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神经精神药理学。2011年11月；36(12): 2561–2570.
2011年8月3日在线发布。 数字对象标识：10.1038/npp.2011.144
PMCID公司：项目经理194082
PMID：21814187

氟哌啶醇通过激活PKA和DARPP-32的磷酸化调节核糖体蛋白S6的磷酸化状态

艾曼纽尔·瓦尔詹特,1,6 耶稣·伯特伦·冈萨雷斯,2,三，4 希瑟保龄球,5 塞巴斯蒂安·洛佩兹,1 伊曼纽拉·桑蒂尼,1 米里亚姆·马塔马莱斯,2,三，4 亚历山德拉·博尼托·奥利瓦,1 丹尼斯·埃尔韦,2,三，4 查尔斯·霍弗,5 埃里克·克伦,5 Jean-Antoine Girault公司,2,三，4和吉尔伯托·菲松1,*
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关联数据

补充资料

摘要

服用典型的抗精神病药物，如氟哌啶醇，可以促进纹状体中棘神经元（MSN）的cAMP依赖性信号传导。在这项研究中，我们检测了氟哌啶醇对核糖体蛋白S6（rpS6）磷酸化状态的影响，该蛋白是小40S核糖体亚基的一种成分。我们发现氟哌啶醇增加了双位点Ser235/236处rpS6的磷酸化，这参与了mRNA翻译的调节。这种效应在间接途径的MSN中发挥，该途径特异性表达多巴胺D2受体（D2R）和腺苷A2受体（A2AR）。氟哌啶醇的作用因阻断A2AR或G基因衰减而减弱α嗅觉将A2AR偶联到腺苷酸环化酶激活的蛋白质。此外，刺激cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）可增加培养纹状体神经元的Ser235/236磷酸化。氟哌啶醇促进rpS6磷酸化的能力在蛋白磷酸酶-1抑制剂、多巴胺和cAMP调节的32 kDa磷酸蛋白缺乏PKA激活的敲除小鼠中被消除。相反，p70 rpS6激酶1或细胞外信号调节激酶的药理学或遗传失活不影响氟哌啶醇诱导的rpS6磷酸化。这些结果确定PKA是神经细胞中主要的rpS6激酶，并表明通过rpS6调节蛋白质合成可能是抗精神病药物的潜在靶点。

关键词：抗精神病药物、腺苷A2A受体、多巴胺D2受体、中等棘神经元、蛋白磷酸酶-1、纹状体

引言

抗多巴胺D2受体（D2Rs）神经传递的能力通常被认为是治疗精神分裂症和其他精神病性疾病药物的一个重要特征(克里斯河等, 1976). 然而，阻断D2R会导致不可逆的副作用，包括迟发性运动障碍和帕金森综合征，严重阻碍有效药物的使用。这些运动障碍被认为取决于抗精神病药物影响背侧纹状体神经传递的能力，背侧纹状体是基底神经节的主要组成部分(Robertson和Fibiger，1992年;万等, 1995). 在这个区域，D2R被一大群GABA能的中层棘状神经元（MSN）选择性表达，这些神经元投射到苍白球的外段(Gerfen，1992年). 这些细胞通过多突触回路调节参与运动功能控制的丘脑皮层神经元的活动(阿尔宾等, 1989;Gerfen，1992年). 基于这些原因，纹状体前脑MSN被认为在与使用抗精神病药物相关的运动副作用中起着关键作用。

传统抗精神病药物（如氟哌啶醇）在大脑中的主要作用之一是促进cAMP依赖性信号传导，而这种信号传导通常被D2R通过激活G输入/输出蛋白质(Stoof和Kebabian，1981年). 在纹状体乳头状MSN中，氟哌啶醇诱导cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）和蛋白磷酸酶-1（PP-1）抑制剂、多巴胺和cAMP调节的磷酸蛋白32的活化kDa（DARPP-32）被认为通过作用于核靶点来影响基因转录，包括cAMP反应元件结合蛋白和组蛋白H3(伯特兰·冈萨雷斯等, 2009;Konradi和Heckers，1995年;锂等, 2004;波齐等, 2003). 关于抗精神病药物和PKA/DARPP-32级联影响翻译控制相关信号级联的能力，人们知之甚少。

