综合双杂交分析探索酵母蛋白质相互作用体

摘要

基因组项目揭示了我们基因组中的许多新基因以及模式生物和一些独特的微生物(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Enterez/Genome/main_genomes.html).然而，基因组测序揭示的绝大多数基因对它们的具体功能一无所知。我们没能预测几乎一半的基因甚至在大肠杆菌和酿酒酵母,它们在分子遗传学中被广泛研究(1,2). 它因此，显而易见的是，除了结构分析之外需要充分利用基因组数据，因此具有功能性基因组学是通过使用各种系统方法启动的。

揭示基因功能最直接的努力之一是它们的系统性破坏，通过同源微生物中的重组酿酒酵母和枯草芽孢杆菌(三,4)尽管功能上是通过RNA线虫的干扰隐杆线虫病雅致(5,6). 然而，首次发现的基因通过这些传统模式生物的基因组项目那些逃过了各种表型筛选或其他无法通过基因途径进行追踪。因此，这是可以想象的只有一小部分这种突变体显示出不同的细胞表型，除非将新的检查引入系统屏幕。

在这种情况下，更有希望的是对生物分子，如mRNA、蛋白质和代谢物。目前最有效的方法是转录组分析或表达基于微阵列或DNA芯片技术的分析(7).各种条件下基因表达数据的积累允许人们将基因分为不同的类别，每个类别共享一个独特的表达式配置文件，并且可能在同一个配置文件下监管机制。特征明确的基因的功能将深入了解同一组中的新奇作品。

请注意，尽管表达式分析功能强大，但它本质上是一种生物过程的间接测量。更精细的信息将通过蛋白质分析获得就其本身而言，其中实际上具有多种生物功能(8). 这里应该有一个记住，任何蛋白质都不能执行其功能，除非它与其他生物分子相互作用。特别是，与其他蛋白质极为重要，可以作为功能预测的信息提示：物理联想在一种新的蛋白质和一种特性良好的蛋白质之间很容易表明前者具有与后者相关的功能。因此，蛋白质-蛋白质相互作用的综合分析构成功能基因组学的组成部分(8).

然而，与核酸相比，蛋白质的性质是如此从一个变量到另一个变量，全基因组探索其任何一种方法都不能完全实现交互。它很明显，各种互补方法应该完成蛋白质相互作用图。这个似是而非的方法可以分为两类：自上而下蛋白质组方法和自下而上的基因组方法。前者是以天然蛋白质的质谱分析为代表主要通过亲和捕获纯化复合物(8). 后者是在感兴趣的基因组中编码每个蛋白质的方法是表达为检查相互作用。这些包括酵母双杂交系统、噬菌体展示、蛋白芯片等。在这些基因组方法中，酵母双杂交系统(9)是目前是唯一一个在全基因组规模。例如，我们启动了一个大型芽殖酵母的双杂交分析酿酒酵母通过开发一个全面的筛选系统来检查its编码的≈6000个蛋白质之间的所有可能组合全序列基因组(10). 我们试点阶段项目的结果是以及其他人的(11)已经清楚地证明了可行性和方法的力量。

在这里，我们完成了系统分析，以提供一个双杂交数据集，与其他人的数据集一起扩展了我们对假定的蛋白质-蛋白质相互作用的认识发生在芽殖酵母中。这些成对积累或二进制相互作用揭示了各种有趣和/或意想不到的现象蛋白质的联系，从而提供了可测试的假设和有用的许多新蛋白质的功能提示。比较这两项工作也阐明了大规模双杂交蛋白相互作用图谱，从而给出对于涉及其他生物的类似项目来说，这是宝贵的经验教训。

