ALS相关蛋白FUS和TDP-43共同作用影响果蝇属运动与寿命

caz突变体成虫的运动能力和寿命降低，而fALS FUS无法挽救这种现象。

我们接下来检查了加利福尼亚州¹存活到成年的突变雄性。从外表上看，这些突变体有轻微的粗糙的眼睛缺陷、异常的生殖器以及鬃毛和翼静脉组织的缺陷，所有这些都被加利福尼亚州基因组转基因（数据未显示）。值得注意的是，它们在运动方面也有缺陷。大多数加利福尼亚州变种人不能飞行，与对照组相比，他们行走缓慢，经常摔倒，并且难以直立（见补充视频1和2）。我们通过两次化验来量化这种缺陷。首先，我们使用负地轴分析来测试攀爬能力。在这种范式中，加利福尼亚州突变体减少了55.9%(对与对照组相比，攀爬能力低于0.001），而对照组完全被Caz基因组转基因挽救（补充图2A）。其次，我们使用定量视频跟踪来测量加利福尼亚州突变体和对照（图​（图1，1，E和G），并观察到67.6%的相对减少(对<0.001）运动速度加利福尼亚州也被Caz基因组转基因完全拯救的突变体（图​（图1G）。1G） ●●●●。当我们仅在神经元中恢复Caz时加利福尼亚州突变体我们可以提高82%的运动速度(对<0.001）以上加利福尼亚州仅突变体（图​（图1G），1G） 但这些动物仍明显慢于对照组或用基因组Caz挽救的动物，这表明Caz的非神经元表达也有助于提高运动速度。接下来我们进行了测试，以确定hFUS是否可以进行救援加利福尼亚州变异的运动。野生型hFUS在加利福尼亚州突变体神经元使运动速度提高75%(对<0.001），与转基因Caz的抢救没有显著差异（图​（图1G）。1G） ●●●●。然而，相反，hFUS的表达^522G兰特在里面加利福尼亚州突变体神经元的运动速度没有明显改善卡兹突变体（图​（图1G）。1G） ●●●●。hFUS的表达^第525页确实提高了的运动速度加利福尼亚州突变体显著，但这些动物仍占23.6%(对<0.05）比野生型hFUS拯救的突变体慢（图​（图1G）。1G） ●●●●。对照动物神经元中野生型或突变型hFUS的过度表达对运动没有显著影响（补充图2B）。这些结果表明，与羽化期间对FUS的需求不同，人类FUS的fALS突变亚型在一种对正常运动至关重要的活动中存在缺陷果蝇属.

我们进一步观察到加利福尼亚州突变雄蝇的寿命比对照雄蝇短（图​（图1H）。1H） ●●●●。对照雄性的平均寿命为53天，而加利福尼亚州突变体平均寿命为23天，减少了57%(对< 0.001). Caz基因组转基因完全恢复了加利福尼亚州突变体达到对照水平（补充图2C），转基因Caz或hFUS的神经元表达也是如此（图​（图1H）。1H） ●●●●。相反，hFUS的表达^522G兰特或hFUS^第525页在里面加利福尼亚州突变体并没有显著恢复中位寿命，尽管最大寿命增加了（图​（图1H）。1H） ●●●●。对照动物中Caz或hFUS转基因的过度表达对寿命没有影响（补充图2D）。因此，正如在运动中发现的那样，fALS突变体FUS蛋白缺乏维持寿命所需的活性果蝇属.我们检查了25日龄婴儿的脑组织加利福尼亚州突变体和对照组的神经元丢失证据（补充图2E），未观察到空泡化或其他广泛神经元死亡的证据。有趣的是，fALS突变体人类SOD1在果蝇属也可以抑制运动而不会导致神经元丢失(20).

