP-2免疫前血清进行检测(A类).比例尺，50微米。C类和D类，通过电子显微镜观察证实CILP-2在人类关节软骨中分布的代表性显微照片。免疫金颗粒（CILP-2，18nm颗粒黑色箭头; 胶原VI、12nm颗粒，白色箭头)定位于含有胶原VI的上层结构内(C类)也作为包含VI型胶原的上层结构的一部分，与包含II型胶原的异型软骨纤维密切相关(D类).比例尺，100纳米。
实验性骨关节炎时Cilp2表达下调
西尔普1和西尔普2在手术DMM诱导OA的小鼠关节软骨中测定mRNA表达。在该模型中，术后2周，胫骨平台内侧的早期局灶性变性很明显，表现为非钙化关节软骨中聚集蛋白聚糖的丢失。到6周时，聚集蛋白聚糖的丢失已经进展，软骨颤动明显(16). 从DMM关节的局灶性病变区域和未发生OA的假手术对侧关节的同一区域显微解剖软骨。微阵列表达谱显示术后2周（早期OA）西尔普1表达增加了3.6倍(n个= 4,第页=0.026）和西尔普2表达减少1.7倍(n个= 4,第页= 0.023). 6周时西尔普2表达减少1.8倍(n个= 4,第页= 0.012). 中的变化西尔普1和西尔普2用qRT-PCR测定的表达在个别动物之间显示出一些差异(). 然而，平均折叠变化具有与微阵列分析中观察到的相似的时间模式。尽管西尔普12周时（平均变化5.2倍，n个= 4),西尔普2表达轻微下调（平均变化-1.3倍，n个= 4). 然而，在术后6周，西尔普2与假关节相比，表达显著下调（平均变化−3.0倍，n个= 4). 这些数据显示Cilp1型和减少西尔普2在对来自1、2和6个术后DMM和假手术小鼠关节的合并微切割软骨损伤组织的独立表达谱实验中，进一步证实了在小鼠手术诱导的OA中的表达（数据未显示）。DMM术后4周和8周胫骨平台内侧软骨的免疫组织化学分析显示CILP-2蛋白降低(,B类、C、，E类、和F类)与对照软骨相比(,A类和D类)与骨性关节炎软骨损伤中聚集蛋白聚糖的丢失一致(,H（H）和我).
西尔普1和西尔普2骨关节炎小鼠模型的mRNA表达。的qPCR西尔普1和西尔普2术后2周和6周假关节和DMM关节的表达。显示每个时间点四只小鼠的结果（三个技术复制品的平均值），并以相应的颜色显示每只小鼠的假手术和DMM软骨数据。结果显示为ΔC类T型之间西尔普1和西尔普2和两个看家基因的几何平均表达，Atp5b和10卢比(管家基因). 每个时间点的中值结果由水平线.
骨关节炎小鼠模型软骨退变过程中CILP-2蛋白减少。对照组CILP-2的免疫组织化学(A类和D类)和DMM关节(B类和E类)手术后6周(C类和F类)甲苯胺素染色缺失显示，软骨退变期间，深层关节软骨区软骨细胞区域和区域间基质中CILP-2蛋白丢失(H（H）和我).比例尺，100微米。
Cilp1和Cilp2也在特定的非软骨组织中表达
的表达式Cilp1型和西尔普2通过RT-PCR对各种小鼠组织进行分析().西尔普1和Cilp2型在肌肉和心脏组织中表达。此外，西尔普2在大脑中表达。
西尔普1和西尔普2在非软骨组织中表达。对各种小鼠组织的RT-PCR分析表明西尔普1也在心脏、骨骼肌和软骨中表达。西尔普2除软骨外，还表达于心脏、骨骼肌和大脑。Gapdh显示为加载控件。对照样品含有水，并且-RT公司表示在不存在逆转录酶的情况下合成的cDNA。
讨论
虽然研究了永久关节软骨和瞬时生长板软骨的差异转录组，但我们发现了一种新的ECM分子，即由关节软骨细胞唯一表达的CILP-2。我们对发育中软骨中CILP-2的mRNA和蛋白分布进行了表征，并将其与CILP-1亚型进行了比较。我们的报告显示，CILP-2在结构上与CILP-1相似，具体定位于成熟关节软骨的中深层区，沉积在区域间基质中，也在半月板软骨中表达。我们的数据还表明，CILP-2可能是人类关节软骨中含有VI型胶原的上层结构的一部分。我们还证明了创伤后OA发展过程中关节软骨细胞中CILP-1和CILP-2表达的调节存在明显差异。
CILP-2蛋白和mRNA仅限于关节软骨和半月板，在发育肢体的软骨原基中不表达。缺少西尔普2生长板软骨中的mRNA和蛋白质表明，CILP-2是永久软骨的组成部分，而不是将要发生骨化的暂时软骨，并进一步确定了关节软骨细胞合成的细胞外基质的特殊组成。尽管CILP-1和CILP-2在结构上相似，可能具有冗余功能，但我们发现它们的mRNA和蛋白质表达存在一些差异，这表明可能存在功能差异。mRNA表达西尔普1和西尔普2在出生后2周之前大致相似，其中西尔普2表达于关节软骨的整个中间区，广泛分布于半月板，但西尔普1仅限于关节软骨和半月板的表面。然而，在出生后8周西尔普1和Cilp2型在关节软骨的中间区域表达。
CILP-2与其他蛋白质（除CILP-1外）之间缺乏相似性，也没有CILP-1基因敲除或转基因小鼠模型，因此很难推测CILP-2在关节软骨中的功能和作用。初步研究表明，CILP-1（C末端）的一个片段与猪核苷酸焦磷酸水解酶（NTPPH）同源，可能与NPP活性有关(10). 然而CILP-1或CILP-2基因具有NPP活性所需的结构域。对重组CILP-1和CILP-2进行NPP活性测试，证实CILP-1与CILP-2没有表现出固有的NPP活性(5).