核糖体蛋白S6（rpS6）是与mRNA解码相关的小40S核糖体亚基的一个组成部分(鲁文斯基和梅尤哈斯，2006年). rpS6由p70 rpS6激酶（S6K）1在Ser235和Ser247之间的多个位点磷酸化(班迪等, 1993;克里格等, 1988)是雷帕霉素复合物1（mTORC1）哺乳动物靶点的主要下游效应器(科斯塔·马蒂奥利等, 2009). 双位点Ser235/236处rpS6的磷酸化也通过p90核糖体S6激酶（RSK）独立于mTORC1发生，后者由细胞外信号调节激酶（ERK）激活(鲁克斯等, 2007;斯特吉尔等, 1988). 胰腺的最新研究β-细胞鉴定PKA是一种额外的rpS6激酶，特异性参与Ser235/236的磷酸化(摩尔等, 2009).

rpS6的S6K依赖性磷酸化在控制细胞大小中具有重要作用(彭德等, 2004;鲁文斯基等, 2005)和蛋白质合成依赖的可塑性，如长期增强(安提奥等, 2008). 此外，在启动前翻译复合体的形成过程中，Ser235/236的磷酸化可促进rpS6向5′cap复合体的募集，从而促进蛋白质合成(鲁克斯等, 2007). 在这项研究中，我们检测了氟哌啶醇调节背侧纹状体MSN中rpS6磷酸化的能力。我们表明，氟哌啶醇增加了Ser235/236处rpS6的磷酸化，这种作用与ERK和mTORC1介导的S6K1活化无关，但需要完整的PKA/DARPP-32信号。

材料和方法

动物

雄性C57BL/6J小鼠（25–30 g）购自Taconic（丹麦Tornbjerg）。在D2R启动子控制下表达EGFP的细菌人工染色体转基因小鼠(图纸2-EGFP）或多巴胺D1受体（D1R；图纸1a-EGFP）由洛克菲勒大学的GENSAT（基因表达神经系统图谱）计划生成(龚等, 2003)在C57BL/6背景下杂交至少三代。表达突变型DARPP-32的敲除小鼠，其中Thr34被Ala取代（DARPP-32T34A突变小鼠），以及侏儒+/−（Gα嗅觉)杂合小鼠的产生与先前的研究相同(贝卢肖等, 1998;斯韦宁松等, 2003)在C57BL/6背景下回交至少10代。S6K1基因敲除小鼠是通过使用新霉素盒（之前在希马等(1998)然后如安提奥等(2008)将动物置于12小时的光-暗循环中，温度稳定（22°C），并提供食物和水随意所有实验均按照瑞典动物福利局、法国农业和林业部的指导方针（第87849号法令，许可证A75-05-22）或纽约大学动物护理和使用委员会的指导方针进行。

药物

氟哌啶醇（0.5 mg/kg；Sigma-Aldrich，斯德哥尔摩，瑞典）溶于含有0.05%（vol/vol）乙酸的盐水中，并用1 M NaOH将pH值调节至6.0。氯氮平（5 mg/kg；Sigma-Aldrich，法国）溶于0.9%NaCl中。KW6002（3 mg/kg）和SL327（50 mg/kg）是Edilio Borroni博士（Hoffmann-La Roche，Basel，Switzerland）赠送的礼物，通过超声波悬浮在5%（vol/vol）吐温-80的盐水溶液中，分别在氟哌啶醇之前5分钟和30分钟给药。雷帕霉素（马萨诸塞州沃本市LC实验室）（5 mg/kg）溶于5%二甲基亚砜（DMSO）、15%聚乙二醇-400和5%吐温-20的溶液中，从服用氟哌啶醇前3天开始，以5 ml/kg体重的体积给药（每天一次）。所有药物均经腹膜内注射（i.p.）。在实验前，小鼠连续3天习惯于处理。在慢性实验中，小鼠每天注射一次溶媒或氟哌啶醇（0.5 mg/kg），持续15天，并在挑战性注射溶媒或氟哌啶醇后15分钟灌流。

纹状体神经元的原代培养

从OF1小鼠（法国查尔斯·里弗实验室）的胚胎（E14）上解剖纹状体并机械分离。纹状体细胞悬浮在补充有B27（Invitrogen）、0.5 mM-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的神经基底培养基（Invit罗gen2每3-4天，取下一半培养基，用新鲜培养基替换。培养16天后，用药物处理神经元，用0.2 ml煮沸的SDS（1%，w/v）替换培养基，停止培养。蛋白质浓度由双茚二酸（BCA）检测试剂盒（Pierce）测定。含有30μg蛋白质的样品在12%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，并按照下文所述对脑样品进行分离和蛋白质印迹。