材料和方法

描述了综合双杂交筛选系统(10)并简要总结如下。我们通过PCR扩增每个ORF使用Pfu公司DNA聚合酶并克隆到pGBK-RC，a Gal4基于DNA结合域的诱饵载体和pGAD-RC，Gal4激活基于域的猎物载体。我们确认所有这些质粒都带有使用菌落PCR和琼脂糖插入预期大小凝胶电泳。通过我们独特的转换过程，使用96个平皿，将每个诱饵质粒导入垫子一双杂交应变PJ69–2A轴承镀锌2∷ADE2型和镀锌1∷HIS3型报告基因(12). 同样，我们转换了一个垫子α双杂交菌株MaV204KSPAL10系列∷URA3公司和UASGAL1公司∷HIS3型记者(13)，与个人猎物质粒。每个转化子都培养在平底96孔板，其填充有适当的液体介质。之后即使在没有报告基因的情况下，也要删除激活报告基因的克隆在所有相互作用的伙伴中，每个盘子里剩下的都被收集起来放入一个管道中，形成一个用于筛选的池：因此每个池都是包含多达96个独立克隆的等体积培养物混合物。由于一些ORF对PCR扩增或克隆不起作用，我们最终为诱饵和猎物准备了62个水池，从而覆盖了≈95%的出芽酵母ORF。

为了检查池之间所有可能的组合，我们执行使用多样品过滤总共3844个交配反应收集诱饵和将克隆捕食到Millipore HA膜上，细胞可以在膜上伙计。交配后，选择形成的二倍体细胞用于激活ADE2型,HIS3型，以及URA3公司报告基因。阳性菌落被重新插入另一个补充了5-溴-4-氯-3-吲哚-α-d日-吡喃半乳糖苷确认三个报告基因的激活内源性的MEL1公司基因，另一个目标转录因子Gal4。然后对选定的克隆进行带有pGBK-RC克隆位点两侧引物的集落PCR和pGAD-RC。对于难以直接扩增的克隆我们从菌落中分离出质粒DNA作为模板PCR。直接读取扩增插入物以获得序列标签，随后受到爆炸搜索以解码交互。

检索每个蛋白质的描述和各种数据来自酵母蛋白质组数据库（YPD）（参考。14,http://www.proteome.com/databases/index.html). 的数据直系图和表达相似性之间的相互作用是检索自相互作用蛋白质数据库（参考。15,网址：http://dip.doe-mbi.ucla.edu/)和生物分子关系信息传输与表达数据库(http://www.genome.ad.jp/brite网站/)京都基因百科全书和基因组(16)分别是。支持已经描述了交互网络建模(17).

结果

完成综合双杂交筛选。

我们克隆了几乎所有的酵母ORF作为DNA结合物a中的域融合（bait）垫子一应变和激活域融合（猎物）垫子α应变和将它们细分为池，每个池包含多达96个克隆（图。​（图1）1) (10). 我们最终为诱饵和猎物，并在所有可能的情况下相互交配3844（=62×62）组合。交配形成的二倍体细胞，每个人都携带一对诱饵和猎物，被放在媒体上缺乏腺嘌呤、组氨酸和尿嘧啶来选择克隆同时激活三个报告基因，ADE2型,HIS3型，以及URA3公司（图。​（图1）。1). 幸存者然后将初选转移到第二种媒体不仅再次确认了三名记者的激活，而且检查内源性MEL1公司,另一个由Gal4调节的基因。因为这四个基因中的每一个都有一个独特的Gal4应答启动子，由偶然的启动子特异性激活，偶尔发生在双杂交筛选(12)，将最小化。生长和颜色这个培养皿因克隆而异：一些克隆生长良好，但脸色苍白(即弱MEL1公司感应）或微红色（即，弱ADE2型诱导）而其他人表现缓慢生长但呈深蓝色。报告基因的这种差异激活基因使得很难估计每种相互作用的强度。

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图1

综合双杂交分析大纲。我们几乎克隆了所有酵母ORF单独作为DNA结合域融合（诱饵）垫子菌株和作为激活域融合（猎物）一垫子α应变，然后将其分为池，每个池包含96个克隆。这些诱饵和猎物克隆池系统地相互交配，形成二倍体细胞选择同时激活三个报告基因(ADE2型,HIS3型，以及URA3公司)然后进行序列标记以获取IST。