tbph突变体的表型与caz突变体相似。

这个果蝇属TDP-43的同源物TBPH仅在神经元中表达(15,16)和的蛋白全突变tbph（待定）可以活到成年（参考。21和补充图3G）。我们检测了tbph（待定）将其与加利福尼亚州突变体。与caz突变体不同，我们没有观察到成人眼睛、翅膀或生殖器发育缺陷tbph（待定）突变体。当我们研究tbph（待定）突变体，我们发现只有19.4%(对<0.001）第页，共页tpbh公司与对照组相比，突变体存活到成年（图​（图2A）。2A） ●●●●。这一缺陷通过两种转基因的表达得以完全修复果蝇属TPBH或人类TDP-43（hTDP-43）在tbph（待定）突变体。我们还检测了成年人的运动速度每小时突变体（图​（图2，2、B和C）。与对照组相比，tbph（待定）突变体占88.4%(对<0.001）运动速度降低，TBPH或hTDP-43的神经元表达也能完全缓解。最后，我们检查了这些突变体的寿命（图​（图2D）。2D） ●●●●。我们发现tbph（待定）突变株平均4天(对<0.001）也通过TBPH或hTDP-43的神经元表达恢复到控制水平。因此，与之前的研究一致(21)，我们发现tbph（待定）突变体，与加利福尼亚州突变体具有相似但数量上更严重的羽化、成虫运动和寿命表型。

在单独的窗口中打开

图2

加利福尼亚州和tbph（待定）是遗传途径的成员。

(A类)所示基因型雄性幼虫羽化产成虫的百分比(n个> 100). 这个tbph（待定）^–/–基因型是tbph（待定）^∆23/Df[2R]BSC660.+表示UAS-TBPH、UAS-TDP-43或UAS-Caz与C155-Gal4的神经元表达。(B类)1日龄雄性对照果蝇的10条60秒成年运动叠加路径的代表性图像，tbph（待定）突变，或加利福尼亚州¹单独或表达UAS-Caz或UAS-TBPH的突变体。(C)60秒试验中指定基因型1日龄成年雄性苍蝇的行走速度(n个> 30). (D类)指定基因型成年雄性苍蝇的存活率(n个> 100). 误差条代表SEM***对< 0.001.

caz和tbph是神经元中常见的遗传途径的组成部分。

为了确定加利福尼亚州和tbph（待定），我们试图进行交叉救援tbph（待定）或加利福尼亚州另一个基因的过度表达导致的突变。首先，我们在小鼠的神经系统中表达了转基因TPBH加利福尼亚州并检测了羽化率、成虫运动速度和寿命。TBPH在中的表达加利福尼亚州与对照组相比，突变体对这些指标没有任何影响加利福尼亚州单独的突变体（图​（图2，2，A–D）。接下来我们在tbph（待定）突变体。令人惊讶的是，Caz在tbph（待定）突变体将其羽化频率恢复到与TBPH表达所达到的水平没有显著差异的水平（图​（图2A）。2A） ●●●●。Caz过度表达tpbh公司突变体也使成人的运动速度增加了229.8%(对<0.001）与tbph（待定）仅突变体，尽管这些动物仍然比TBPH拯救的突变体慢得多（图​（图2，2、B和C）。最引人注目的是，Caz过度表达对tbph（待定）突变体寿命增加了tbph突变体的平均寿命13倍(对<0.001）至与TBPH表达获救动物无显著差异的水平（图​（图2D）。2D） ●●●●。这些数据表明卡兹和tbph（待定）可能在共同的遗传途径中发挥作用，这是神经元发育、运动和寿命所必需的，其中Caz对TBPH具有上位性。

为了进一步测试这个模型，我们搜索了Caz和TBPH的获得功能表型。的突变tbph（待定）据报道，幼虫神经肌肉接头（NMJ）突触形态存在缺陷(21); 然而，我们无法在反等位基因组合中复制这一发现tbph（待定）（图​（图3，三、K和M）。然而，相比之下，当TBPH或TDP-43在运动神经元中过度表达时，我们确实观察到NMJ末端的大小急剧扩大，分别为68.4%和65.5%(对<0.001）突触泡数量增加（图​（图3，三、B、C和M）。当我们过度表达fALS突变体TDP-43时，我们没有观察到任何变化^M337伏，处于相同水平（图​（图3，三、D和M以及补充图3H）。同样，加利福尼亚州¹突变体具有正常的NMJ形态（图​（图3，三、I和M）；然而，野生型Caz或hFUS的过度表达确实导致了NMJ的扩张，扩张幅度为35.3%或35.2%(对<0.001）突触波顿数分别增加（图​（图3，三、E、F和M）。相反，hFUS的过度表达^522G兰特或hFUS^第525页没有显著增加NMJ终端尺寸（图​（图3，三、G、H和M）。因此，NMJ末端扩张是运动神经元中Caz/hFUS和TBPH/hTDP-43过度表达诱导的常见表型，而运动神经元受到fALS突变的抑制。我们使用此分析进一步测试加利福尼亚州和每小时我们首先在运动神经元中过度表达TBPH加利福尼亚州突变体。当我们这样做时，TBPH过度表达诱导的NMJ扩张被完全抑制到控制水平（图​（图3，三，I和M），表明TBPH需要Caz的存在来诱导NMJ末端扩张。相反，当我们在tbph（待定）突变体，它诱导NMJ末端扩张的水平与对照背景中Caz过度表达时观察到的水平相似（图​（图3，三、J和M）。这表明Caz不需要TBPH诱导NMJ扩张，并进一步支持Caz在TBPH下游遗传途径中发挥作用的模型。