免疫荧光

用戊巴比妥（500mg/kg，腹腔注射。；在0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.5；瓦尔詹特等, 2000). 大脑在相同溶液中固定过夜，并储存在4°C下。总之，用振动棒（法国莱卡）切割30μm厚的切片，并将其储存在−20°C的含有30%（vol/vol）乙二醇、30%（vol/fol）甘油和0.1 m磷酸钠缓冲液的溶液中，直到对其进行免疫荧光处理。使用小鼠脑图谱确定与背纹状体对应的脑区(Franklin和Paxinos，1997年)在距前角1.10mm处取断面。在Tris缓冲盐水（TBS；0.25 M Tris和0.5 M NaCl，pH 7.5）中冲洗游离部分，并在含有3%H的TBS中培养5分钟2O（运行）2和10%甲醇（vol/vol），然后在TBS中各冲洗三次，每次10分钟。在0.2%Triton X-100中在TBS培养20分钟后，在TBS内再次冲洗切片三次。最后，用兔抗磷酸化Ser235/236-rpS6多克隆抗体（1:500；细胞信号技术，马萨诸塞州贝弗利）。所有缓冲液和培养液中均含有NaF（0.1 mM）。在一些实验中，G的表达式α嗅觉野生型和侏儒+/−使用兔多克隆抗体（1:500）评估小鼠(埃尔夫等, 2001). 然后将切片在TBS中冲洗三次，每次10分钟，并用山羊Cy3-偶联物（1:400；马萨诸塞州巴尔港杰克逊实验室）二级抗体。切片在TBS中漂洗10分钟两次，在TB（0.25M Tris）中漂洗两次，然后在Vectashield（Vector Laboratories，Burlingame，CA）或1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷（DABCO，Sigma-Aldrich，Sweden）中安装。使用连续激光扫描共聚焦显微镜（Leica SP2和Zeiss LSM510）从每个感兴趣区域获得单幅和双标签图像。在375×375μm范围内进行神经量化2通过计数Cy3-免疫荧光细胞核（用于磷酸化-Ser235/236-rpS6免疫标记）获得图像。细胞计数是由一名不知道小鼠所接受治疗的观察者进行的。使用基于Metamorph软件（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）的家庭编写程序计算所有参数。

Western印迹

将小鼠斩首处死，将其头部在液氮中冷却6秒，并取出大脑。在冰凉的表面上解剖纹状体，在750μl的1%十二烷基硫酸钠中进行超声处理，并煮沸10分钟。使用BCA分析试剂盒（Pierce Europe，Oud Beijerland，荷兰）将等分（5μl）的匀浆用于蛋白质测定。将每个样品的等量蛋白质（30μg）加载到10%的聚丙烯酰胺凝胶上。蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并隔夜转移至PVDF膜（瑞典乌普萨拉Amersham Pharmacia Biotech）(拖车箱等, 1979). 使用针对磷酸化-Ser235/236-rpS6、磷酸化-Thr389-S6K、磷酸化Thr202/Tyr204-ERK1/2（马萨诸塞州贝弗利市细胞信号技术）和磷酸化-Thr 34-DARPP-32的抗体对膜进行免疫印迹(斯奈德等, 1992). 抗rpS6、S6K（细胞信号技术）和DARPP-32的抗体(Hemmings和Greengard，1986年)非磷酸化状态特异性的蛋白质被用来估计蛋白质总量。检测基于荧光二级抗体结合，并使用Li-Cor Odyssey红外荧光检测系统（Li-Cor，Lincoln，NE）或增强化学发光试剂（GE Healthcare）进行量化。每个磷酸蛋白的水平根据样品中检测到的相应总蛋白量进行标准化。

统计分析

使用单因素或双因素方差分析对数据进行分析事后（post-hoc）使用Bonferroni或Newman–Keuls对各组进行比较事后（post-hoc）多重比较测试和吨-相关时，对两组进行方差相等的测试。

结果

氟哌啶醇选择性增加D2R表达神经元的RpS6磷酸化

以0.5 mg/kg的剂量全身施用氟哌啶醇，此前已证明其可促进包括PKA底物在内的几种蛋白质的磷酸化(伯特兰·冈萨雷斯等, 2009;哈坎森等, 2006)纹状体组织的western blotting分析表明，磷酸化Ser235/236-rpS6的水平增加了两倍(图1a). 这种效应在注射后15分钟达到峰值，60分钟后下降(图1a). 免疫荧光分析显示，服用氟哌啶醇后，背侧纹状体磷酸化Ser235/236 rpS6阳性神经元的数量显著增加(图1b).

