EDHF：传播内皮的影响

摘要

这篇评论的灵感来源于2009年夏季第一作者在爱丁堡BPS会议上发表的JR Vane演讲。它追踪我们对关键发现的观点以及对通常称为内皮衍生超极化因子或EDHF的途径的理解进展。因此，它可能不像许多评论那样包罗万象，但提供了过去20年左右该领域发展的更多个人观点。

30年过去了，直到大约1980年，内皮层才被认为是覆盖血管腔表面的惰性衬里，这一点似乎仍然很值得注意。与Teflon®很相似，内皮细胞（EC）被简单假设为呈现非黏性表面，使其能够将流动的血液与血管壁内膜下层的前聚集成分分离。这一观点随着Robert Furchgott在一篇开创性论文中发现内皮衍生舒张因子（EDRF）而发生了巨大变化(Furchgott和Zawadzki，1980年)这为后来获得1998年诺贝尔生理学或医学奖奠定了基础。该奖项授予了福奇戈特、路易斯·伊格纳罗（Louis Ignarro）和费里德·穆拉德（Ferid Murad），表彰他们“发现一氧化氮（NO）是心血管系统中的一种信号分子”。然而，正如我们将看到的，NO只是内皮调节平滑肌细胞（SMC）的几个关键过程之一，平滑肌细胞是大多数血管壁的主要部分。

当然，在我们意识到内皮细胞在控制血液循环中的分布和压力方面所起的关键作用之前，推测没有这一发现可能需要多长时间，这是很有趣的。很可能不会太久，因为在英国，John Vane、Salvador Moncada及其同事已经认识到内皮的积极作用。在20世纪70年代，他们发现，这种细胞单层的抗聚集特性反映了其制造新型花生四烯酸衍生物的能力，该衍生物也是一种有效的血管扩张剂。他们最初将这种短寿命的衍生物称为前列腺素X（PGX），尽管我们现在当然知道它是前列环素（PGI）₂). 这一发现对维恩以及伯格斯特伦和萨缪尔森获得1982年诺贝尔生理学或医学奖起到了重要作用。因此，1982年很可能被认为是第一次因发现内皮衍生介质而获得诺贝尔奖。事实上，到1990年，内皮的分泌活性已被充分认识到Anggard（1990）建议将其视为“体内最大的内分泌腺”。几年后，Vane在向英国皇家学会发表的Croonian演讲中明确表示，这是一个恰当的描述(叶片，1994). Vane的重要贡献，包括发现PGI₂最近，罗德·弗劳尔（Rod Flower）对其进行了优雅的评论，他是20世纪70年代令人兴奋的药理学发现时期的杰出同事之一(花，2006).

当然，药理学家非常感兴趣的是两种PGI的发现₂和EDRF，以及随后获得的两项诺贝尔奖，都依赖于John Gaddum爵士优雅开发的生物测定的经典药理学方法。他曾说过一句著名的话：“药理学家是一个“万事通”，他借鉴了生理学、生物化学、病理学、微生物学和统计学的知识，但他自己开发了一种技术，那就是生物测定技术……”(加杜姆，1964年). Vane非常巧妙地改编了Gaddum的“超融合”生物测试，以提供级联生物测试。精心挑选的组织分为两个系列，以便对直接从灌注器官流出的液体中提取的注射样品和/或活性成分进行平行分析(叶片，1964年). 这种方法首次发现了血栓素A₂随后，证明动脉微粒体可以代谢PGG₂一种既有血管扩张剂又有血小板抗聚集特性的不稳定产品。这是PGX，一旦结构被阐明，就被称为前列环素(惠塔克等., 1976). 不久之后，人们意识到血管合成的部位实际上是内皮(邦廷等., 1977;蒙卡达等., 1977;韦克斯勒等., 1977). 有关这些重大发现的更详细概述，请参见蒙卡达等. (1976)，格里格尔斯基等. (1976)和花（2006）.

当然，Furchgott对EDRF的发现也完全取决于生物测定的使用，或者更准确地说，取决于对他意想不到的数据的明智解释。在设计了一个实验方案来研究隔离主动脉环中β-肾上腺素受体诱发的舒张反应后，他的技术人员混淆了该方案。结果是毒蕈碱激动剂获得了强健的松弛。当时这是一个非常令人惊讶的结果，因为尽管毒蕈碱激动剂被称为有效的血管扩张剂体内、体外它们要么不影响血管制剂，要么导致血管收缩。Furchgott很快意识到缺乏扩张器的能力在体外与组织分离过程中内皮损伤相关。和Vane一样，他随后修改了生物测定技术，这一次将动脉条夹在一起，一条带内皮，一条不带内皮，以表明平滑肌对毒蕈碱激动剂的松弛是由于内皮释放了一种可扩散的扩张剂，他将其命名为EDRF。正如他们所说，剩下的就是历史。到1988年，EDRF已被确定为NO，NO作为一种贯穿全身的基本生物信号分子这一事实已得到广泛认可。

第三种内皮衍生扩张器：EDHF的发现

奇怪的是，日本的栗山研究小组已经表明，毒蕈碱刺激兔和豚鼠的动脉会引起血管收缩相关的血管超极化(栗山和铃木，1978年;北村和栗山，1979年). 在Furchgott发现内皮细胞是毒蕈碱激动剂的主要靶点后，Bolton表明平滑肌对卡巴胆碱的超极化也依赖于该单层细胞的完整性，并提示毒蕈碱刺激可能通过从内皮细胞释放因子而引起超极化(博尔顿等., 1984). Kuriyama报道的同步收缩作用等可以简单地解释为，在他们研究的物种中，毒蕈碱受体存在于内皮细胞上和血管平滑肌细胞，通过刺激两个受体群体产生主要的收缩反应。