在单独的窗口中打开

图3

卡兹是上位的tbph（待定）.

(A类–我)用抗-CSP（绿色）染色的三龄NMJ终末标记突触前，用抗-HRP（红色）标记野生型运动神经元过表达（OE）转基因Caz、FUS、TBPH、TDP-43和FUS或TDP-43 ALS突变体的肌肉4段A3处的神经元膜(B类–H（H）)或每小时和加利福尼亚州¹突变体(J型和我)由OK6-Gal4驱动运动神经元。这个tbph（待定）^–/–基因型为tbph^∆23/Df[2R]BSC660。野生型TBPH、TDP-43、Caz或FUS蛋白的过度表达诱导NMJ扩张，而ALS突变型FUS或TDP-43^M337伏不会(B类–H（H）). 的突变加利福尼亚州或tbph（待定）NMJ形态正常(我和K（K）). 野生型TDP-43表达诱导的NMJ扩张在加利福尼亚州突变体(J型); 然而，Caz过度表达诱导的NMJ扩张在tbph（待定）突变体(我). (M（M）)肌肉4节段A3的突触终末波顿数除以肌肉表面积的量化标准化为对照。误差条代表SEM***对< 0.001.

新转基因的产生。

所有Caz、FUS、TPBH和TDP-43转基因通过phiC31靶向转基因插入到第三染色体上的AttP40位点(38)（遗传服务）。Western blot证实了相同的表达（补充图3）。

其他股票。

使用了以下额外库存：TBPH(tbph（待定）^∆23) (21)（意大利的里雅斯特国际遗传工程和生物技术中心（ICGEB）Fabian Feiguin和Francisco Baralle赠送），Df[2R]BSC660（B#26512），C155-GAL4(37)，GMR-GAL4(39)，OK6-镀锌4(40)、OK319-GAL4、UAS-H1-YFP(41)（礼物来自美国宾夕法尼亚州费城福克斯蔡斯癌症中心Alexei Tulin）和UAS-LacZ（B#8530）。

爆震测量。

选择合适基因型的三龄幼虫，并将其转移到新鲜的小瓶中。羽化率定义为空蛹数量与总蛹数量之比。对每个基因型的90至200只蛹进行了分析。

运动分析。

基于Slawson及其同事的工作，使用改进的程序进行了高分辨率运动分析(42). 简单地说，羽化后0至12小时内收集成年雄性苍蝇，并以每瓶10只苍蝇的密度转移到小瓶中。动物从未被麻醉过，所有实验都在一天的同一时间进行，以避免因昼夜节律而发生变化。在24小时的等待期后，将单只苍蝇添加到一个40毫米×55毫米的亚克力移动室中。1分钟后，用安装在解剖显微镜上的摄像机拍摄了一段60秒的动物运动行为片段，解剖显微镜连接到带有Final Cut 6.0的Macintosh计算机。然后将电影转换为QuickTime，并使用动态图像分析软件3.4.2（Soll Technologies）进行分析。所有分析均采用双盲法。将10条随机轨迹组合在一起，生成图中所示的数据​图11和​和2。2根据Martinez等人(43).