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氟哌啶醇对纹状体中层棘神经元核糖体蛋白S6（rpS6）磷酸化的影响。（a） 用载体（Veh）或氟哌啶醇（Hal；0.5 mg/kg）治疗并在15或60分钟后死亡的小鼠纹状体中磷酸化-Ser235/236-rpS6（P-235/236-rpS6）的Western blot分析。右侧面板显示了使用抗P-235/236-rp S6（上部）和总rpS6（下部）抗体获得的代表性自射线照片。左侧面板是以平均值±SEM表示的数据摘要(n个=5–7;*第页<0.05与车辆）。（b） 背侧纹状体共焦切片，显示Veh或Hal处理并在15或60分钟后灌注的小鼠中P-Ser235/236-rpS6的免疫荧光。比例尺=40μm。（c和d）小鼠纹状体前脑表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）(图纸2-EGFP）或纹状腺素(图纸1a-EGFP）MSN用Veh或Hal（0.5 mg/kg）治疗，15或60分钟后灌注。（c） Veh或Hal处理后背侧纹状体EGFP阳性（D2阳性）或EGFP阴性（D2阴性）神经元中P-235/236-rpS6免疫反应神经元的定量图纸2-EGFP小鼠(**第页<0.001与各自的车辆）。（d） 用Veh或Hal处理并在15分钟后灌注的小鼠背纹状体的共聚焦切片显示P-235/236-rpS6的免疫荧光与EGFP荧光的结合。比例尺=30μm。（e和f）小鼠纹状体前脑表达EGFP(图纸2-用Veh或Hal（0.5 mg/kg，2周内每天注射一次）反复治疗EGFP MSN，并在挑战性注射Veh或Hal后15分钟灌注。（e） 背纹状体EGFP阳性（D2阳性）和EGFP阴性（D2阴性）神经元中P-235/236-rpS6免疫反应神经元的定量图纸2-长期（2周）用Veh或Hal治疗的EGFP小鼠，并用Veh和Hal激发(**第页<0.001与车辆；°°第页<0.01与哈尔）。（f） 背侧纹状体共焦切片显示P-235/236-rpS6的免疫荧光与EGFP荧光相结合。比例尺=30μm。

在背侧纹状体中，D2Rs由纹状体前脑MSN选择性表达，而D1Rs则存在于形成纹状体通路的其他大型投射神经元群中(Gerfen，1992年). 为了研究氟哌啶醇对这两个神经元群体rpS6磷酸化的影响，我们使用在D2R或D1R启动子控制下表达EGFP的转基因小鼠(图纸2-EGFP和图纸1a-EGFP小鼠）(龚等, 2003;瓦尔詹特等, 2009). 我们发现，氟哌啶醇（0.5 mg/kg）诱导的rpS6磷酸化增加专门发生在含有D2R的神经元中(图1c和d). 总的来说，这些结果与这种抗精神病药特异性作用于多巴胺D2型受体的能力相一致，因此，它优先影响纹状体乳头状核MSN(巴特普等, 2008;伯特兰·冈萨雷斯等, 2008,2009). 有趣的是，当长期给药（2周内每天注射一次）时，氟哌啶醇失去了增加rpS6磷酸化的能力(图1e和f). 因此，急性阻断D2样受体可选择性诱导纹状体前脑MSN中rpS6磷酸化，但随着治疗时间的延长，这种作用似乎减弱。

我们还研究了氯氮平对rpS6磷酸化的影响，氯氮平是一种对D2R亲和力低的非典型抗精神病药。氯氮平（5 mg/kg）选择性增加了D2R表达MSN中Ser235/236处rpS6的磷酸化（补充图S1）。然而，这种作用比氟哌啶醇产生的作用低得多，持续时间也短得多（参见。图1c和d).

氟哌啶醇诱导的Ser235/236磷酸化不需要mTORC1和S6K1，且与ERK无关

S6K主要参与监管rpS6(班迪等, 1993;克里格等, 1988;彭德等, 2004;鲁文斯基等, 2005). 因此，我们检测了它们参与氟哌啶醇诱导的Ser235/236磷酸化。施用mTORC1抑制剂雷帕霉素可阻止Thr389处S6K的磷酸化(图2c)，但不影响Ser235/236处rpS6的磷酸化(图2a和b). 氟哌啶醇对S6K1缺乏小鼠的作用也进行了测试(彭德等, 2000) (图2e). 与雷帕霉素的结果一致，我们发现，在这些动物中，氟哌啶醇在Ser235/236处增加rpS6磷酸化的能力得到了保留(图2d).