综合考虑这些观察结果，产生了两个绝对基本的问题。首先，由于EDRF和超极化都起源于内皮，后者只是前者的一个方面吗？其次，平滑肌超极化在血管生理学方面有多重要；这仅仅是一种药理学上的好奇吗？

陈巧妙地回答了这两个问题等.，并于1987年在墨尔本的一次会议上首次发表，然后发表在一篇真正标志着EDHF领域开始的经典论文中(陈等., 1988). 为什么这篇论文如此具有开创性？因为通过使用微电极，他们能够首次直接证明内皮依赖性超极化与EDRF不同。到1987年，很明显EDRF实际上是NO或NO-released实体（参见Furchgott，1998年). 当时，可用于探测NO作用的药理学工具相当有限，尤其是NO合成酶尚未被鉴定（参见施密特等.，1988年a，b条;Bredt和Snyder，1990年;福斯特曼等., 1990)，所以这种酶的抑制剂在几年内仍然不可用(摩尔等., 1990;里斯等., 1990). 然而，亚甲基蓝（阻断鸟苷酸环化酶并清除NO）和血红蛋白（结合NO）是可用的(马丁等., 1985)大鼠主动脉和肺动脉内皮依赖性超极化均未发生改变。他们也没有沮丧⁸⁶Rb流出，K的标记⁺移动。相反，平滑肌松弛（去甲肾上腺素诱导的张力）被抑制了50%以上，而cGMP的积累被有效地消除。此外，吲哚美辛没有改变这些反应。不足为奇的是，主要结论是“这种超极化剂的性质表明它应该被命名为内皮衍生超极化因子（EDHF）。“尽管这项工作没有为离散因素提供任何证据就其本身而言，生物测定的使用再次被证明是至关重要的。费雷托和瓦努特（1988）据报道，内皮剥脱的小冠状动脉平滑肌超极化，但仅当这些动脉与内皮完整的股动脉段共同孵育时。此外，尽管这项研究没有表明超极化可能是由NO/EDRF以外的任何原因引起的，但它确实表明，超极化可以用哇巴因阻断。正如我们稍后讨论的那样，在某些动脉中发现Na⁺/K（K）⁺-ATP酶是K的靶点⁺充当EDHF。

While期间陈等. (1988)清楚地表明内皮依赖性超极化与EDRF的作用不同，后者强大且主要的血管舒张作用似乎与EDHF实际上是一个重要生理实体的可能性相矛盾。内皮细胞阐述的一种新型内源性松弛剂的概念已在年的一篇“当前意识”文章中提出药理学趋势通过泰勒和韦斯顿（1988）他们推测超极化可能通过关闭电压依赖性钙离子而导致血管扩张²⁺频道，'这一过程在非常依赖钙的小动脉中可能非常重要²⁺收缩时流入这证明是一个非常有见地的建议。在小阻力动脉中，氧合血红蛋白、吲哚美辛或硝基-L-精氨酸均不能降低ACh的超极化或舒张(加兰德和麦克弗森，1992年). 因此，超极化可以完全放松收缩前的阻力动脉。此时，使用Mulvany–Halpern钢丝肌电图仪可以尝试同时记录平滑肌膜电位和张力，因此可以在相同的实验条件下从单个动脉段生成数据，避免因肌肉细胞受到拉伸而产生任何差异，单独记录这些参数时的问题。

因此，EDHF现象被认为是血管平滑肌松弛，在环氧化酶和一氧化氮合酶抑制剂存在的情况下诱发（通常由内皮特异性激动剂ACh）。鉴于血管组织中微电极记录的相关技术困难，尽管在这一领域产生了相当多的文献，但绝大多数研究只是间接评估EDHF，这并不奇怪，通过测量收缩剂（如α-肾上腺素受体或血栓素受体激动剂）存在时的血管舒张。因此，尽管许多论文提到EDHF，但他们忽视了记录定义该通路的膜电位变化的根本重要性。所以实际上，大多数研究都没有调查超极化的后果，而是复极事实证明，在理解引发和传播内皮依赖性超极化的机制的复杂性时，这种区别至关重要。尽管首字母缩写EDHF已被广泛用于表示内皮依赖性超极化（EDH）现象，但在现阶段可能有必要指出，尤其是在较小的血管中，有很好的证据表明可能不一定涉及某一因素。因此，EDH实际上更准确地描述了血管扩张的关键途径。

电子商务SK_钙（K）_钙2.3）和IK_钙（K）_钙3.1）是EDH的基础

定义EDH途径的下一个主要步骤是发现超极化反应了两种类型K的激活⁺-通道，中小电导Ca²⁺-敏感K⁺通道（K_钙)–斯洛伐克_钙（K）_钙2.3）和IK_钙（K）_钙3.1）（命名如下亚力山大等., 2009). 此外，可能同样重要的是，这些通道被证明位于内皮细胞上，而不是作为可扩散内皮衍生因子或EDHF的平滑肌靶点。

