利用基因传递的转录因子编码从人多能干细胞快速高效地产生功能性运动神经元

摘要

介绍

利用人类胚胎干细胞（hESC）和诱导多能干细胞（iPSC）衍生运动神经元（MN）进行基于细胞的建模的最新进展为理解运动系统和MN疾病的发展提供了新的机会。MN是一类高度专业化的神经元，位于脊髓中，以有组织和离散的方式将轴突投射到肌肉中以控制其活动。最突出的MN疾病是脊髓性肌萎缩（SMA）和肌萎缩侧索硬化（ALS），MN在疾病中死亡。对于SMA，已知SMN水平降低的遗传缺陷。确实是基因传递SMN公司在SMA的转基因模型中，导致生存期延长和运动救援，这表明增加MNs中SMN水平的方法可能具有治疗作用。^1,2,三,4干细胞衍生的MN来自SMA患者的iPSC，为药物和治疗筛选提供了新的细胞群体。⁵此外，以干细胞为基础的治疗也显示出对SMA和脊髓损伤的治疗潜力。例如，研究报告称，将MN祖细胞移植到SMA小鼠的脊髓或脊髓损伤大鼠模型中，可以部分恢复运动能力下降。^6,7MN也被广泛用于研究ALS和筛选潜在治疗化合物，^{8,9,10,11,12,13}从而证明了产生大量MN的要求。

生成大量脊柱MN用于在体外-基于筛选和移植研究，神经肌肉研究人员利用了小鼠胚胎干细胞高效分化为这种细胞类型的倾向。然而，由于MN生产效率低以及繁琐、耗时的培养条件，用人胚胎干细胞重复这些研究的进展缓慢。目前产生MN的程序包括在无血清培养基中形成胚状体，随后在维甲酸（RA）和声波刺猬（SHH）存在下形成神经花环，其功能是尾状化和腹侧化MN祖细胞，^14,15分别是。然后将神经营养因子添加到培养基中，以进一步成熟并帮助细胞存活。整个分化过程需要2个月才能产生MN，MN具有电生理活性，效率为10-40%。^{16,17,18,19,20,21}为了深入了解MN分化的障碍，我们评估了RA/SHH处理细胞中MN编码的基因表达谱，以确定在这一过程中哪些因素是速率限制的。在确定了这些速率限制因子后，我们利用腺病毒基因传递策略在hES和hiPS细胞中快速诱导MN编码的表达：神经原蛋白2（NGN2）、胰岛1（ISL-1）和LIM/同源盒蛋白3（LHX3）。我们从人类多能干细胞生成诱导MN的分化策略可用于在体外MN疾病建模平台或作为细胞治疗的潜在来源。

结果

从hESCs诱导MNs的RA/SHH需要较长的分化和成熟期

在我们的初步研究中，我们使用了HSF-6 hESC细胞系，该细胞系在整个研究过程中被证实具有正常的核型(补充图S1). 此外，通过免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）评估，这些细胞表达高水平的碱性磷酸酶和参与多能性的转录因子，如REX1、OCT3/4、NANOG和SOX2(补充图S2a–c). 免疫细胞化学分析显示，该株还表达了hESCs特有的细胞表面标记SSEA4(补充图S2c)证明我们的细胞表达了真诚地多能干细胞。为了证实HSF-6细胞系能够产生MN，我们利用了体外注射RA和SHH的典型方法来信号MN发育途径，^16,18,22(图1a-b). 如前所述，HSF6-hESCs可能被诱导为神经外胚层命运，^22,23神经前体细胞（NPC）标记物PSA-NCAM和OTX2阳性细胞>70%(补充图S3). 然后，我们通过半定量RT-PCR评估MN基因表达谱，以表征MN激活的时间(图1c). 在胚状体培养物中加入RA和SHH后，我们分析了诱导MN形成的转录程序(图1b)通过半定量RT-PCR暂时超过30天(图1c). 在增殖的人胚胎干细胞中，我们的培养物中没有神经元特异性因子，这表明未分化细胞的群体是均匀的。在分化的第13天，我们观察到早期MN特异性因子、PAX6和OLIG2以及ISL-1和NEUROD的表达(图1c). 免疫细胞化学分析也证实了前三个标记的表达(补充图S3). 在第20天和第30天，所有MN特异性基因的表达都很明显，包括LHX3、ISL-1和HB9的强表达(图1c). RA/SHH后20天，胆碱乙酰转移酶（CHAT）表达出现并在第30天增加。免疫组织化学证实内源性HB9、LHX3、ISL-1和CHAT的表达，表明这些细胞确实表达MNs的原型标记(图1d,补充图S3). HB9的量化⁺和CHAT⁺细胞显示，约30%的细胞确实是成熟的MNs，这一效率与之前关于人胚胎干细胞分化为MNs的报道类似。^17,18,19此外，hESC衍生的MNs表达SMI31（一种非磷酸化神经丝）和HOXC6，如预期的那样证明了宫颈MN的特性(图1d).¹⁷总之，这些结果表明RA/SHH诱导的细胞成熟为MN表型的过程缓慢。