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阻断哺乳动物雷帕霉素复合物1（mTORC1）/p70 rpS6激酶（S6K）信号转导靶点并不影响氟哌啶醇诱导的核糖体蛋白S6（rpS6）磷酸化。野生型小鼠用溶媒（Veh）、氟哌啶醇（Hal；0.5 mg/kg）或Hal加雷帕霉素（5 mg/kg；每天给药一次，剂量为5 ml/kg体重，从给药前3天开始），并在15或60天后灌注min。（a）用赋形剂（Veh–Veh）、氟哌啶醇（Veh–Hal）或氟哌啶醇加雷帕霉素（雷帕霉素–Hal）处理并在15分钟后灌注的小鼠背纹状体单共焦切片中的磷酸-Ser235/236-rpS6（P-235/236-rpS6）免疫反应性。比例尺=30μm。（b） Veh–Veh、Veh–Hal或Rapamycin–Hal治疗的小鼠背侧纹状体中P-235/236-rpS6免疫反应神经元的定量(**第页<0.001与Veh–Veh）。（c） 用Veh、Hal（0.5 mg/kg）或Hal加雷帕霉素（5 mg/kg；见上文），15分钟后被处死。典型的放射自显影显示，用雷帕霉素治疗的小鼠纹状体中磷酸-Thr389-S6K免疫反应性降低。（d） 野生型或S6K1基因敲除（KO）小鼠用载体或氟哌啶醇（0.5 mg/kg）治疗，15分钟后处死。通过蛋白质印迹法测定P-235/236-rpS6的纹状体水平。顶部面板显示了使用抗P-235/236-rpS6（上部）和总rpS6（下部）抗体获得的代表性放射自显影图。底部面板是以平均值±SEM表示的数据摘要(n个=5;*第页<0.05与各自的车辆）。（e） 与野生型小鼠相比，S6K1 KO小鼠纹状体中无S6K免疫反应的典型自射线照片。

其他磷酸化Ser235/236上rpS6的蛋白激酶是被ERK激活的RSK(鲁克斯等, 2007). ERK/RSK级联解释了在S6K1/S6K2双敲除小鼠中观察到的Ser235/236上rpS6的剩余磷酸化(彭德等, 2004). 因此，我们检测了该途径在rpS6磷酸化中的参与。我们发现对ERK的封锁(图3c)SL327（一种丝裂原活化蛋白激酶/ERK激酶（MEK）抑制剂）实现的，不影响氟哌啶醇产生的rpS6磷酸化的增加(图3a和b).

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丝裂原活化蛋白激酶/ERK激酶（MEK）抑制对氟哌啶醇诱导的核糖体蛋白S6（rpS6）磷酸化的影响。用溶媒（Veh）、氟哌啶醇（Hal；0.5 mg/kg）或Hal加SL327（50 mg/kg；Hal前45分钟给药），15分钟后灌注。（a） 用Hal或Hal加SL327治疗的小鼠背侧纹状体单个共焦切片中的磷酸Ser235/236-rpS6（P-235/236-rpS6）免疫反应性。比例尺=30μm。（b） Veh、Hal或Hal加SL327治疗的小鼠背侧纹状体中P-235/236-rpS6免疫反应神经元的定量(**第页<0.01与车辆）。（c） 用Veh、Hal（0.5 mg/kg）或Hal加SL327（50 mg/kg；见上文），并在15分钟后处死。典型的放射自显影图显示使用MEK抑制剂治疗的小鼠纹状体中磷酸-ERK免疫反应性降低。

氟哌啶醇诱导的RpS6磷酸化依赖腺苷A2A受体介导的G激活α嗅觉

上述数据表明，在纹状体神经元中，已知控制Ser235/236处rpS6磷酸化的两条主要途径并不参与对氟哌啶醇的调节。因此，我们研究了cAMP依赖性级联的可能作用。除了D2Rs外，纹状体MSNs还表达高水平的腺苷2A受体亚型（A2AR）(芬克等, 1992;希夫曼等, 1991). A2AR耦合到Gα嗅觉通过激活腺苷酸环化酶增加cAMP合成的蛋白质(科沃尔等, 2001;库尔等, 2000). D2R拮抗剂促进cAMP信号传导的能力在很大程度上取决于完整的A2AR介导的传输(伯特兰·冈萨雷斯等, 2009;Borgkvist和Fisone，2007年;哈坎森等, 2006;斯韦宁松等, 2000). 因此，我们检测了选择性A2AR拮抗剂KW6002对氟哌啶醇诱导的rpS6磷酸化的影响。我们发现，用3 mg/kg KW6002阻断A2ARs可降低氟哌啶醇对磷酸-Ser235/236-rpS6的影响(图4a和b).