尽管K⁺流出显然是EDHF反应的一个基本的、决定性的特征(陈等., 1988)，需要相当长的时间才能确定潜在的K⁺-频道。事后来看，很明显，这在很大程度上是因为两种类型的K⁺-涉及渠道。EDHF介导的反应很快被证明对格列本脲不敏感，不包括ATP-敏感K的作用⁺-通道（K_{列车自动防护系统}) (加兰德和麦克弗森，1992年;Plane and Garland，1993年). 电压门控K的关键作用⁺-通道（K_V（V）)也似乎极不可能，因为EDHF反应依赖于明显和持续的超极化。当EDHF-like松弛被证明对K不敏感时，这一点得到了证实_V（V）块(Adeagbo和Triggle，1993年). 然而，K_钙似乎确实起到了一定作用，因为非选择性阻断剂四丁基铵或特异性SK会降低舒张作用_钙（K）_钙2.3）通道阻滞剂apamin(Adeagbo和Triggle，1993年;霍尔茨曼等., 1994). 更进一步，通过同时记录超极化和弛豫，我们发现不仅阿帕明，而且河豚毒素略微降低了这两种反应。我们认为在那个阶段，河豚毒素一定是阻断了大电导率K_钙（黑色_钙：K_钙1.1）已知SMC上存在的信道，并推断这些数据表明SK的作用_钙和BK_钙频道。怀疑是平行信号，我们将这两种毒素联合使用，并首次获得EDHF超极化和相关弛豫阻滞(Waldron和Garland，1994年). 这被证明是一个具有开创性的观察结果。不久后由确认Zygmunt和Hograit（1996），世卫组织关键性地扩大了观察范围，以表明伊比利奥毒素不能替代河豚毒素。以及BK_钙已知，河豚毒素可以阻断K的中间形式_钙（IK）_钙：K_钙3.1）频道，因此似乎这些频道以及SK_钙通道参与EDHF反应。

人们通常错误地认为，这两种类型的K⁺-通道必须位于平滑肌上，因此受到内皮释放的可扩散EDHF的激活。当时，马克·纳尔逊和其他人的工作清楚地表明，血管平滑肌含有BK_钙我们能够用高浓度NO证明这一点，NO激活了BK_钙肠系膜动脉SMC中的通道。然而，我们找不到SK的证据_钙通道(Mistry和Garland，1998年a，b条;). 大约在这个时候，曼彻斯特的Gillian Edwards和Arthur Weston发表了一篇对EDHF领域的批判性评估，事后来看，这篇文章中提供的见解非常准确。尤其是有人建议，也许K_钙-通道实际上可能位于内皮细胞而不是SMC上。他们还建议K⁺通过这些通道的离子流出可能有助于激活肌肉Na⁺/K（K）⁺-ATP酶和/或内向整流K⁺-通道（K_红外)导致超极化，使K⁺难以捉摸的EDHF离子(爱德华兹和韦斯顿，1998年). 这段时间标志着我们两人（CJG和KAD）与曼彻斯特集团之间令人兴奋的合作的开始，并取得了一些重大成果。首先，直接从内皮细胞细胞就地发现ACh在这些细胞中引起超极化，这种反应可以被阿帕明和河豚毒素联合阻断。最简单的解释是K_钙驻留在EC上。当人们记住M时，这当然是有意义的_三毒蕈碱受体通过三磷酸肌醇（InsP_三)，因此能够提供激活Ca的信号²⁺-敏感，但对电压不敏感，K_钙因此，我们认为SK_钙和IK_钙我们和其他人后来证实，内皮细胞上存在通道，而不是SMC上。我们联合研究的第二个主要结果是提供直接证据表明，在这些通道流出后，K⁺充当EDHF(爱德华兹等., 1998).

K（K）⁺–体液EDHF

细胞外钾局部增加的概念⁺唤起血管舒张作用本身并不新颖。[K小幅增加⁺]_o个直接导致血管扩张道斯（1941）而且，在脑循环中，类似的增加被认为是神经活动和血液流动之间紧密联系的基础，这一点至少在一定程度上是罗伊和谢林顿于1890年首次定义的(罗伊和谢林顿，1890年;库辛斯基等., 1972). 加压冠状动脉和脑动脉中细胞外钾增加的观察结果解释了这一机制⁺<20 mM（总计）通过增加向内矫正K刺激平滑肌超极化和松弛⁺-通道（K_红外)电导和活化钠⁺/K（K）⁺-ATP酶(McCarron和Halpern，1990年;结等., 1996). 现在完全新颖的发现是K⁺从内皮细胞释放到动脉壁可以引起邻近平滑肌细胞的超极化，从而松弛。使用大鼠分离的肠系膜动脉和肝动脉，我们观察到平滑肌超极化和松弛到外源性钾⁺或EDHF（通过用ACh选择性刺激内皮而激活）与Ba联合使用具有相似的强度和抑制敏感性²⁺和哇巴因，用于阻挡K_红外通道和Na⁺/K（K）⁺-ATP酶。然而，与SMCs相比，EC对ACh的超极化对Ba不敏感²⁺和哇巴因(图1). 这一观察表明，K的释放⁺通过SK_钙和IK_钙通道激活了K_红外通道和Na⁺/K（K）⁺-ATP酶引起超极化。此外，在ACh的EC刺激过程中⁺-插入内皮-平滑肌界面附近的选择性电极记录到[K增加⁺]_o个约10mM。该增加足以解释所测量的EDHF超极化和弛豫(爱德华兹等., 1998). 然而，尽管这些观察结果很重要，但并非所有事情都一目了然。本研究中使用的小动脉是大鼠肝动脉和肠系膜动脉，而前者的EDHF反应被Ba阻断²⁺在后者中，一个重要成分持续存在。当时，我们得出结论，持续性舒张反应一定是另一条途径，并建议内皮细胞和SMC之间的肌内皮缝隙连接（MEGJ）可能是原因。我们随后证明了这一点，事实上是这样的，接下来将讨论这项工作(马瑟等., 2005).

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图1

注射ACh（10µM）和K后刺穿内皮细胞的超极化⁺（5 mM）。钡（30µM）与块K的组合_红外通道）和哇巴因（1 mM，抑制Na⁺/K（K）⁺-ATP酶）对K的完全阻断超极化⁺，但不适用于ACh。在单独的实验中，这种组合阻断了平滑肌细胞对ACh的超极化（未显示）。K系列_钙通道阻滞剂charybodotoxin（ChTx；100 nM）和apamin（100 nM。首次发表于爱德华兹等. (1998).

