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J签证费用。2011; (53): 2828.
2011年7月21日在线发布。 数字对象标识：10.3791/2828
预防性维修识别码：1969年3月158日
PMID：21808224

小鼠乳腺发育和功能的评价

伊莎贝尔·普兰特, 迈克尔·K.G.斯图尔特,和戴尔·W·莱尔德
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

人类乳腺由15-20个叶组成，这些叶将乳汁分泌到乳头处开口的分支导管系统中。这些叶本身由许多末端导管小叶单位组成，小叶单位由分泌小泡和汇聚导管组成1在小鼠中，妊娠时观察到类似的结构，导管和肺泡散布在结缔组织基质中。小鼠乳腺上皮是一个由两层细胞组成的树状导管系统，内层是管腔细胞，外层是肌上皮细胞，由基底膜包围2出生时，只有一个基本的导管树，由一个主导管和15-20个分支组成。在激素的影响下，大约4周大的青春期开始，枝条伸长和扩增3、4、5在10周时，大部分基质被一个复杂的导管系统侵入，在每个发情周期中都会经历分枝和退化的循环，直到怀孕2怀孕开始时，第二个发育阶段开始，上皮细胞增殖和分化，形成葡萄柚状的乳分泌结构，称为肺泡6、7分娩后和整个哺乳期，乳汁由腔分泌细胞产生，并储存在肺泡腔内。催产素的释放，是由幼鼠哺乳所引起的神经反射所刺激的，它会诱导肺泡周围和导管沿线的肌上皮细胞同步收缩，从而使乳汁通过导管输送到乳头，在那里幼鼠可以获得乳汁8乳腺的发育、分化和功能是紧密协调的，不仅需要基质和上皮之间的相互作用，还需要上皮内的肌上皮细胞和管腔细胞之间的相互影响9,10,11因此，与这些相互作用有关的许多基因突变可能损害青春期导管的伸长或妊娠早期肺泡的形成、妊娠晚期的分化和导致泌乳的分泌激活12,13在本文中，我们描述了如何解剖小鼠乳腺并使用整体坐垫评估其发育。我们还演示了如何使用基于体外催产素的功能检测来评估肌上皮收缩和排乳。因此，可以确定基因突变对乳腺发育和功能的影响就地通过在突变和野生型对照小鼠中执行这两项技术。

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协议

1.乳腺剥离

  1. 用一氧化碳安乐死老鼠2吸入。避开颈部如果可能的话，脱位，因为它可能会损伤导致血液在乳腺周围积聚，使解剖更加困难。然而，如果其他标准将在同一只小鼠中进行评估，例如催产素，替代安乐死方法可能是必要的，尽管这必须由IACUC评估。
  2. 在用箔纸包裹的聚苯乙烯泡沫上，将老鼠放在背上，展开四肢。使用16至20号针牢牢固定所有四肢（图1A）。
  3. 向小鼠大量喷洒70%乙醇。
  4. 使用镊子，在中线处拉起腹部皮肤，并用锋利的剪刀做一个小切口。
  5. 从切口开始，将皮肤切至动物颈部，同时避免刺穿腹腔或胸腔（图1B）。
  6. 将前腿的皮肤切至中线切口，形成“Y形”（图1B）。用同样的方法切割后肢的皮肤（图1B）。
  7. 用止血钳轻轻剥离小鼠一侧的腹部和胸部皮肤。如果需要，轻轻切割结膜组织。
  8. 用16至20号针头将皮肤固定在聚苯乙烯泡沫上，露出皮肤下侧的乳腺。继续一次完成一侧（图1C）。
  9. 使用镊子，轻轻提起感兴趣的乳腺，用小而锋利的剪刀在乳腺和皮肤之间进行切割，从外侧开始向动物脊椎方向切割。一定要小心切割，这样就不会有皮肤或肌肉残留在腺体上。所有的乳腺（图1）都可以使用此方案切除，但腹部乳腺（#4）最适合整体安装。2第和3第个腺体有一些交叉指状的肌肉，虽然它们可以用于整个坐骑和组织学研究，但它们可能并不适合所有的分析。