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KW6002对氟哌啶醇诱导的核糖体蛋白S6（rpS6）磷酸化的影响。小鼠接受溶媒（Veh）、氟哌啶醇（Hal）或Hal加KW6002（3 mg/kg；Hal前5分钟给药），15或60分钟后灌注。（a） 用Hal或Hal加KW6002治疗的小鼠背侧纹状体单个共焦切片中的磷酸Ser235/236-rpS6（P-235/236-rpS6）免疫反应性。比例尺=30μm。（b） Veh、Hal或Hal加KW6002治疗的小鼠背纹状体单个共焦切片中P-235/236-rpS6免疫反应神经元的定量(**第页<0.01与车辆；°°第页<0.01与哈尔）。

氟哌啶醇诱导的rpS6磷酸化在侏儒+/−携带G编码基因杂合突变的小鼠α嗅觉，降低了纹状体中这种蛋白质的水平(科沃尔等, 2007) (图5). 这一观察特别有趣，因为在这些小鼠中，Gα嗅觉减少了大约50%（比较。图5a)，导致cAMP信号大量减少(科沃尔等, 2007). 综上所述，这些结果表明，氟哌啶醇通过消除D2R通常对A2AR介导的cAMP生成产生的抑制音调来增加rpS6磷酸化。

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克α嗅觉-氟哌啶醇诱导的核糖体蛋白S6（rpS6）磷酸化需要介导的信号传导。野生型(侏儒+/+)和侏儒+/−用氟哌啶醇（0.5mg/kg）处理小鼠，分别于15min和60min后灌流。（a） G公司α嗅觉野生型纹状体背侧共焦切片的免疫反应性侏儒杂合的(侏儒+/−)鼠标。注意G的减少α嗅觉纹状体的免疫反应侏儒+/−鼠标。比例尺=50μm。（b） 大鼠背侧纹状体单个共焦切片中的磷酸Ser235/236-rpS6（P-235/236-rpS6）免疫反应性侏儒+/+或侏儒+/−老鼠。比例尺=30μm。（c） 纹状体P-235/236-rpS6免疫反应神经元的定量侏儒+/+和侏儒+/−小鼠给药溶媒（Veh）或氟哌啶醇（Hal）后15和60分钟(**第页<0.01与车辆；°°第页<0.01vs侏儒+/+).

我们使用培养的纹状体神经元进一步探索A2AR的激活是否可以通过cAMP信号调节Ser235/236上的rpS6磷酸化。A2AR激动剂5′的应用-(N个-环丙基羧酰胺腺苷（CPCA，200μM）诱导纹状体神经元Ser235/236上rpS6磷酸化(图6a). 这种作用是由PKA介导的，因为PKA抑制剂H-89（50μM）会消除这种作用(图6a). 此外，cAMP类似物和PKA激活剂Sp-5,6-DCl-cBIMPS（10μ）诱导Ser235/236上rpS6磷酸化显著增加(图6b). 因此，我们的结果体内和在体外提供了一致的证据，证明氟哌啶醇对rpS6 Ser235/236磷酸化的影响是通过激活cAMP途径介导的。

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蛋白激酶A（PKA）信号传导对核糖体蛋白S6（rpS6）磷酸化的影响。培养纹状体神经元磷酸化-Ser235/236-rpS6的Western blot分析。顶部面板显示典型的自动射线图。底部面板是以平均值±SEM表示的数据摘要(n个=4). （a） 纹状体神经元用载体（Veh）（A2AR激动剂5′）治疗15分钟-(N个-环丙基）甲酰胺腺苷（CPCA，10μM）或CPCA加上PKA抑制剂H-89二盐酸盐水合物（50μM，在CPCA前15分钟加入）。（b） 用Veh或cAMP类似物Sp-5,6-DCl-cBIMPS（cBIMPS，200μM）处理纹状体神经元15分钟。(**第页<0.01与车辆；°°第页<0.01与CPCA）。