内皮衍生钾的概念⁺作为一种超极化因子，随后在包括人类动脉在内的一系列物种和地点的动脉研究中得到了支持(克里斯索波利斯等., 2000;麦奎尔等., 2002;布塞梅可等., 2003;内利等., 2003;麦克内什等., 2005). 然而，情况并非立即如此。根据中的初步建议爱德华兹等. (1998)，许多实验室无法通过升高[K来复制动脉舒张⁺]_o个，如果该离子真的是内生超极化因子，这当然是绝对要求(爱德华兹等., 1999;2000;奎格纳德等., 1999). 至关重要的是，这种未能引起[K的血管舒张⁺]_o个包括大鼠肠系膜阻力动脉(Doughty（勇敢）等., 2000;蕾丝等., 2000)，其中一个容器用于爱德华兹等.（1998年）以及颈内动脉和小冠状动脉。在后者中，EDHF反应似乎主要通过MEGJ介导，而在使用肠系膜动脉的研究中，实验设计中忽略了功能或生理对抗的重要概念。

后一点通过检测升高[K⁺]_o个用苯肾上腺素亚最大或最大刺激大鼠肠系膜小动脉，使其松弛和复极。使用的肠系膜动脉没有自发形成张力，因此为了研究超极化（或更准确地说是复极）和由此产生的松弛，α₁-在K之前使用肾上腺素受体激动剂⁺，引起平滑肌去极化和收缩。随着苯肾上腺素浓度接近最大值，复极和弛豫至[K⁺]_o个已被阻止(多拉和加兰，2001年). 原因很简单，肌肉α受到刺激₁-肾上腺素受体增加了钾的流出⁺通过iberiotoxin敏感型BK_钙通道，结果是K⁺积聚在细胞外空间并使钠饱和⁺/K（K）⁺-ATP酶活性。这种饱和度有效地阻止了对任何额外（外源）钾的反应⁺离子。当平滑肌流出减少时，在伊比利奥毒素的存在下，功能性拮抗作用被消除，外源性K⁺离子再次能够引起复极/超极化和舒张，或在加压动脉中增加直径(多拉等., 2002). 钾的细胞外积累⁺在平滑肌刺激后形成生理对抗的物质称为“K”⁺-Edwards和Weston的《云》(韦斯顿等., 2002).

缝隙连接–肌肉和内皮之间的物理连接

与K同时⁺故事正在发展，加的夫的Tudor Griffith小组提出，通过MEGJ的电耦合可以解释兔髂动脉中的一氧化氮依赖性、内皮依赖性舒张(泰勒等., 1998). 尽管此前有人认为缝隙连接抑制剂氟烷和1-庚醇对EDHF的反应没有影响(齐格蒙特和霍格雷特，1996年). 多年来，人们已经认识到血管壁细胞之间存在缝隙连接(罗丹，1967年)缝隙连接作为实现ACh血管扩张的一种手段，在微循环的小动脉中起着关键作用Segal和Duling（1989）该组随后使用细胞内微电极直接证明平滑肌和内皮细胞之间存在紧密的电耦合，表明这种耦合使超极化沿着小动脉扩散并影响扩张(夏等1995年). 此外，他们确定连接蛋白40和43（Cx40和Cx43）是缝隙连接的组成部分(小等., 1995).

这种间隙连接可以支持EDHF反应，这得到了小动脉全细胞膜片钳实验的支持。这表明ACh在完整血管内皮中产生的超极化在这些细胞和相邻SMC中完全相同(山本等., 1999). 然而，在用18β-甘草次酸阻断缝隙连接后，ACh只在内皮细胞中诱导外向电流。此外，清除细胞外钙²⁺或添加河豚毒素降低EC超极化，支持平滑肌超极化纯粹是间接的这一说法。然而，缝隙连接的功能意义，就像K⁺，似乎在不同的动脉之间有所不同，并且在每种准备中都不明显(贝尼和沙德，2000年). 一种可能性是，随着血管尺寸的减小，MEGJ的功能作用可能会变得更加重要。如果这是真的，那么可以解释这样一个事实，即随着动脉直径的减小，EDHF引起的舒张作用的重要性增加(加兰德等., 1995;岛川等., 1996).

这一假设得到了一项形态学研究的大力支持，该研究试图量化大鼠肠系膜动脉床中的肌肉-内皮和内皮-内皮缝隙连接。MEGJ确实存在于该动脉中，直径<100 nm，与内皮细胞之间的同细胞间隙连接相比较小。重要的是，与肠系膜动脉床的近端区域相比，远端区域也出现了更多的细胞。这些观察结果当然与随着动脉尺寸减小而变得越来越重要的功能作用相一致(桑德和希尔，2000年). 内皮细胞之间较大的缝隙连接明显为五层结构，广泛分布于肠系膜动脉床。这些观察结果并没有延伸到其他床层，以确认或不确认一般原理，这可能在很大程度上是因为这类研究极其费力。然而，桑德等. (2004)确实表明，随着大鼠成年，其隐动脉中MEGJ的发生率下降，并且这种下降伴随着对ACh的EDHF依赖性舒张功能的丧失。同样，证据与MEGJ的重要功能作用相一致。