CILP-2中TSP-1结构域的存在增加了其可能锚定到其他基质成分的可能性。TSP-1中存在的三个1型重复序列基序的功能已被广泛研究。据报道，它们的作用是(一)许多细胞类型的附着位点(b条)血管生成抑制剂(c（c）)蛋白质结合位点，以及(d日)糖胺聚糖（GAG）结合位点（参考文献。29和30)). 结合GAG的能力对许多细胞外和膜蛋白的功能很重要，据报道TSP-1重复序列基序可介导几种蛋白中的GAG结合。当软骨酶ADAMTS-4中的TSP-1结构域被删除时，它无法与聚集蛋白聚糖分子的糖胺聚糖结合，这表明TSP-1区域对底物识别和裂解至关重要(31). W（S/G）X（X）W与血小板反应蛋白与肝素、硫酸肝素和硫酸软骨素的硫酸化GAG链的相互作用有关(32,33)而CSVTCG基序能够与血小板反应蛋白受体CD36结合(34). 此外，W（S/G）X（X）W基序是TSP-1结构域中定义良好的一致序列，能够与TGF-β1结合(35,36). 最近，CILP-1蛋白被证明能结合并抑制TGF-β1(8)CILP-1 mRNA的表达被证明是由TGF-β1诱导的，并且依赖于TGF-受体的信号传导(9). 这些基序在CILP-2中保守，因此CILP-2可能具有识别和结合其他基质成分的潜力。我们提供的数据支持这一假设。我们发现CILP-2位于人类软骨基质中，与包含VI型胶原的上层结构非常接近。这些数据表明CILP-2和VI型胶原之间存在潜在的相互作用，或者CILP-2可能通过中间分子与包含VI型胶原的微纤丝相关。后者用基质蛋白-1观察到，其中二聚糖/基质蛋白-1或核心蛋白/基质蛋白1复合物作为VI型胶原微纤丝之间的连接(37).
我们的研究首次表明西尔普2与假手术关节相比，骨关节炎小鼠模型在术后6周软骨退变期间的基因表达失调减少了几倍（微阵列为-1.8倍；qPCR为-3倍）。在这个阶段，软骨侵蚀是明显的，表达的改变可能是软骨退化的结果。这与对Cilp2型随着OA进展，也就是说，6周时的效果比2周时更大。然而，也有可能减少Cilp2型这种表达可能是由关节失稳模型中的生物力学变化引起的。此外，我们发现，在蛋白水平上，骨性关节炎病变下方深层软骨中的CILP-2显著降低。CILP-2的减少可能是西尔普2或可能还涉及CILP-2降解。鉴于CILP1号机组与许多软骨退行性疾病有关(8,13,14)这是西尔普2软骨疾病。下调西尔普2与上调西尔普1在OA中，我们的研究证明了这一点，之前也有报道(11)在人类OA软骨中。这种差异反应表明西尔普1和西尔普2可能在疾病病理学中起着不同的作用。
的表达式西尔普2因此，CILP-2可能有助于探索作为检测关节疾病软骨损伤的生物标记物。最近，CILP-2的C末端多肽被证明对病变软骨中的特异性金属蛋白酶蛋白水解敏感(38). 四个CILP-2肽被鉴定为金属蛋白酶从软骨中释放的20个最丰富肽片段的一部分。这些数据与我们在小鼠OA软骨中发现的CILP-2蛋白减少相一致，并表明CILP-2肽可能是关节炎或关节软骨中金属蛋白酶活性的潜在生物标志物(38).
我们的数据还表明，CILP-1和CILP-2并非仅由软骨细胞产生。我们检测到西尔普1和西尔普2心脏和骨骼肌。许多基质分子是两种组织的组成部分，包括I、III、V和VI型胶原(39–43)、tenascin-C和decorin(6,21,28)因此，CILP-2可能有助于这些结缔组织内的结构组织和基质结构。
致谢
我们感谢Katrina Bell博士（MCRI，生物信息学）对微阵列数据分析的帮助，感谢Bruce Caterson教授（加的夫）和Pilar Lorenzo博士（隆德）的建议和对手稿的批判性阅读。
三使用的缩写如下：
- 发动机控制模块
- 细胞外基质
- CILP-2
- 软骨中间层蛋白2
- 定量PCR
- 定量PCR
- TSP-1型
- 血小板反应蛋白1型
- 数字式万用表
- 内侧半月板失稳
- 办公自动化
- 骨关节炎
- 第14页
- 出生后14岁。
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