氟哌啶醇诱导的RpS6磷酸化依赖于PKA介导的DARPP-32活化

在纹状体中，cAMP信号激活产生的大部分效应依赖于DARPP-32(奈恩等, 2004). 在Thr34处PKA介导的磷酸化将DARPP-32转化为PP-1抑制剂，从而抑制作用于cAMP/PKA级联下游的众多效应靶点的去磷酸化(格林加德，2001). 已知氟哌啶醇可增加DARPP-32在Thr34的磷酸化体内(波齐等, 2003). Western blot分析显示，给药氟哌啶醇15分钟和60分钟后，在我们的实验条件下测定的磷酸-Thr34-DARPP-32水平显著增加(图7a). 为了评估DARPP-32在氟哌啶醇介导的rpS6磷酸化中的作用，我们使用了DARPP-32T34A突变小鼠，其中Ala替代Thr34可阻止PKA介导的磷酸化(图7b). 我们发现，在这些小鼠中，氟哌啶醇不会对rpS6的磷酸化状态产生任何变化(图7c和d). 这些数据表明，PKA/DARPP-32信号通路是纹状体神经元rpS6的主要调节剂，并表明Ser235/236的磷酸化受PP-1的控制。

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多巴胺和cAMP调节的32 kDa磷酸蛋白（DARPP-32）中Thr34突变为Ala可阻止氟哌啶醇诱导的组蛋白H3磷酸化。野生型和T34A突变小鼠用溶媒（Veh）或氟哌啶醇（Hal；0.5 mg/kg）治疗，并在15和60分钟后灌注。（a） 用氟哌啶醇（0.5 mg/kg）治疗并在15或60分钟后处死的野生型小鼠纹状体中磷酸化-Thr34-DARPP-32（P-DARPP-32）的Western blot分析。顶部面板显示了使用抗P-DARPP32（上部）和总DARPP-3.2（下部）抗体获得的代表性自射线图。底部面板是以平均值±SEM表示的数据摘要(n个=5–7) (*第页<0.05与车辆）。（b） 用Veh或Hal治疗的小鼠纹状体无P-DARPP-32免疫反应的代表性放射自显影。（c和d）用Veh或Hal处理野生型或T34A DARPP-32突变小鼠，并在15或60分钟后灌注。（c） 野生型或T34A突变小鼠背侧纹状体单个共焦切片中的磷酸Ser235/236-核糖体蛋白S6（P-235/236-rpS6）免疫反应性。比例尺=30μm。（d） 野生型或T34A DARPP-32突变小鼠（T34A）服用Veh或Hal 15或60分钟后，背纹状体P-235/236-rpS6免疫反应神经元的定量(**第页<0.01与车辆；°°第页<0.01与野生型）。

讨论

本研究表明，服用抗精神病药物和D2R拮抗剂氟哌啶醇可促进rpS6在Ser235/236的磷酸化，特别是在间接纹状体-前脑通路的MSN水平。他们还表明，这种效应是通过促进A2AR介导的cAMP/DARPP-32信号级联激活来实现的，并不涉及S6K或ERK/RSK的激活。

在纹状体乳头状神经元中，阻断D2R会增加PKA几种底物的磷酸化状态(伯特兰·冈萨雷斯等, 2008,2009;哈坎森等, 2006;锂等, 2004;波齐等, 2003). 这种作用被认为是由于D2Rs对腺苷酸环化酶的抑制张力被消除，从而导致cAMP的积累和PKA的激活。D2R拮抗剂（包括氟哌啶醇）促进cAMP/PKA信号传导的能力依赖于A2AR(伯特兰·冈萨雷斯等, 2009; Borgkvist和Fisone，2007年；哈坎森等, 2006;斯韦宁松等, 2000)，通过激活G来维持基础腺苷酸环化酶活性α嗅觉(科沃尔等, 2001). 这些结果表明，阻断A2AR或降低G水平α嗅觉防止氟哌啶醇诱导的Ser235/236磷酸化增加，表明PKA在这一现象中的重要性。在培养的纹状体神经元中，A2AR介导的Ser235/236磷酸化增加被PKA抑制所阻断，并被PKA激活所模仿，这一观察进一步支持了这一观点。这些观察结果与最近将PKA确定为第三种PKA一致体内胰腺中的rpS6激酶β-单元格(摩尔等, 2009).