免疫组织化学。

使用现有技术解剖成人大脑和腹神经索(44). 如前所述，对幼虫大脑进行解剖和染色(45,46). 用小鼠抗flag（1:500）（Sigma-Aldrich）和大鼠抗ELAV（1:500）（DSHB）标记它们。使用的二级抗体是抗小鼠Cy3（1:200）（Jackson ImmunoResearch）和抗鼠Cy2（1:200。如前所述，解剖并染色三龄幼虫的幼虫NMJ(45,46). 终端用小鼠抗CSP一级抗体6D6（1:200）（DSHB）、小鼠抗Cy3二级抗体（1:1000）和HRP-Cy3结合物（1:400）标记（Jackson ImmunoResearch）。样品安装在ProLong金防褪色试剂（Invitrogen）中。在A3段，肌肉4处，对突触发作的次数进行计数。

对于运动神经元联合标记，转基因UAS-H1YFP和UAS-LacZ由OK319-GAL4以及UAS版本的Flag-CAZ、Flag-FUS、Flag-FUS P525L、Flag_FUSR522G、Flag-CazR395G或Flag-CazP398L驱动。用一级抗体鼠抗Flag（1:1000）（Sigma-Aldrich）、兔抗BGal（1:1000，Cappel）、鸡抗GFP（1:1000；Abcam）和二级抗体鼠Cy3（1:1000。

分子生物学。

为了生成FLAG标记的Caz基因组DNA加利福尼亚州排除CG32576编码区的基因组DNA片段被克隆到pBI的EcoRI/XbaI位点，以及FLAG表位序列的3个拷贝(47)通过PCR在Caz起始密码子后立即插入。为了产生CG32576拯救基因组DNA，从BAC CH322-46G07（BACPAC资源中心）亚克隆了一个不含Caz编码区的5.0-kb基因组DNA片段到pBI的EcoRI/XbaI位点(48)将多个克隆位点侧翼插入pUASTattB载体(49). 使用pBI-UASC-G生成未标记的UAS转基因，该基因是通过引入果蝇合成核心启动子序列上游的10个UAS结合序列构建的(50)然后是Gateway复合盒(51)和SV40多聚腺苷化序列进入pBI载体。用pBI-UASC-VG或pBI-UASC-FG生成标记的UAS转基因，其中N末端的静脉-YFP序列(52)或FLAG表位标签(47)分别用pBI-UASC-G的网关盒在框架中引入。从cDNA克隆LD 27761（DGRC）扩增Caz，从cDNA clone GH09868（DGRC。在适当的情况下，在PCR引物中或通过定点诱变（Stratagene）引入突变。

蛋白质印迹和免疫沉淀。

对于Western blot，成虫苍蝇头部在SDS加载缓冲液中均匀化。蛋白质提取物在16000℃离心清除后克5分钟后，将上清液进行SDS-PAGE，转移至Protran硝化纤维素膜（Whatman），与抗体杂交，并用ECL Western Blotting底物（Pierce）检测。以1:1000稀释度使用小鼠抗FLAG（M2）（Sigma-Aldrich），以1:400稀释度使用兔抗TBPH(21)（意大利的里雅斯特ICGEB的Fabian Feiguin和Francisco Baralle赠送），1:200的小鼠抗β-微管蛋白（E7）（DSHB），1:2000的兔抗GFP，1:1000的小鼠抗TDP-43（2E2-D3）（Abnova）。为了进行免疫沉淀，将成虫苍蝇头在冰上的裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，2 mM EDTA，10%甘油，1%Triton X-100，蛋白酶抑制剂鸡尾酒[Roche]）中均质，在16000℃离心克持续20分钟。将上清液与抗FLAG M2-糖（Sigma-Aldrich）在4°C下培养4小时，然后用裂解缓冲液洗涤4次。免疫复合物在SDS负载缓冲液中变性并进行SDS-PAGE。对于RNase治疗，在免疫沉淀之前，将头部提取物与200μg/ml RNase A在25°C下孵育30分钟。

统计。

使用方差分析和Instat 3.0进行统计分析。对<0.05被认为是显著的。

我们感谢Fabian Feiguin、Francisco Baralle和Alexei Tulin提供的试剂。我们感谢Serge Przedborski、Chris Henderson和Erin Savner对手稿的评论。A.Tomlinson由NIH EY012536资助。N.A.Shneider和B.D.McCabe由P2ALS的拨款资助。