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图1

人类胚胎干细胞需要很长的分化和成熟期才能分化为功能性多核细胞在体外.(一)将人类胚胎干细胞分化为多核细胞的范式。将人胚胎干细胞在DMEM/F12/N2培养基中分化为神经前体细胞，然后用RA/SHH诱导MN分化。(b条)描述MN开发中关键信号因素的示意图。(c（c）)RA/SHH治疗后多个时间点对MN早期和晚期分化相关标记物进行RT-PCR分析。(d日)成熟MN同时表达HB9（红色）和CHAT（绿色），也表达SMI31（绿色）并表达颈脊髓身份标志物HOXC6（红色）。(e（电子）)拼接式Hb9:：招标书添加RA/SHH后28天的MN没有钠电流活性(（f）). (克)拼接式Hb9:：招标书MN 2周后出现钠电流活动(小时)，动作电位(我)，钠电流峰值活度约为−700 pA(j个). 面板中的箭头“小时“显示代表钠电流的峰值。面板中的箭头“j个”表示钠电流活动峰值。面板内“d日“巴=50µm。胆碱乙酰转移酶；DMEM，Dulbecco改良的Eagle培养基；人胚胎干细胞；MN，运动神经元；RA，维甲酸；逆转录聚合酶链反应；SHH，声音刺猬。

为了确定我们培养物中表达成熟MN标记的神经元是否真的功能成熟，我们分析了它们的电生理特性，以测试它们是否可以激发动作电位。具体来说，我们利用全细胞穿孔斑贴记录技术来确定它们是否产生了指示成熟MN的快速失活钠电流和动作电位。²⁴为了容易识别活培养物中的MN，一位先前报道的慢病毒报告者¹³在MN特异性的控制下编码红色荧光蛋白（RFP）血红蛋白9利用了启动子。通过在整个细胞体和神经突起的强烈RFP表达，可以很容易地观察到转导的MN(图1e，g). 我们首先在第28天评估了分化MN培养物的电生理特性，这是我们观察到HB9和CHAT高表达的大致时间点。有趣的是，在这个时间点，所有六个记录的MN都被培养在星形胶质细胞上，在有神经营养因子的情况下再培养4天，以便进一步成熟²⁵尽管表达了MN的所有表型标记，但没有电生理成熟，因为没有打补丁的Hb9-RFP+MN激发动作电位(图1e–f,图2a). 这一观察结果表明，需要进一步成熟才能诱导MN所需的电生理机制蛋白激发动作电位。因此，我们在存在RA/SHH和神经营养因子的情况下，将这些MN在人类星形胶质细胞上共培养2周。RA/SHH治疗后42天，共4天Hb9:：招标书-阳性MNs在培养中被片状夹持(图1g)电流步进协议记录了所有这些MN内的快速钠电流(图1h和​2a个2a个). 此外，在电刺激下，贴片Hb9-RFP+MNs激发动作电位(图1i)，钠电流峰值约为−700 pA(图1j). 所有这些结果表明，人胚胎干细胞在分化条件下需要长达52天的时间才能完全成熟为MN。^{16,17,18,19,20}