cAMP/PKA信号通路调节下游靶蛋白活性的能力取决于Thr34处DARPP-32的伴随磷酸化，该磷酸化通过抑制PP-1抑制蛋白质去磷酸化(格林加德，2001). 因此，PKA磷酸化位点Thr34处DARPP-32的突变阻止了氟哌啶醇和其他D2R拮抗剂增加谷氨酸AMPA受体GluR1亚基和组蛋白H3磷酸化状态的能力(伯特兰·冈萨雷斯等, 2009;哈坎森等, 2006). 目前的数据表明，氟哌啶醇在Ser235/236对rpS6磷酸化的调节也涉及类似的机制。因此，氟哌啶醇的作用不仅取决于PKA催化的磷酸化增加，还取决于磷酸化-Thr34-DARPP-32通过抑制PP-1而降低的去磷酸化作用。为了支持这类调节，先前有人提出PP-1作为S6磷酸酶(贝兰迪亚等, 1994).

氟哌啶醇对Ser235/236处rpS6磷酸化的影响独立于S6K发挥。因此，施用雷帕霉素（抑制S6K活性或S6K1缺失）不会阻止D2R拮抗剂促进rpS6磷酸化的能力。

研究表明，ERK/RSK信号通路通过激活mTORC1和S6K调节rpS6磷酸化(妈妈等, 2005;鲁克斯等, 2004). 此外，ERK被提议通过RSK催化的Ser235/236磷酸化独立于mTORC1调节rpS6磷酸化(鲁克斯等, 2007). 我们的数据表明，使用MEK抑制剂SL327阻断ERK并不会改变氟哌啶醇增加rpS6磷酸化的能力。这表明氟哌啶醇在纹状体乳头状MSN中产生的ERK磷酸化适度增加(伯特兰·冈萨雷斯等, 2008,2009)不涉及rpS6的监管。

在帕金森氏病小鼠模型中进行的研究表明，D1R的激活增加了Ser235/236处rpS6的磷酸化。这种作用在直接途径的MSN中选择性地发挥，取决于ERK的伴随激活(圣蒂尼等, 2009). 因此，在纹状体中，rpS6在两个主要神经元群体（即直接和间接途径的MSN）水平上的磷酸化状态似乎由不同的信号机制控制。

氟哌啶醇增加背侧纹状体rpS6磷酸化状态的能力是一种新型机制，可能与典型抗精神病药物的作用有关。特别是，这些结果表明，这些物质产生的运动副作用可能与纹状体前脑MSN中mRNA翻译效率的变化有关。在这方面，值得注意的是，与氟哌啶醇相比，氯氮平是一种不典型的抗精神病药，对运动并发症的敏感性较低，对rpS6磷酸化的影响要小得多。根据这一观察结果，已经表明氟哌啶醇（而不是氯氮平）增加了c-fos公司在背侧纹状体中（Robertson和Fibiger，1992；万等, 1995). 因此，服用典型抗精神病药物后出现的迟发性运动障碍和帕金森综合征可能与通过对转录和翻译过程的协调作用而产生的纹状体MSN活性的改变有关。

总之，本研究表明，典型的抗精神病药物氟哌啶醇通过激活cAMP信号，独立于mTORC1/S6K和ERK/RSK信号，增加纹状体乳头状MSN中rpS6的磷酸化状态。所提供的数据支持一种模型，即阻断D2R可促进PKA催化的Ser235/236磷酸化，并通过DARPP-32抑制PP-1介导的去磷酸化。它们还增加了抗精神病药物和D2R拮抗剂不仅通过控制转录过程，而且通过改变翻译效率影响纹状体传递的可能性。

致谢

这项工作得到了瑞典研究委员会拨款20715和13482、温纳-格伦基金会和国家研究机构（ANR）在Era-Net NEURON（ANR-08-NEUR-006-01项目）（向GF）、医学研究基金会（FRM）和拨款ANR-08-BLAN-0287（向JAG）的支持，以及国家卫生研究院NS034007和NS047384（发给EK）。SL是FEBS博士后奖学金的获得者。ABO得到了Blanceflor Boncompagni-Ludovisi，née Bildt基金会的支持。我们感谢Paul Greengard博士提供T34A DARPP-32突变小鼠。

笔记

作者声明没有利益冲突。

脚注

神经精神药理学网站上的论文附有补充信息(http://www.nature.com/npp)

补充材料

补充图S1

补充图图例

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文章来自神经精神药理学由以下人员提供自然出版集团