公共科学图书馆一号。2011; 6（10）：e25357。
使用靶向LC/MS/MS对福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织的代谢组学分析：在肉瘤中的应用
,1 ,2 ,2 ,三 ,#1,4和#2,4,*
安德鲁·凯利
1美利坚合众国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心肿瘤/血液科肉瘤项目
苏珊娜·布雷特科普夫
2美国马萨诸塞州波士顿Beth Israel女执事医疗中心信号传输部
Min Yuan女士
2美国马萨诸塞州波士顿贝斯以色列女执事医疗中心信号转导部
杰弗里·戈德史密斯
三美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心病理学系
迪米特里奥斯·斯宾佐斯
1美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗中心肉瘤项目血液学/肿瘤科
4美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院医学系
约翰·M·阿萨拉
2美国马萨诸塞州波士顿Beth Israel女执事医疗中心信号传输部
4美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院医学系
查德·克里顿，编辑器
1美利坚合众国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心肿瘤/血液科肉瘤项目
2美国马萨诸塞州波士顿Beth Israel女执事医疗中心信号传输部
三美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心病理学系
4美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院医学系
美国贝勒医学院
#贡献均等。
构思和设计实验：AK JA DS。执行实验：SB MY。分析数据：AK JA DS。贡献的试剂/材料/分析工具：JG。论文撰写人：AK JA DS JG。
这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了适当的信任。
- 补充资料
图S1：
使用在肿瘤和健康组织中检测到的差异显著的代谢物进行路径富集分析总结。有效p值为红色，而不太有效的p值为黄色或白色。（畅通节能法）
GUID:F02DED75-B9E4-4EE7-AA7D-28E6D1AC88F1
图S2：
样本的无监督表型差异。A） 使用中值归一化数据对肿瘤和健康组织样本进行层次聚类和B）主成分分析。（畅通节能法）
GUID:F5DE9CE6-E393-45A2-8F3F-1268FD16FB57
图S3：
通过筛选标准的119种代谢物代表的途径表。标记为“命中”的列表示我们从每个途径检测到的代谢物的数量，而标记为“总数”的列表示该过程中中间体的总数。（畅通节能法）
GUID:1CE0DAF5-1AF2-4AB0-9F93-A9251D30D9D5
图S4：
路径表示摘要。上图以粗体显示了我们有力检测到的代谢物，这些代谢物涉及A）糖酵解、B）磷酸戊糖途径、C）柠檬酸循环和D）谷氨酸代谢。（TIF）
GUID:CDF590EE-0975-41D4-9FAB-AE631756C9FD
表S1：
完整总结每个部分注射之间的成对相关性。每个部分包括三次LC/MS/MS注射的所有成对皮尔逊相关系数（ρ）。截面用样本号表示。截面号_tumor/正常状态；因此，样本5中肿瘤对的第一个切片将表示为：“样本5.1肿瘤”（文件）
GUID:72B30A38-4E9B-449F-8668-B944326CB0B9
摘要
肿瘤代谢组学这一相对较新的领域试图确定各种癌症表型与全球代谢物含量之间的关系。以前的代谢组学研究使用核磁共振波谱或气相色谱/质谱，并分析尿液和血清中的代谢物。然而，肿瘤组织的直接代谢组学评估对于确定癌症中的代谢改变很重要。在这方面，从档案标本中获得可靠数据的能力是可取的，迄今为止尚未有报道。在这项可行性研究中，我们证明了从十个福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本中直接提取的极性代谢物的分析，包括五个软组织肉瘤和五对正常标本。通过选择性反应监测（SRM）使用靶向液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS），我们在样品中平均检测到106种代谢物，具有良好的再现性和同一样品不同部分之间的相关性。无监督的层次聚类和主成分分析可以可靠地恢复先验的已知肿瘤和正常组织表型，并通过监督分析确定文献支持的候选代谢标记物。此外，我们发现各种生化过程在检测到的代谢物列表中有很好的代表性。我们的研究支持这样一种观点，即从FFPE软组织肉瘤标本中可以获得可靠且信息广泛的代谢组学数据，这一发现可能会扩展到其他恶性肿瘤。
介绍
代谢组学是对不同生理环境、组织类型或细胞的代谢产物库的研究[1],[2]与基因组学、转录组学或蛋白质组学类似，它在寻求生物标记物发现方面具有巨大的前景，特别是在肿瘤学方面，因为根据Warburg效应，癌细胞的代谢状态发生了改变[3].