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图2

N.I.L.转录因子对人胚胎干细胞的快速高效MN分化。(一)利用RA/SHH将人类ES或iPS细胞分化为电生理相容性MN的时间线。（b）)利用N.I.L.加速人类ES或iPS细胞向电生理相容MN分化的时间线(c（c）)N.I.L.诱导的MN分化显示成熟MN标记HB9和CHAT的共同表达。(d日)HuES-3 Hb9:：GFP细胞分化为具有N.I.L.转录因子编码的MN，显示GFP表达。(e（电子）)共标记HB9/CHAT诱导MN的量化。(（f）)qRT-PCR分析HOX公司从N.I.L.诱导的MNs和RA/SHH诱导的MNs中检测在脊髓的颈、胸和腰区域中表达的基因。(克)表达α-肌动蛋白的C2C12衍生肌管的相位对比图，高功率插入物显示出特征性条纹。(克)N.I.L.诱导的MN表达SV2（红色），并与标记有TUJ1（绿色）的轴突共定位。如箭头所示（底部面板），MN轴突末端与标有银环蛇毒素（红色）的乙酰胆碱受体形成连接。面板中的箭头“克显示了MN轴突与肌管上的乙酰胆碱受体的共定位。面板内“c（c）“所有钢筋=50µm。面板内“克“所有钢筋=20µm。DMEM，Dulbecco改良的Eagle培养基；人胚胎干细胞；MN，运动神经元；N.I.L.、Ngn2、Isl-1和Lhx3；RA，维甲酸；qRT-PCR，定量逆转录酶-PCR；SHH，声音刺猬。

N.I.L.诱导的MN在快速时间内获得电生理特性

接下来，我们通过在用N.I.L.鸡尾酒转导11天后测量其电生理特性来评估MN的功能成熟度。为了观察MN，我们用之前描述的含有Hb9:：招标书在进行电生理测量之前，将报告者和转移到一层星形胶质细胞上再进行4天。共有10个从HSF-6细胞系分化而来的RFP阳性MN被贴片断(图3a)，电生理测量显示有较强的钠电流(图3b)，指示所有记录MN的MN电生理特性。服用500 nmol/l河豚毒素也可以阻断钠通道电流(图3c)进一步证明了钠电流通道测量的特异性。此外，MN在电刺激下表现出动作电位，表明其功能成熟(图3d). 钠电流测量值约为−800 pA(图3e)，具有较强的自发活动能力(图3f). 总的来说，这些结果表明N.I.L.指令快速产生具有成熟MN电生理能力的MN。

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图3

N.I.L.诱导的MN功能成熟，具有典型的电生理特性。(一)N.I.L.诱导的MN标记为Hb9:：招标书和膜片钳显示钠电流活动(b条)可以被河豚毒素（TTX）阻断(c（c）). N.I.L.诱导的MN显示动作电位(d日)，钠电流峰值活度约为−800 pA(e（电子）)和自发活动(（f）). 面板中的箭头“b条“显示代表钠电流的峰值。面板中的箭头“e（电子）”表示钠电流活动峰值。MN，运动神经元；N.I.L.、Ngn2、Isl-1和Lhx3。