MEGJ表现为两种相邻细胞类型的膜增厚，在这两种细胞类型之间紧密并列(罗丹，1967年). 在大鼠中，它们发生在穿过内部弹性层（IEL；图2)虽然不是所有的投影都有交叉点(桑德和希尔，2000年). 顺便说一句，在早期EDRF研究中，可能正是这种锚定使得从灌注的大鼠动脉床上去除内皮变得如此困难，有效去除内皮需要使用两种洗涤剂中的任何一种(Randall和Hiley，1988年)，一个气泡(阿特金森等., 1994)或金黄色葡萄球菌α-毒素(拉埃尔等1995年)物理上破坏细胞，而不是胶原酶简单地将其从血管壁上清除，就像在小兔子血管中一样(福奇戈特等1987年). 间隙连接由位于连接细胞膜中的连接蛋白形成，这些蛋白具有四个跨膜结构域，它们作为六聚体聚集在一起，在每个连接细胞中组成一个半通道（连接外显子）（见约翰斯通等., 2009). 在脉管系统中，连接子可以由Cx37、Cx40、Cx43和/或Cx45形成，这个数字表示蛋白质的分子量。有关EDH中缝隙连接的详细概述，请读者参阅最近的一篇综述(德维特和格里菲斯，2010年).

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图2

动脉内皮细胞的共焦显微照片。荧光钙²⁺指示物俄勒冈州绿488 BAPTA-1被加载到受压大鼠肠系膜动脉的内皮细胞（绿色）中。通过z轴的连续图像可以对动脉壁（顶部）进行三维重建，其中明亮的EC投影清晰可见。框架主刻度20µm。在用Alexa 633酰肼对内部弹性层（IEL，灰度）进行可视化后，在IEL（下面板）的EC和平滑肌细胞（SMC）侧收集到的单个图像平面相距2µm，显示投影向SMC传递（箭头）。这些突起是肌内皮细胞缝隙连接可能形成的部位。注意，并非所有孔洞都与EC染色有关（星号）（P.Yarova，未解释数据）。

MEGJ参与EDHF响应，无论是否轻微，当然消除了对扩散因素的绝对依赖这个潜在机制。因此，如前所述，由于超极化是在内皮细胞中启动的，因此对这种血管扩张途径的更准确和最新描述是EDH而不是EDHF。要解开间隙连接在EDH扩张中的功能作用，并确定单个连接蛋白是否可互换，或者是否在其可能作出的任何贡献中受到限制，这一点并不容易。这主要是因为可用于解偶联缝隙连接的药理学工具总是具有其他作用。如前所述，Cx40在血管缝隙连接中似乎很重要，并被假设在EDHF介导的MEGJ中发挥作用。为了探讨潜在的功能作用，我们开发了一种技术，用抗体（通过胞饮作用）选择性地在细胞内加载加压阻力动脉的内皮细胞。使用这种方法，我们发现抗Cx40抗体阻止EDHF扩张，但仅限于对苯肾上腺素进行强健预收缩的动脉，足以阻止K的平行作用⁺作为EDHF(马瑟等., 2005). 在类似条件下，针对Cx40细胞内羧基末端区域（残基340–358）的抗体或针对细胞质环的模拟肽（Cx40；残基130–140）在这方面均有效(图3). 然而，针对Cx37或Cx43细胞内区域的抗体，或Cx37细胞内环路区域的模拟肽，是不活跃的。同时用靶向EC连接蛋白胞外区域的抑制肽（43Gap 26、40Gap 27和37,43Gap 27）对动脉进行腔内和体外孵育也未能改变EDHF反应。事实上，Cx40的功能重要性得到了加强，因为它实际上可以在EC投影的末端被可视化（通过免疫组织化学）。

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图3

针对连接蛋白40（Cx40 Ab）的抗体可以抑制内皮依赖性超极化介导的扩张反应。将Cx40 Abs加载到受压大鼠肠系膜动脉的内皮细胞中，并通过EC-EC和肌内皮缝隙连接处表达的Cx40抑制细胞-细胞耦合。只有当用于产生音调的苯肾上腺素（PE）的浓度高时，才观察到对ACh的作用。这可能是由于真正的内皮依赖性超极化因子（如K）的能力⁺通过平滑肌细胞（SMC）Na独立地进行电耦合⁺/K（K）⁺-ATP酶。在高浓度下，PE激活BK_钙-可以阻止Na进一步活化的通道⁺/K（K）⁺-ATP酶，可能由“K”引起⁺云”。修改自马瑟等. (2005).IEL，内部弹性薄板。

总的来说，我们的数据描述了EDH介导的扩张机制，即内皮细胞产生的超极化沿着两条路径发散，一条由K介导⁺外排和其他通过MEGJ对肌肉进行超极化，严重累及Cx40。在经历次最大收缩的动脉中，这两种途径都有助于扩张，但随着收缩加剧，细胞外钾的“密度”也会增加⁺云。结果是K的能力受阻⁺通过使其靶效应器饱和，内皮释放出EDHF。此时，仅MEGJ维持EDH血管扩张。因此，这两条通路共同解释了肠系膜动脉中的“EDHF”反应。

差分激活和IK_钙内皮膜微域概念的发展

有趣的是，也许非常重要的是，EC SK的个人贡献_钙和IK_钙通往EDH的通道可能会有所不同。尽管这两个K⁺-当然，在分离的肠系膜动脉中，通道是EDH的中枢，同时测量张力和膜电位显示SK_钙仅通道负责超极化（约为−55 mV）(图4). 然而，来自IK的输入_钙一旦用苯肾上腺素刺激动脉，通道也会变得明显，苯肾上腺素用于产生引起内皮依赖性舒张所必需的（去极化和）收缩(起重机等., 2003). K的选择性差异活化_钙通道可能由细胞内钙来解释²⁺两种通道类型和/或胞浆钙通道的敏感性²⁺或者可能反映了每种情况下的单独和不同的亚细胞定位。显然，在内皮细胞内存在一些信号分化，因为，例如，尽管NO合成酶和K_钙通道被钙激活²⁺，并非所有诱导内皮依赖性舒张的药物都能激活NO和EDHF介导的舒张：这些药物包括异常的大麻二酚和病毒胺，它们作用于内皮中大麻类药物的受体(Ho和Hiley，2003年;2004;).

