受体介导的细胞摄取机制与细胞内储存相结合

STRA6催化的视黄醇从holo-RBP中释放。（A）与来自STRA6、STRA6/LRAT、STRA6-G340L突变体或对照细胞的膜孵育的holo-RBP的视黄醇荧光发射光谱。控制装置的最大发射信号定义为100%。（B）比较STRA6和STRA6/LRAT在holo-RBP中的视黄醇释放。将holo-RBP与STRA6、STRA6/LRAT、STRA6-G340L或对照未转染膜孵育2小时后，将每个反应分为膜结合部分和可溶性部分。测定各组分的视黄醇荧光。最高视黄醇荧光信号（G340L的未结合部分）定义为100%。尽管STRA6/LRAT处理的holo-RBP（红色星号）上清液中没有可检测到的视黄醇，但STRA6处理的holo-RBP（蓝色条）上清中有显著的视黄醛荧光。（C）由于SDS（0.2%）抑制holo-RBP而非游离视黄醇的荧光，因此STRA6处理的holo-RBP上清液的视黄醇荧光被抑制，表明视黄醇以holo-RBP-的形式存在，而不是以游离形式存在。SDS处理前每个样品的视黄醛荧光定义为100%。（D）用高效液相色谱法分析了STRA6和STRA6/LRAT从holo-RBP中释放到膜中的视黄醇的命运。STRA6/LRAT膜中的视黄醇已转化为视黄醇酯，但STRA6膜中的视黄醇仍然是视黄醇形式。

STRA6催化的视黄醇释放特性。（A）从人血清中纯化RBP/TTR复合物。Sypro Ruby-tained SDS-PAGE凝胶左侧显示了用于纯化RBP/TTR复合物的三个色谱柱中的正常人血清和含有RBP/TTR-的峰组分。（B）STRA6催化天然RBP/TTR复合物中的视黄醇释放。将纯化的RBP/TTR复合物（0.4μM）与STRA6或STRA6/LRAT膜培养，但不与对照或LRAT膜孵育，导致视黄醇荧光显著降低。0分钟时的视黄醇荧光定义为100%。（C）视黄醇荧光分析（0分钟加入holo-RBP）表明，当RBP与STRA6摩尔比较低时，STRA6（0.2μM）释放视黄醇的效果与使用LRAT的STRA6一样，但当RBP和STRA6的摩尔比增加时，效果要差得多。每个反应的每个时间点的视黄醇荧光信号在0 min时归一化为其自身的值（定义为100%）。（D）游离视黄醇（4μM）抑制STAR6催化的视黄醇从holo-RBP（1μM）中释放（向上箭头），但LRAT或CRBP-I（向下箭头）可减轻这种抑制。0分钟时的视黄醇荧光定义为100%。

视黄醇荧光测定，实时监测STRA6催化的视黄醇负载。在每次反应开始0分钟时添加的视黄醇或RBP显示在每个图表的左下角。（A）如果添加了apo-RBP，则在与STRA6孵育后从RBP释放的视黄醇被加载回RBP。LRAT阻止了此装载活动。所有反应在0 min时添加Holo-RBP，在90 min时添加apo-RBP。0分钟时的视黄醇荧光定义为100%。（B）STRA6催化游离视黄醇快速加载到apo-RBP，但大约30分钟后，信号开始衰减。对照膜未检测到视黄醇负荷。0分钟时添加视黄醇。视黄醇加载期间达到的最高视黄醇荧光值定义为100%。（C） 和（D）比较STRA6催化的视黄醇负荷（C）和视黄醇释放（D）。除了三种不同的STRA6浓度外，反应中还含有相同数量的视黄醇（2μM，游离或结合到RBP）和RBP（2μM，作为apo-RBP或holo-RBP）。每个负载反应的荧光特征是快速上升到峰值，然后衰减。相反，每个释放反应的荧光特征是缓慢下降到平台。对于负载反应，所有反应中的最高视黄醇荧光定义为1。对于释放反应，0分钟的视黄醇荧光定义为1。（E）当STRA6有同等机会催化视黄醇释放（2μM视黄醇和2μM apo-RBP）或负载（2μM holo-RBP）时，负载活性最初占主导地位（橙色线）。STRA6催化的视黄醇释放反应用于比较（蓝线）。在0分钟时加入的holo-RBP和/或游离视黄醇形式的视黄醇荧光定义为1。（F）LRAT和CRBP-I均抑制了使用游离视黄醇的依赖于STRA6的载脂蛋白-RBP的重新加载。在0分钟时，向STRA6、STRA6/CRBP-I、STRA6/LRAT或与载脂蛋白R-BP预混合的对照膜中添加1μM视黄醇。CRBP-I浓度为2μM。0分钟时的视黄醇荧光信号定义为1。