N.I.L.快速有效地从hiPSC诱导MN

鉴于N.I.L.在人胚胎干细胞（hESCs）上的成功应用，可以快速高效地产生具有电生理活性的MNs，我们接下来计划确定是否可以利用相同的方法从人诱导多能干细胞（hiPSCs）中生成MNs。大量报告表明，hiPSCs可以利用各种转录因子鸡尾酒组合从多种细胞类型中衍生。^{34,35,36,37,38,39,40,41}我们使用表达四种Yamanaka因子（OCT3/4、KLF-4、SOX2和c-MYC）的逆转录病毒载体从人成纤维细胞中衍生出一系列hiPSC⁴²(图4a). 用LIN28、OCT3/4、SOX2、TRA-1-60和NANOG对hiPSC进行染色，以确认其表达多潜能特征(图4a). 然后将这些细胞暴露于我们在hESCs上使用的相同方案中，如图2b与之前描述的诱导MN的N.I.L.的方案类似，用表达N.I.L的腺病毒转导细胞，并在11天后评估MN标记物。细胞表现出强大的MN分化，72±3.4%的细胞与HB9和CHAT混合(图4b). 先前的研究表明，iPS细胞系分化为成熟细胞类型的能力可能有所不同。⁴³因此，我们测试了另外两个iPS系，以利用我们的N.I.L.诱导策略将其高效分化为MN的能力。⁴⁴与我们之前的结果类似，我们能够在iPS系4和5中实现类似的MN分化效率，分别显示与HB9和CHAT共标记59±4.2%和49±3.3%(补充图S5,图4b). 与我们之前关于人胚胎干细胞通过RA/SHH分化为MNs的结果一致，在分化的早期，未转染的对照细胞未显示HB9或CHAT阳性。这些结果进一步证明了N.I.L定向编程方法在多个hiPS细胞系上的实用性，这些细胞系显示出高效快速的MN生成(图4b).

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图4

N.I.L.-诱导hiPSCs快速高效生成MNs。(一)hiPSC克隆的相位对比图显示了明显的hESC形态。hiPSCs表达与多能性相关的标记，如LIN28、OCT3/4、SOX2、TRA-1-60和NANOG。(b条)N.I.L.诱导的MN表达HB9和CHAT，并在与核染料DAPI融合的同一细胞中共定位。hiPS细胞中与HB9/CHAT共标记的诱导MN的定量。面板内”一“钢筋=100µm。面板内“b条“棒材=50µm。人胚胎干细胞；hiPSCs，人诱导多能干细胞；MN，运动神经元；N.I.L.、Ngn2、Isl-1和Lhx3。

讨论

多能干细胞已被证明是获得MN的宝贵干细胞来源。然而，生成MN需要大量时间，目前的方法可以产生10-40%的MN分化以及神经元和非神经元细胞的异质性。^{16,17,18,19,20,21}这种异质性在一定程度上是由RA和SHH在胚胎脊髓内传递神经元多样性的方式引起的。⁴⁵为了更准确有效地将hESC导入MN，我们利用了关键的MN特异性转录因子，这些转录因子作用于RA/SHH信号的下游。²⁹我们的结果表明，MN特异性转录因子能够快速有效地产生功能性MN。这项技术的未来发展方向是对整个CNS中存在的替代神经元类型进行编程。事实上，最近的研究表明，向hES细胞传递一种关键转录因子Lmx1a可以引导其分化为中脑多巴胺能神经元。⁴⁶此外，有可能使用转录因子编码来产生交替的MN亚型命运，例如那些支配肢体肌肉的命运。

虽然我们还没有观察到MN内这些因子持续表达的任何不良影响，但我们有兴趣确定MN基因程序在沉默病毒介导的转录因子表达后是否被保留。此外，我们观察到，NIL导向的MN在培养基中可以存活6周，证明其作为药物筛选工具的高度适用性。

MN已被越来越多地用于模拟神经退行性疾病在体外如SMA和ALS。^{5,8,9,10,11,12,13}例如，埃伯特等。结果表明，与健康MN相比，从SMA患者的iPS细胞分化出的MN显示SMA MN的轴突延伸缩短，培养存活率降低。⁵ALS建模的其他报告在体外已证明MN对ALS衍生星形胶质细胞的敏感性。^{8,9,10,11,12,13}虽然ALS患者衍生的MN是通过iPS细胞技术产生的，^47,48没有报告记录这些MN中的任何缺陷。为了克服从MN病患者的大量iPS细胞系中产生MN的技术挑战，一种更快速有效的MN分化方法对于干细胞生物学家来说比目前可用的技术更有价值。我们从hES或iPS细胞诱导MN分化的方法绕过了这些MN分化技术限制，在快速和加速的时间框架内产生大量这些细胞。我们设想该技术将高度适用于MN疾病的药物筛选平台，如SMA或ALS。在药物筛选过程中，可使用Hb9:：GFP或Hb9::：荧光素酶报告系统对多能干细胞系进行工程化，以实现监测和量化目的。此外，还可以对高浓缩MN进行毒理学研究，以测试候选药物靶点。