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图4

SK的角色_钙内皮依赖性超极化反应中的通道依赖于细胞外钙²⁺浓度。在大鼠肠系膜动脉中，SK_钙（K）_钙2.3）通道在内皮细胞（EC）边界高度表达，在一定程度上，在EC通过内部弹性层（IEL）的投影中。相反，IK_钙（K）_钙3.1）通道似乎局限于EC投影微域（顶面板）。细胞外[Ca对ACh的超极化作用²⁺]保持在2.5 mM时被apamin（中间面板）完全阻断，但当细胞外Ca²⁺减至1 mM（底部面板）。修改自起重机等. (2003);多拉等. (2008)SMC，平滑肌细胞。

就大鼠肠系膜小动脉的EDH而言，差异激活与IK的限制有关_钙（K）_钙3.1）通向内皮投射物的通道，即穿过IEL孔的投射物朝向平滑肌。与K形成鲜明对比_钙3.1，斯洛伐克_钙（K）_钙2.3）通道分布在整个EC膜上，但在相对较大的EC–EC缝隙连接附近观察到特别高的浓度(桑德等., 2006;多拉等., 2008) (图4). 此外，与K形成鲜明对比_钙3.1，K_钙2.3通道位于caveolae(阿布西等., 2007). K的浓度_钙3.1内皮投射物中的通道似乎是复杂信号微域的一部分，因为投射物及其附近也含有高水平的钠⁺/K（K）⁺-ATP酶和Cx37和Cx40是MEGJ的组成部分(马瑟等., 2005;多拉等2008年). 但真正的复杂性可能要高得多。例如，脑动脉内的内皮细胞投射物含有瞬时受体电位（TRP）A1、钙²⁺-可渗透的、非选择性的阳离子通道，通过亲电化合物（如刺激物丙烯醛和芥末油）激活以产生EDH(厄利等., 2009). 另一方面，在肠系膜动脉中，钙感应受体（CaSR）与钾共同定位_钙3.1小窝外的河道(阿布西等., 2007;萨利兹等., 2008).

小窝是覆盖整个细胞表面的烧瓶状凹痕（或洞穴）。它们用于锚定蛋白质，包括G蛋白偶联受体和其他受体（如InsP_三，受体），含K等蛋白质_钙2.3、TRPC1和TRPV4信道(洛克威奇等., 2000)从而形成高度有序的信号微域(Rath公司等., 2009;Chidlow和Sessa，2010年). 它们似乎对EDH介导的血管扩张至关重要，因为在小窝蛋白-1基因缺失的小鼠中不存在扩张。该缺陷与TRPV4活性有关，而不是与K的任何直接影响有关_钙渠道，尽管后者未进行评估(萨利兹等., 2008). 有趣的是，这种特殊的基因敲除也降低了Cx40、Cx43和Cx37的表达，这表明缝隙连接的形成可能受到影响，从而导致血管壁内电事件的整合（见下文）。

K的限制_钙3.1相对狭窄的EC投射通道可能阻碍EC细胞质钙的进入²⁺通道激活所必需的，同时可能促进来自平滑肌的激活信号。为了研究这种可能性，我们拍摄了[Ca²⁺]_我肠系膜动脉EC投影内的变化安装在钢丝肌电图上，但我们无法解决[Ca²⁺]_我用ACh刺激EC后和用苯肾上腺素同时刺激平滑肌期间增加(多拉等., 2008). 内皮细胞显示自发钙²⁺事件，这些被称为“脉冲星”。有趣的是，它们似乎与EC预测一致，而K_钙3.1通道被这些自发事件基本激活，抑制平滑肌膜电位约8mV_钙3.1通道，InsP_三-敏感Ca²⁺存储也集中在投影中，ACh刺激脉冲星频率大约增加2.5倍(勒杜（Ledoux）等2008年).

虽然诱发[Ca似乎没有差异²⁺]_我在没有或存在苯肾上腺素的情况下用ACh刺激时，IK_钙-介导的超极化可以与SK引起的超极化一起检测到_钙，如果细胞外[Ca²⁺]_o个从2.5 mM降至1 mM(图4). 此外，IK的正常招募_钙当苯肾上腺素刺激平滑肌时，如果Ca²⁺电压依赖性钙减少了肌肉的进入²⁺通道阻滞剂(多拉等., 2008). 因此，[Ca的局域动力学²⁺]_o个在细胞间隙中，围绕EC投射，可能是EDH产生和传播的基本生理控制机制。这一机制可能与Arthur Weston及其同事显示的CaSR有关，CaSR位于内皮内，最重要的是位于小凹外，与K密切相关_钙3.1通道(韦斯顿等., 2005). 这些受体对[Ca的变化作出反应²⁺]_o个在生理范围内，并链接以激活IK_钙通道(韦斯顿等., 2005)引起血管舒张(奥哈尼亚语等., 2005). 最后，IK_钙通道也受cAMP控制，因为forskolin通过这些通道抑制超极化(多拉等., 2008).