使用上述选择策略，我们最终获得15523个阳性克隆。接下来我们扩增了质粒的插入物在每一个阳性克隆中同居并使其接受直接测序以获得相互作用序列标签（IST），一对标签诱饵和猎物的顺序（图。​（图1）。1). 因此，13754个IST从15523个克隆中获得（表​（表1）。1). 消除冗余和低质量IST在3278个中留下了4549个独立的双杂交相互作用总蛋白质（表​（表1）。1). 所有这些数据都可以在http://genome.c.kanazawa-u.ac.jp/Y2H.

表1

综合双杂交概述筛选

配对反应	3,844
组合应为检查	～3.5×107
阳性菌落	15,523
信息技术服务	13,754
独立的双杂交相互作用	4,549
超过2次IST点击	1533年
3次以上IST命中（核心数据）	841

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与其他大型双杂交项目的比较。

我们将我们的数据与Uetz的数据进行了比较等。(11)，其中还包括高通量IST方法揭示的交互。首先，我们检查了在每个数据集，可以指示屏幕质量。他们获得了691对蛋白质，其中88对（即12.7%）已知根据YPD，相互作用或发生在同一复合体中(14)（表​（表2）。2). 我们的数据子集发现三次以上的IST点击率与已知的相似相互作用（即12.5%），但要远远大于它们的相互作用。我们指定该子集由841个相互作用组成，涉及797个蛋白质作为核心数据。

表2

两种全基因组IST的比较项目

数据集	总计相互作用	已知交互*(%)
乌埃茨等。(11)	691†	88 (12.7)
本研究
超过2次IST点击	1,533	128 (8.3)
超过3次IST点击（核心数据）	841	105 （12.5）

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^*YPD中描述的内容(14)和以前一样已知在同一复合体中关联或发生。 

^†在Uetz等。(11)，总计IST方法显示的相互作用数量据称为692，而他们的列表包含691个交互。 

接下来，我们研究了这两个数据集是如何相互重叠的（图。​（图2）。2). 出乎意料的是，重叠相当小；假设我们的核心数据和他们的核心数据具有类似的质量（参见仅分享141个互动，分别占16.8%和20.4%前者和后者。正如所料，分数这两个项目共享的数据显示相互作用（即28.3%）。

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图2

大型双混合项目结果之间的重叠。维恩酒店图表显示了我们分析的核心数据和通过高通量IST分析和蛋白质获得的Uetz的数组方法等。(11).

生物有趣子网络示例。

谨慎使用这些数据，我们可以构建具有生物吸引力的蛋白质相互作用网络模型。例如，假设网络如图所示。​图3三A类是由已知在自噬过程中起作用的蛋白质组成(21). Apg7和Apg10这两种蛋白质催化Apg12到Apg5，并且假设该共轭物进一步多重化通过Apg16的行动。它也部分地揭示了另一种选择途径包括Apg3/Aut1和Apg8/Aut7。因此，这种相互作用网络与潜在的分子机制吻合良好自噬。此外，我们观察到与Apg16和Mec3之间的多个IST点击，Mec3是G公司₂DNA损伤后被捕在其他大型项目中检测到(11). 这种互动可能表明自噬和细胞周期之间存在意想不到的联系控件。

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图3

生物学上有趣的交互网络。三个子网由参与自噬的蛋白质组成(A类),主轴极体功能(B类)和囊泡运输(C类)如图所示。箭头指示每一种双杂交的相互作用，从诱饵开始到猎物。黑色卵形表示功能未知的假想蛋白质带有白色字母。