2.整体安装

  1. 至少在解剖前一天，将1g胭脂红和2.5g硫酸铝钾溶解在500ml蒸馏水中，制备胭脂红明矾溶液，并在1升锥形烧瓶中煮沸20分钟。用水将最终体积调节至500 ml。用沃特曼纸过滤，加入少量百里酚（少量谷物）作为防腐剂。冷藏。染色后，可以将胭脂红明矾溶液倒回储备瓶中，并在数周内多次重复使用。当颜色变暗时，制作新的溶液。
  2. 将小鼠乳腺切除（步骤1）后，直接将其铺在玻璃载玻片上。尽量把它弄平，保持原样就地形状。当适当拉伸时，腺体会很好地粘在幻灯片上。
  3. 将腺体浸入卡诺伊固定剂（100%EtOH、氯仿、冰醋酸；6:3:1）中，将其固定在载玻片上，在通风橱中室温下放置在一个罐子中4小时。请注意，其他人已经用了2个小时，这似乎已经足够了。或者，也可以将压盖整夜固定在4°C。
  4. 在70%乙醇中清洗15分钟。然后，从罐子中取出一半乙醇溶液并用ddH替换，在水中逐渐复水2O.培养5分钟，重复3次。或者，使用70%、35%、15%乙醇和水浴各5分钟。
  5. 用蒸馏水冲洗5分钟。
  6. 在室温下用胭脂红明矾染色过夜。应该注意的是，染色可能需要更长的时间，这取决于腺体的厚度。
  7. 去除胭脂红明矾染色后再次使用，并通过连续乙醇浴（50%、70%、95%、100%）使染色组织逐渐脱水，每次5分钟，然后在二甲苯中或在无毒替代品（如Histo-clear）中隔夜清除。脱水和清除也可能需要较长时间的培养，以获得较厚的样本。
  8. 将乳腺浸泡在水杨酸甲酯中。乳腺可以保存在通风橱中的水杨酸甲酯中，直到可以拍摄图像。
  9. 通过将幻灯片放在光桌上，可以在通风橱中用固定在三脚架上的普通数码相机拍摄图像（如果可用，请使用“宏”功能）。使用解剖显微镜进行放大。或者，可以将乳腺安装在Permount（步骤2.7后）等介质中，以便在任何成像平台上的化学通风柜外拍摄照片，前提是安装件足够薄。
  10. 为了使用整体支架量化乳腺发育，可以评估导管部分分支（或侧支）的数量、初级导管的长度或上皮与脂肪组织面积的比率。最后，在摄影记录之后，可以将整个乳腺组织包埋在石蜡中进行切片和常规组织学染色。

3.催产素诱导排乳

  1. 刚喂食完幼崽就把它们从母体中分离出来。等待1小时后再进行化验。
  2. 如前所述，牺牲母亲并露出乳腺（步骤1.1至1.8），但不要将其从动物身上取下。
  3. 使用移液管将PBS或催产素溶液直接均匀滴在感兴趣的乳腺上，开始检测。可以使用大范围的剂量；●通常使用8 pg/ml（生理剂量）。然而，可以使用高的非生理剂量（高达1mg/ml）来确保在转基因小鼠模型中没有反应。对于该程序，建议使用胸部（#2-3）腺体，将一侧作为对照（接触PBS），另一侧用于测试排乳（接触催产素）。
  4. 培养1分钟，用移液管小心吸出溶液。牛奶进入导管可以通过录像监控，或者在PBS或催产素暴露前后拍摄图像。

4.代表性结果：

在一个良好的整体中，乳腺很好地展开，上皮管很容易观察到（图2A）。如果腺体没有很好地铺开，当放在固定液中时，它可以部分或全部从载玻片上提起。然后，压盖变硬，无法使用（图2B）。同样，如果腺体未被很好地解剖，则可能会丢失部分上皮（图2C），或者皮肤或腹部肌肉的剩余部分会干扰腺体的分析（图2D）。

对于催产素测定，重要的是每次都要将哺乳的幼崽与母鼠分开相同的时间。通过这种方式，您可以确保在接触催产素之前导管中没有牛奶或少量牛奶，而且肺泡中有足够的牛奶，可以通过肌上皮收缩将其喷射到导管中（图3A）。如果幼崽被过早取出，乳汁会积聚在肺泡和导管中，使催产素的作用难以监测（图3B）。或者，如果在幼崽取出后过早进行实验，乳汁将没有时间积聚在肺泡中，并且催产素诱导的肌上皮细胞收缩不会触发足够的乳汁释放到导管中进行观察（图3C）。

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图1。小鼠乳腺剥离。用四条腿（A）将鼠标固定在其背部。首先从腹部到颈部切开皮肤。然后从腹部中心到四肢做垂直切口，如虚线（B）所示。轻轻剥下动物侧面的皮肤并用针固定，露出乳腺（C）。

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图2。小鼠乳腺全贴。上皮管（箭头）和淋巴结（箭头）很容易在一个分布良好的乳腺中观察到，整个腺体#4（a）。扩散不良的乳腺可能会从载玻片上脱落并塌陷，导致无法使用（B）。切除不当的乳腺可能会缺失部分（C）或残留肌肉或皮肤（D）。请注意，2第和3第个腺体有叉指肌，但仍可用于整个坐骑或组织学检查。