EC K是否_钙优先联系到单独的血管扩张机制？

EDH是由两种K的活性产生的_钙通道，以及大鼠肠系膜小动脉中的通道，K_钙3.1仅在EC投影上发现通道，增加了EDH通过K向肌肉传输的可能性⁺或MEGJ可能链接到一种类型的K_钙频道。情况似乎就是这样。与卡雷诺酮引起的IK解耦合间隙连接_钙只有渠道才是EDH的基础。此外，随后的血管舒张可被哇巴因抑制，这表明IK_钙通道活性可能是通过细胞外钾的变化联系在一起的⁺浓度，以激活平滑肌Na⁺/K（K）⁺-ATP酶。另一方面，SK_钙-出现介导超极化主要地通过MEGJ影响松弛，并涉及K的优先激活_红外频道。使用SK选择性激活剂_钙通道，N-环己基-N-[2-（3,5-二甲基-吡唑-1-基）-6-甲基-4-嘧啶，韦斯顿等. (2010)证明该药物诱发的超极化被阿帕明或钡阻断²⁺因此与这一建议是一致的。

其他涉及超极化的内皮依赖性途径

在发现“EDHF”后的几年里，许多候选分子被认为是可扩散的EDHF。最近的审查(爱德华兹等., 2010)总结了主要候选药物，并强调了一个关键点：大多数药物对阿帕明和河豚毒素（或TRAM-34）的联合阻断不敏感，对靶向平滑肌K的药物始终敏感⁺-频道。例如，环氧琥珀酸（EET）(坎贝尔等., 1996)激活平滑肌BK_钙通道和NO主要通过K起作用_{列车自动防护系统}通道(皮重等., 1990;加兰德和麦克弗森，1992年). EET在EDHF血管舒张中的作用尤其受到了相当多的研究，读者可通过以下途径查阅该文献的广泛和最新综述坎贝尔和弗莱明（2010）2010年审查G.Edwards、M.Félétou和A.Weston提出了超极化路径的有用分类，或者更常见的EDH-like弛豫，将其定义为经典或非经典。前者对阿帕明和TRAM-34的阻断敏感，而对阿帕敏和伊比利奥毒素的阻断耐药。非经典组描述了EDHF因子，并在特定情况下引起或促进平滑肌超极化中发挥作用(爱德华兹等., 2010). 非经典基团不排除通过EC投影微域发出信号，对于一些更疏水的EDHF，这实际上可能对减少扩散距离至关重要。

传播影响：进行血管扩张

到目前为止，我们主要关注起源于内皮细胞的超极化（或EDH），该内皮细胞放射状进入动脉壁，引起血管扩张。然而，超极化也可以更普遍地通过动脉壁移动，以影响August Krogh首次描述的反应(克罗格，1920年)如扩张或进行血管扩张。除了内皮细胞外，超极化当然可以通过不依赖于SK的机制直接在平滑肌中启动_钙或IK_钙.通道无论是起源于平滑肌还是内皮，超极化都可以轴向扩散，引起血管舒张。因此，它能够将局部扩张转化为更广泛的血管阻力下降，这是增加血流所必需的。为了使药物能够显著增加组织血流量，动脉直径的任何增加都必须显著降低血管阻力。如果扩张只发生在局部，则不太可能发生这种情况，因为阻力在一定程度上是血管长度的函数。然而，如果扩张也能向上游扩散，则随后会出现显著的血流增加(库尔加卡和西格尔，1995年;多拉等., 2000).

传导性血管扩张在微循环中的研究最为广泛，微循环中开放钾的激动剂之间似乎存在相关性⁺-渠道和可靠引发扩张的能力(德拉肖和杜林，1991年). 因此，扩张的信号被认为仅仅反映了电流向邻近细胞的传递，也就是说，细胞没有受到激动剂的直接刺激(多拉等., 2000;艾默生和西格尔，2000年). 通路可以沿血管长度双向发生，是动脉壁固有的。此外，它依赖于内皮，不依赖于神经或血流变化(德拉肖和杜林，1991年;里弗斯，1997年;多拉等., 2000;艾默生和西格尔，2000年;西格尔，2005年;温特和多拉，2007年). 体外微血管床的研究就地(多拉等., 2000)和从这些血管床分离出来的小动脉，使用内皮依赖性激动剂ACh，在使用微移液管将其应用于小动脉外部后，引发强烈的反应。

在骨骼肌中，大动脉也发生扩张或上升扩张(希尔顿，1959年)我们最近证明，它也可以在小阻力动脉中持续存在，例如大鼠肠系膜动脉，该动脉有三到五层肌肉，这表明该现象与整个血管系统相关(高野等., 2004;温特和多拉，2007年).

内皮在扩张中的重要性

定向有利于内皮细胞作为超极化扩散的管道：它们沿血管主轴排列，而肌肉细胞呈圆形排列。事实似乎确实如此，因为激活了K_{列车自动防护系统}仅限于大鼠肠系膜动脉中SMC的通道(怀特和希利，2000年;高野等., 2004;多拉等2008年)表明SMC之间的耦合不足以使膨胀扩展到长距离(高野等., 2004)其次，内皮是电耦合的管道(哈斯和杜灵，1997年;山本等., 1999;艾默生和西格尔，2000年;温特和多拉，2007年). 引发超极化的方式对确定随后的扩散并不重要，只在启动细胞-细胞耦合时，因为内皮细胞或平滑肌K的激活⁺-通道导致此响应。然而，一些激动剂可能刺激额外的信号通路，这些通路可能会增强（例如通过cAMP；波普等., 2002)或减少（例如通过α₁-肾上腺素受体刺激，蛋白激酶C；豪格等., 2003;包等., 2004)超极化在血管细胞之间传播的能力。