视黄醇-EGFP-FRET分析，监测STRA6催化的视黄醇从holo-RBP到EGFP-CRBP-I的转运。对于A和B，在0分钟时添加0.5μM holo-RBP。（A）与CRBP-I相关的视黄醇和EGFP之间的FRET通过510 nm处EGFP发射峰的时间依赖性和伴随性增加（红色箭头）和470 nm处视黄醇发射峰的减少（左侧面板）来证明。0分钟470 nm处的发射定义为100%。所有光谱与470 nm峰进行归一化后，510 nm峰变得更加明显（右侧面板）。470 nm处的发射定义为100%。（B）如果EGFP与CRBP-I无关，则未观察到510 nm的峰值。0分钟时470 nm的发射被定义为100%。（C）实时FRET分析显示FRET信号依赖于STRA6和EGFP-CRBP-I，除非添加apo-CRBP-I（1μM），否则信号不会衰减。在0分钟时添加Holo-RBP（2μM）。

LRAT和CRBP-I对STRA6底物摄取的依赖性增强。每个实验的示意图显示在顶部。（A）视黄醇荧光分析（0分钟加入4μM holo-RBP）表明RDH显著增强了STRA6催化的视黄醇释放。在所有反应中添加NADP（0.2 mM）。（B）CRABP-I，但不是CRBP-I或LRAT，与STRA6配对用于蜂窝^三H-维甲酸摄取^三H-维甲酸/RBP。STRA6/CRABP-I转染细胞的活性定义为100%。CRABP-I细胞的活性是由于RBP向细胞中非特异性释放维甲酸所致。CRBP-I和LRAT在维甲酸摄取中不能与STRA6偶联，这与CRBP-I-不结合维甲酸和维甲酸不是LRAT底物的事实一致。每个实验的顶部都绘制了一个示意图。

β-紫罗兰酮刺激STRA6介导的视黄醇摄取。（A）未标记的视黄醇或β-紫罗兰酮加速STRA6介导的^三来自的H-视黄醇^三H-视黄醇/RBP。未标记的视黄醇（2μM）或β-紫罗兰酮（2μM）显著提高了STRA6介导的细胞对^三H-视黄醇来自^三H-视黄醇/RBP，但对与对照细胞的反应几乎没有影响。特异性表明^三冷视黄醇和β-紫罗兰酮对H-视黄醇的摄取均由STRA6介导。（B）视黄醇荧光分析（0分钟加入2μM holo-RBP）表明，β-紫罗兰酮（10μM）促进了STRA6催化的视黄醇释放。β-紫罗兰酮依赖于STRA6来加速RBP的视黄醇释放，箭头所示，在初始阶段没有影响。（C）在0分钟时加入Holo-RBP（1μM）。在30分钟和60分钟时加入β-紫罗兰酮（10μM）可加速视黄醇的释放。与0分钟添加的β-紫罗兰酮（B）相比，效果更快。这些结果表明，β-紫罗兰酮仅在STRA6释放大量视黄醇时才显示其刺激作用，并且β-紫罗兰酮通过阻断视黄醇负荷增加视黄醇释放。一直以来，STRA6催化视黄醇在不含β-紫罗兰酮但不含β-Ironone的情况下于90分钟加入apo-RBP（1μg）。（D）β-紫罗兰酮和视黄醇相互拮抗STRA6对视黄醇释放的影响。游离视黄醇（2μM）抑制了STAR6催化的视黄醇从holo-RBP中的释放（蓝色向上箭头），而β-紫罗兰酮（10μM）促进了STRA6催化的视黄醇释放（棕色向下箭头）。β-紫罗兰酮和视黄醇的联合使用比单独使用β-紫罗兰酮产生的刺激作用小（灰色向上箭头），比单独使用视黄醇产生的抑制作用小（黄色向下箭头）。在0分钟时添加Holo-RBP（1μM）。（E）β-紫罗兰酮以浓度依赖性的方式抑制STRA6依赖性视黄醇加载到载脂蛋白-RBP中。在0分钟时向含有1μM apo-RBP的每个反应中添加视黄醇（1μM）。对于B-E，最高视黄醇荧光定义为1。（F）β-紫罗兰酮增强了STRA6介导的仅用于STRA6和STRA6/CRBP-I细胞的人血清视黄醇摄取。显示了从每个反应中提取视黄醇后视黄醇的HPLC峰值（红色箭头突出显示了β-紫罗兰酮对STRA6的刺激作用）。在此分析之前，细胞表面结合的RBP已被去除。最高视黄醇摄取活性定义为1。