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图3。催产素暴露（A）后，可以在上皮管中观察到催产素诱导的排乳（箭头）。然而，如果在最后一次哺乳幼崽后，由于潜伏期过长，在试验开始时导管中已经充满了牛奶（箭头），则很难观察到催产素暴露后导管（箭头）中牛奶的进一步积聚（B）。或者，幼崽哺乳后的短潜伏期不允许在暴露催产素（C）后导管（箭头）中适当观察到足够的乳汁积聚到肺泡中。使用数码相机（Cybershot，索尼）拍摄催产素暴露前后的图像。

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图4。整体安装和催产素治疗分析的示意图。

讨论

乳腺的发育和功能是紧密协调的。突变小鼠可能携带有可能损害乳腺发育和功能的基因突变，这突出了评估腺体结构的必要性13,12在乳腺发育的所有阶段，都可以按照本文所述进行整体安装。通常情况下，上皮的发育是在青春期开始（4周大）、青春期中期（6周大）和青春期后（10-12周大）进行评估的2,10在这些阶段，可以确定导管分支的数量、末端芽的数量和导管的长度，以量化腺体的发育程度14,15同样，肺泡发育（妊娠期间肺泡的发育）通常在妊娠期间的2-3个点测定；哺乳期和退化期发生的结构变化也可以在整个腺体制剂中观察和量化16然而，由于组织密度的原因，很难对妊娠晚期和哺乳期小鼠的整体坐骑进行量化。建议将整个坐骑与组织学分析相结合，尤其是对于这些阶段12为了进行更详细的组织学评估，可以使用本报告中提到的相同方案切除乳腺，用福尔马林固定，并进行苏木精和伊红染色。一旦进行成像，整个支架也可以石蜡包埋并用于组织学。对于这两种技术，正确而精细的乳腺解剖是至关重要的。如果正在评估突变小鼠，将这些小鼠与可能最接近的对照小鼠进行比较是很重要的，因为不同的小鼠菌株可能表现出不同的侧链或第三链，或肺泡生成17例如，与BALB/c小鼠相比，C57BL/6小鼠的侧分支和肺泡生成减少17,18因此，不应将BALB/c小鼠用作C57BL/6小鼠背景下产生的转基因小鼠的对照。虽然整体安装可以洞察严重的发育缺陷，但可能还需要使用其他辅助技术评估乳腺的功能。

乳腺的主要功能是为幼崽生产和输送乳汁。这些过程不仅需要妊娠期间分泌管腔细胞的适当分化，还需要协调和有效地收缩肺泡周围和乳运输导管沿线的肌上皮细胞8牛奶产量和质量可以通过牛奶成分的分析评估进行评估12除其他外，给幼崽喂奶受损的原因更难评估。事实上，观察到的新生幼崽胃中缺乏乳汁可能与许多缺陷有关，例如产奶能力受损、幼崽无法哺乳、母亲的行为缺陷或排乳缺陷。如本文所述，评估乳汁从肺泡向导管的转运和排出缺陷的一种方法是使用催产素诱导肌上皮收缩。然而，由于催产素的影响，牛奶运输和排出的量化很困难体外快速（通常在暴露后1分钟内可以在导管中观察到牛奶），即使使用生理剂量较低的催产素10因此，使用此技术可能无法观察到两个小鼠系之间的排乳效率的微小差异。量化这种反应是困难的，但评估催产素引起的排乳的一种半定量方法是检查各种剂量下的反应，并确定用牛奶填充导管所需的治疗时间。在所有情况下，从最后一只幼崽哺乳到测试开始的等待期的一致性至关重要。为了更准确地量化泌乳或识别排乳缺陷，可以通过分别量化乳蛋白和信号通路，如β-酪蛋白和Stat5，或在体外催产素作用下的肌上皮细胞收缩19.

综上所述，转基因小鼠模型在研究乳腺功能和发育以及评估关键基因在这些过程中的作用方面具有重要而广泛的应用。乳腺上皮的结构可以很容易地在发育的各个阶段使用完整的支架在适当切除的腺体中观察到。虽然哺乳缺陷导致幼崽营养不良可能有多种原因，但泌乳不足可以通过催产素诱导的肌上皮细胞同步收缩来评估就地结合这两种技术（图4），可以对特定基因突变或缺失对乳腺发育和功能的影响提供重要见解。

披露

未声明利益冲突。

致谢

这些研究由CIHR和CBCRA向DWL提供的拨款资助。知识产权得到了来自加拿大人权研究所、加拿大人权研究所和加拿大人权研究所的研究金资助。MKGS由OGS和CIHR-STP奖学金资助。作者感谢凯文·巴尔在老鼠繁殖方面的帮助。

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