腔内灌注激动剂后扩张

循环血管活性激动剂在区域血流的生理控制中起着至关重要的作用，但值得注意的是，在研究血管反应性时，只有极少数研究试图将激动剂应用于动脉腔内。当然，在探索具有相反作用的激动剂通过内皮细胞和对SMC的作用机制时，考虑到谷氨酸外激动剂与谷氨酸内激动剂的应用是至关重要的，例如嘌呤能（如ATP）和肾上腺素能（如肾上腺素）激动剂。我们通过开发一种新的方法来解决这个问题，该方法使用隔离和加压的小动脉。通过三根小动脉插管（将第三根插管插入侧支），可以将激动剂注入受限的下游区域。这样，任何引起的扩张都可以很容易地量化，因为它逆腔内液体流动的方向向上游扩散。使用这种方法，显示ATP或UTP的腔内灌注可刺激局部扩张和扩张(温特和多拉，2007年). 由于所有可用的证据都与内皮的重要作用相一致，在使这种血管反应得到有效协调的过程中，单层中的任何功能障碍，例如在糖尿病、肥胖和高血压等情况下，都将显著破坏血管控制局部组织灌注的能力。

什么机制维持扩张：另一个信号电路？

由于扩张似乎完全依赖于膜超极化，任何能够刺激超极化的激动剂都可能引起这种反应。传播将依赖于同源和异源细胞间隙连接来实现必要的电流传播。所以一个关键问题是，通过动脉壁细胞之间的电流是被动衰减的，还是存在维持扩张的放大机制。孤立的加压动脉中的可用证据支持未定义的放大过程，因为电流的传播似乎比被动衰减预测的要远。这在仓鼠套管牵开器小动脉（一至两层平滑肌）中得到了很好的证明，其中注入电流的衰减比ACh超极化的衰减快，尽管事实上两者都诱导了类似的局部（起始）超极化（长度常数分别为1.2和1.9 mm；艾默生等., 2002). 因此，电流通过缝隙连接的细胞间传播似乎在某种程度上得以维持。在这个反应中出现的一个离子通道是K_红外(河流等., 2001;转到等., 2004;詹茨等., 2006). 然而，该渠道似乎不太可能发挥广泛作用，因为Ba²⁺（抑制K_红外通道）对大鼠肠系膜动脉中ACh或levcromakalim的扩张无影响(高野等2004年). 然而，Na⁺/K（K）⁺-细胞外[K适度增加激活的ATP酶⁺] (爱德华兹等., 1998)可能会起到一些作用。这增加了释放K的可能性⁺在超极化过程中，可能作为一种放大机制，与其作为EDHF的作用明显平行(爱德华兹等., 1998). 这由K的表达式支持_红外和K_钙2.3出口信贷机构边界的渠道(多拉等., 2008)，位于与EC间隙连接相似的位置(碱水等., 2004;温特和多拉，2007年). ATP酶的一种亚型也很可能在这个空间内表达。因此，释放K⁺通过这些通道中的任何一个都可以作用于相邻的通道、泵和/或细胞以放大超极化。

此外，还有其他候选人可能与K一起行动或与K并行行动⁺鉴于NO在血管功能中的核心重要性，NO可能发挥作用(布德尔等., 2003;乌伦霍尔特等., 2007)虽然抑制NO合成酶似乎不会减少扩张(上好佳等., 2001;多梅耶和西格尔，2007年;温特和多拉，2007年). 我们之前已经证明EC[Ca²⁺]_o个不会检测到响应本地(麦克谢里等., 2005;2006;) 或传播(高野等., 2004)大鼠肠系膜动脉或cremastic动脉的超极化。然而，最近的证据表明，色调的存在可以揭示可检测的、缓慢的、传导的细胞间钙²⁺波浪，两者在体外(乌伦霍尔特等., 2007)和体内(塔利尼等., 2007)，尽管需要注意的是，这种波并不是超极化和相关扩张快速传播的必要条件(高野等., 2004;塔利尼等., 2007).

疾病中的EDHF

很明显，EDH是血管系统的一个重要调节机制，并且EC功能障碍似乎是心血管疾病的早期特征(范胡特等., 2009)问题是超极化反应的参与程度。虽然NO信号在疾病中的作用已被广泛研究，但关于心血管疾病或血管损伤对EDH的影响的数据较少。然而，改变EC-SK的表达水平_钙转基因模型（SK3T/T）中的通道清楚地表明，这些内皮细胞通道的减少或增加会引起血压的相应变化(泰勒等., 2003). 这些观察结果被涉及靶向删除K的研究所扩展_钙3.1通道，以及K_钙3.1/SK3通道双敲除动物，显示平均动脉血压显著升高(硅等., 2006;布拉勒等., 2009). 因此，这些通道的开放可能代表了一种治疗高血压的新方法(格里奇等., 2009). 最近，电生理研究表明，通过基于小窝的SK超极化_钙12至16周龄自发性高血压大鼠肠系膜动脉的通道激活受到抑制，而IK_钙通道通路没有改变(韦斯顿等., 2010). 然而，尽管超极化与IK相关_钙在这个年龄段，通道激活没有降低，似乎通道蛋白水平在下降。因此，从长远来看，通过这个EC通道的超极化也可能被破坏。显然，需要更多的研究来确定心血管疾病和一系列疾病模型中EDH改变的程度和方式。

结论

自20世纪80年代发现EDHF以来，在确定引起EC超极化（EDH）的基本机制方面取得了明确和持续的进展。我们对EDH如何径向转移到邻近的平滑肌，并沿动脉轴向转移以引起远处血管舒张的理解也同样增加了。这些反应共同起到整合组织血流变化的作用。也许这一过程中最重要的关键步骤是认识到超极化是由SK的激活引起的_钙和IK_钙这两种通道类型都存在于内皮细胞中，但位于不同的微区内。未来的挑战将是解开这些膜微结构域的复杂性和局部调控，并展示它们如何被疾病破坏，并可能被调节以改善或维持生理功能。

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