一个网络，包含主轴极体和影响其功能的蛋白质如图所示。​图3三B类，一个其中一部分已经出现在我们的试点阶段(10). 基于交互方案，我们已经指出了纺锤体极体功能中的假想蛋白Ydr016c(10).事实上，最近有报道称该蛋白定位于核内纺锤体和纺锤体极体这种重要基因的温度敏感突变芽和短有丝分裂纺锤体(http://genome-www4.stanford.edu/cgi-bin/SGD/locise.pl？基因座=DAD1）。该基因现在被指定为数据采集1对于Duo1和大坝1互动。本案例提供了另一个示例，演示了交互作用分析在基因功能预测中的作用具有多个相互作用伙伴共享不同功能的蛋白质当然也参与了同样的生物过程。值得注意的是网络还包含另一个重要基因的产物，YKR083C型目前对其功能缺乏任何线索。它很容易检查突变体中纺锤极体的缺陷这个新基因。

图中的大型网络。​图3三C类涉及许多已知的蛋白质在囊泡转运过程的膜融合步骤中发挥作用。该网络在我们的试点阶段已经部分被发现，包括Yip1和Yif1之间的相互作用(10). 事实上，这两种蛋白质最近证实在高尔基体膜上形成紧密复合物在囊泡对接和融合之前发挥重要作用(22). 完成双混合分析后通过加入类似的额外蛋白质来扩大网络功能类别和未知功能类别。请注意观察到二进制相互作用箭头的复杂交叉这些新的蛋白质（图。​（图3三C类)，这可能表明可能存在迄今尚未确定的多蛋白复合物在囊泡运输过程中起作用。

讨论

大规模的双混合分析是目前唯一可行的综合交互映射方法(19,25,26). 它的力量在本研究和其他研究中得到了很好的证明(10,11,18,23,24). 系统交互映射提供了各种假设具有生物吸引力和/或意想不到的网络，如以从我们的数据中提取的数据为例（图。​（图3）。三). 这些网络提供可测试的假设，最终将改进我们的将细胞理解为分子机械。这种假设网络或蛋白质复合物也是最合适的蛋白质组学分析的靶点(8).

另一方面，本研究表明了大规模双混合方法。两个独立的数据项目未能在很大程度上重叠（图。​（图2）。2). 这么小的原因重叠还不清楚，但有一些可能解释。首先，这两个项目都使用了PCR-扩增ORF和一些它们将不可避免地发生突变，从而消除相互作用。第二，每个项目都使用了独特的质粒结构影响杂交蛋白的折叠：一些在我们的收集但不在Uetz的收集中等. (11)和老虎反之亦然。然而，不可能预测或检查每个约12000个杂交蛋白。第三，战略和严格性两个项目的选择不同。当我们使用三个报告基因和多拷贝两个杂交质粒，Uetzet（等）铝.使用了单个报告器和低拷贝向量。第四，两者筛分明显没有饱和。我们观察到一些大屏幕上没有显示的交互可以是使用我们的构造以一对一的方式进行分析时检测到。最后，报告基因的随机激活，或多或少是固有的到两个混合系统，生成虚假信号，该信号将显示为每个项目独有的低命中率IST。

这些结果表明，任何一个IST项目都很难完成。对于蛋白质相互作用组的探索最好有几个独立的IST项目使用不同的构造并组合其结果。同样重要的是整合大规模替代方法的结果双杂交分析，基于蛋白质阵列的方法敏感但相当慢(11).

当然，这些大规模的方法有各种局限性双混合方法本身固有的。最严重的问题将是其可靠性：双混合动力系统通常被称为显示出许多假阳性或生物学上无意义的信号。情况如何我们的综合数据可靠吗？为可靠性，我们分析了由841个交互作用组成的核心数据（表​（表1），1)，其中包含两个来自该数据集的“命名”蛋白质。因为大多数这样命名的蛋白质至少与最低功能性相关描述，它们之间的交互将允许我们评估互动的相关性。在415个相互作用中，103个是之前显示在同一个复合体中由根据YPD，常规研究。因此，我们检查了每个剩余312个相互作用，并且发现有85个可能发生，从蛋白质的功能来看。此外，此数据集包含24种新型同型或寡聚体相互作用。因此，我们假设核心数据集中一半以上的交互是生物相关性。