总之，这种转录编码策略允许在约11天内从hESCs或hiPSCs高效地生成具有特征电生理特性的功能性MN，这一策略对研究基础MN生物学的人来说应该是有价值的在体外开发MN疾病的筛查分析，或推进再生医学的应用。

材料和方法

细胞培养HSF-6 hESC系（P65）是从国家干细胞库（NSCB）获得的，在照射过的原代小鼠胚胎成纤维细胞（Millipore，Billerica，MA）上培养和传代，如前所述。⁴⁹hiPSCs培养类似于hESCs。人类iPS系iPS-4和iPS-5是从乔治·戴利实验室波士顿儿童医院干细胞项目获得的。HuES-3 Hb9:：GFP细胞系是Kevin Eggan（哈佛大学，马萨诸塞州剑桥）赠送的礼物。

腺病毒和慢病毒构建物。AdEasy腺病毒载体系统（Stratagene，La Jolla，CA）用于构建小鼠腺病毒长度x3,岛屿1、和Ngn2号机组基因。与这些基因编码区相对应的所有cDNA都被亚克隆到巴姆HI和Xho公司pShuttle-CMV腺病毒载体的I位点，以及所有后续步骤都是根据制造商的说明，使用人类293细胞进行病毒繁殖。病毒滴度在10之间¹¹和10¹²病毒颗粒/ml，由TCID测定₅₀化验。

慢病毒报告员在控制下构建驱动RFP血红蛋白9发起人（Sam Pfaff、Carol Marchetto和Fred Gage的馈赠）被用来识别MN。如前所述，在HEK-293细胞中通过四重转染产生假型泡孔病毒糖蛋白慢病毒。⁵⁰

hiPSC生成使用CaCl转染编码OCT3/4、SOX2、KLF-4和c-MYC的.pMXs逆转录病毒载体（Addgene，Cambridge，MA）₂方法分别用CMV-GP和VSVG质粒导入人胚胎肾癌293细胞（HEK-293）产生逆转录病毒。感染后48小时，收集上清液，混合，并通过0.22微米过滤器过滤，补充5µg/ml的聚brene。60000个正常成纤维细胞（Coriell，Camden，NJ）在10 cm处感染逆转录病毒²组织培养板。将培养基更换为添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基，并允许细胞生长1周，直到将培养基更改为添加rho激酶抑制剂Y-27632的hESC培养基（Calbiochem，Gibbston，NJ）。

核型分析HSF6 hESC系的核型分析是在俄亥俄州立大学综合癌症中心的分子细胞遗传学共享资源中进行的。

定量RT-PCR从增殖的hESCs、RA/SHH诱导的和N.I.L.诱导的MNs中获取RNA。总RNA用RT逆转录²First Strand Kit（SABiosciences，Frederick，MD）符合制造商的说明。使用RT进行实时定量PCR反应²实时SYBR Green/Rox PCR主混合（SABiosciences）并在RT上运行²人类HOX基因的Profiler PCR阵列（SABiosciences）。本研究中使用的引物如所示补充表S1.

MN分化为了诱导MN分化，首先用1 mg/ml胶原酶IV从小鼠饲养层中去除hESC或iPSC集落。然后将集落重新悬浮在添加1%N2和10%敲除血清（Invitrogen，Carlsbad，CA）的Dulbecco改良Eagle's培养基/F12中，并在培养皿中培养，以诱导前2天的类胚体形成。孵育2天后，如上所述使用无血清培养基，不含10%敲除血清，再培养2天。分化4天后，让EB作为不同的非接触菌落附着在多鸟氨酸/层粘连蛋白涂层的培养皿上，再放置6天，以诱导神经花环的形成。然后用一个小移液器手动去除神经花环，用accutase（Invitrogen）将其分离，涂布在多聚鸟氨酸/层粘连蛋白涂层皿上，然后用RA（2µmol/l）和SHH（500 ng/ml）处理，以进行常规MN分化。