另一方面，一些假阴性是显而易见的。我们的对储存在YPD中的两个混合相互作用数据的分析表明虽然提供了大量新颖的交互两个混合项目未能重述高达约90%的传统的双杂交相互作用研究。请注意，这种低覆盖率不仅是由于筛选深度不足和潜在的错误折叠或突变消除了相互作用，但也由于全长蛋白质，通常掩盖了相互作用(10,27). 越来越明显的是，在许多在这种情况下，交互表面通常会被屏蔽，并且只会暴露出来当激活信号，如磷酸化或变构效应物时结合，诱导其中一个或两个的构象变化蛋白质。

揭开这种互动的一个看似合理的方法是屏蔽使用预选诱饵的零碎猎物库特定功能或结构的基础。例如用诱饵对片段猎物库进行彻底的双杂交筛选参与RNA剪接的研究揭示了许多新的相互作用使用全长ORF的全基因组方法未能做到检测(23,24). 类似地，计算导向屏幕瞄准卷取线圈之间关联的综合分析发现了许多交互，除了一个之外，其余都没有全基因组方法检测(28). 我们还执行了一个高质量基因组文库的筛选(12)使用所有酵母Src同源3结构域和WW结构域作为诱饵来鉴定许多新的交互作用（T.I.，未发表的结果）。

然而，此类放映的成功与否完全取决于诱饵的设计：一些诱饵可以复制以前报道的所有诱饵互动，而其他人根本没有。不幸的是，无法判断应使用哪些边界来确保正确每个域的折叠。理想情况下，应同时使用诱饵和猎物各种截短的形式，以最大限度地提高正确折叠的机会因此成功的相互作用，尽管要检查的组合显然会在这样的屏幕上爆炸。因此，在实践中利用全长ORF和多种定向ORF进行全基因组筛查应采用使用传统碎片库的方法作为继续探索蛋白质的一部分互动。

为了揭示尽可能多的交互类型，还可以有效地使用其他双杂交方法，包括细菌系统，即基于RNA转录重建的系统聚合酶III、Ras信号通路和泛素功能（参见参考文献。29查看）。蛋白质芯片等新兴技术(30)或a蛋白质复合物的高通量质谱分析(8)同时将大大扩展我们对蛋白质相互作用组的认识。

这些大型项目极大地增加了数据库中假定的蛋白质-蛋白质相互作用的数量。这些数据的集成导致了一个涉及大多数蛋白质，这很可能表明蛋白质之间的串扰，但太大，无法解释（表​（表3）。三). 其他人也注意到如此庞大的网络，尽管他们使用了包含传统研究和大规模研究揭示的相互作用屏幕(31,32). 虽然我们的分析表明，巨大的集群不是大规模分析所固有的，它可能是人为的由于纳入低质量的双杂交数据而过度扩展（表​（表3）。三). 因此，借助于生物信息学是必要的。各种方法可能从如此庞大的网络中获取有用的信息。例如，可以根据指定的功能类别为每个节点上色。或者，只有为特定功能预先选择的蛋白质用于网络建设，尽管这种限制可能很好错过了一个完全出乎意料的发现机会。仔细编辑网络模型对于得出值得进一步研究的假设至关重要因此，生物信息学工具可以支持这样一个这个过程将变得越来越重要。

还应该记住，当前的网络模型是完全缺乏空间和时间分辨率。几个不同的共享共同蛋白质成分的复合物可能被人为连接彼此之间生物信息学。为了避免这种情况，我们必须收集每种天然蛋白质复合物的结构数据及其时空发生。了解数量也很重要相互作用的方面：每个蛋白质的实际比例是多少参与复杂的形成？这种交互分析将遵循蛋白质相互作用组研究中的编目阶段。此外，要了解每种交互作用的生物学，必须检查其中断的影响（即交互目标）。这个交互的编目、分析和目标确定最终将允许绘制一个真正实用的动态地图蛋白质与蛋白质的相互作用无疑会引导我们迈出一步促进对细胞作为分子的全面理解系统。

致谢

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脚注

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