N.I.L.诱导的MN分化NPC与人胚胎干细胞或多能干细胞通过上述相同的协议进行区分。在分化为含有NPC的神经花环10天后，用移液器手动去除神经花环，分离，并如上所述将其镀在聚鸟氨酸/层粘连蛋白涂层的培养皿上。24小时后，NPC感染N.I.L.，这被认为是分化时间线上的第1天(图2a-b)（感染倍数=100），并补充RA（2µmol/l）、forskolin（5µmool/l）、SHH（500 ng/ml）和B27（0.2%）。在第4天，NPC以类似的感染多重性被感染了一段额外的时间，并补充了上述相同的因子。

肌管共培养实验。C2C12细胞在10%马血清中分化以诱导肌管形成。然后将MNs镀至肌管单层，并在共培养1周内显示神经肌肉突触。

免疫细胞化学和碱性磷酸酶活性染色。细胞被显示的抗体染色补充表S1所有图像均使用蔡司LSM510-META共焦激光扫描显微镜（纽约州桑伍德蔡司）拍摄。使用碱性磷酸酶活性试剂盒（Millipore）对碱性磷酸酶进行染色。

电生理记录.从hESC衍生的MN进行全细胞补丁记录Hb9:：招标书当用内部溶液（115 mmol/l葡萄糖酸钾、4 mmol/l氯化钠、1.5 mmol/l氯化镁）填充时，将记录微量移液管的尖端电阻拉至2–4 MΩ₂，20 mmol/l HEPES和0.5 mmol/l EGTA，pH 7.3），并放置在浴溶液（115 mmol/l-NaCl，2 mmol/l-KCl，10 mmol/l-HEPES，3 mmol/l-CaCl₂、10 mmol/l葡萄糖和1.5 mmol/l氯化镁₂pH值7.3）。使用EPC10放大器进行记录（HEKA Instruments，Southboro，MA）。信号在3 kHz下过滤，在20 kHz下采样。全细胞电容得到了完全补偿，而串联电阻没有得到补偿，但在实验过程中，通过电容电流的振幅对5-mV脉冲进行监测。对于电流灯记录，在没有电流注入的情况下将细胞保持在水平以观察静息膜电位和自发放电，或者在当前步骤协议之前通过电流注入将细胞保持为−60 ~−70 mV水平。对于电压灯记录，在执行电压步进协议之前，将电池固定在−70 mV。所有记录均在室温下进行。

补充材料 图S1。HSF-6 hESCs的核型为46XX。图S2。HSF-6人胚胎干细胞系显示多能性标记。hESCs显示碱性磷酸酶（AP）活性（a）、多能性基因表达谱（b）和多能性转录因子表达，如OCT3/4、NANOG、SOX2和表面抗原SSEA-4（c）。所有刻度条均等于100μM。图S3。HSF-6 hESCs通过祖细胞中间产物向MN方向转运。免疫细胞化学分析从表达OTX2（红色）和NCAM（绿色）的hESCs分化的NPC。添加RA/SHH后，祖细胞表达PAX6（红色）和OLIG2（红色）。还检测到NGN2（红色），它在早期MN祖细胞中表达，并与SMI31（绿色）共定位。细胞后MNs表达ISL-1（红色）和LHX3（红色），这两种蛋白与CHAT（绿色）共定位。所有刻度条均等于50μM。图S4。腺病毒转录因子Ngn2、Isl-1和Lhx3可感染hESC衍生的NPC。腺病毒感染后Ngn2、Isl-1和Lhx3的免疫细胞化学分析呈红色并与DAPI融合。所有刻度条均等于50μM。图S5。N.I.L.诱导的MN表达HB9和CHAT，并在iPS系4和5中与核染料DAPI合并的同一细胞中共定位。比例尺等于50μM。表S1。本研究中使用的所有抗体和引物序列。

致谢

参考文献