在SRM模式下执行LC/MS/MS或核磁共振波谱（NMR）的低每样本成本使得代谢组生物标记物研究特别具有吸引力[4]近年来，这两种技术，特别是质谱技术的敏感性和特异性都有了显著提高，导致发表了许多研究，主要是分析尿液和血清样本[4]虽然这项工作提供了临床有用的信息，但该领域的一个缺点是缺乏对组织代谢物的研究[5]研究表明，肿瘤微环境对细胞施加了不寻常的压力，导致细胞能量生产和利用的转变。糖酵解速度在肿瘤中增加，导致乳酸水平升高，由于谷氨酰胺降解加剧，在各种恶性肿瘤中也观察到丙氨酸和铵的高浓度[6]–[8]因此，有理由相信，研究肿瘤组织样本中的生化中间产物和最终产物将提高我们对癌症生物学的理解。
与其他“组学”领域一样，代谢组学将从利用常规医疗过程中获得的福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织样本的能力中受益匪浅。由于其广泛可用性和长期稳定性，准确分析这些肿瘤样品的代谢物含量可以加快临床有用代谢组生物标记物的发现速度。
虽然有基于LC/MS/MS的代谢组分析的文献，但据我们所知，还没有关于使用FFPE组织的出版物[1],[2],[9],[10]在这项初步研究中，我们检查了使用靶向LC/MS/MS来对FFPE样本进行剖面分析的技术可行性和再现性。我们检查了通过代谢物含量可以区分恶性组织和非恶性组织的程度，并评论了生物化学过程的多样性。这项工作的结果表明，对存档癌症标本进行代谢组学研究可能会产生可靠的数据，并有助于研究人员识别具有临床和生物学意义的生物标记物。
结果
研究工作流程
中的流程图总结了LC/MS/MS协议，并在材料和方法部分提供了完整的方法描述。我们通过LC/MS/MS分析了一组五个福尔马林固定、石蜡包埋的软组织肉瘤标本和五对正常组织标本。有关标本年龄和组织类型的详细信息，请参阅所有石蜡块都含有来自外科切除手术的组织。这些标本均来自2004年、2005年或2006年，其中一名患者在手术前接受了放疗和化疗。由于本研究旨在证明数据采集的可行性和可靠性，除组织类型外，未考虑其他临床变量。为了评估生物再现性，我们对每个石蜡块的两个独立切片进行了LC/MS/MS分析。此外，对于每个部分，我们进行了三次独立注射，以确定分析再现性。
表1
样本队列的特征。
| 样品 | 年份 | 正常组织类型 | 肿瘤类型 |
| 1 | 2005 | 纤维蛋白糖组织 | 高级肉瘤，肌源性分化 |
| 2 | 2005 | 静脉 | 高级平滑肌肉瘤 |
| 三 | 2006 | 纤维蛋白糖组织 | 单相滑膜肉瘤 |
| 4 | 2005 | 骨骼肌 | 双相滑膜肉瘤 |
| 5 | 2004 | 皮肤和皮下脂肪组织 | 分化良好的脂肪肉瘤 |
代谢物检测
在获得原始数据后，我们观察到，在SRM筛选的249种化合物中，在样本中稳健检测到的独特代谢物数量从74到143个不等，平均值为106，代表了几种代谢途径。有趣的是，肿瘤样本中的代谢物检测率呈上升趋势。与使用同一平台对新鲜冷冻组织进行的无关实验结果相比，这些数字大约低40%，这在分析经过严格处理和老化的标本时是可以预期的。由于我们研究中患者的冷冻组织不存在，因此我们无法与FFPE数据进行直接比较，然而，在新鲜肿瘤组织中，我们可以常规检测到近200种跨中枢通路的具有强大信号的代谢物，包括氨基酸。虽然本研究中氨基酸的检测水平较低，但在我们的数据集中最常见的是酸性的，在生理pH值下带正电荷。在60次跑步中，有55次出现精氨酸，这进一步说明了这一点，因为人们应该预计具有最高侧链pKa的氨基酸在甲醇中极易溶解。我们还分别在六个样本和十个样本中的五个样本中至少一次检测到谷氨酸和组氨酸。形式电荷是否影响化合物提取超出了本文的范围，但这些观察结果提供了在我们的提取方案中可能保留或丢失的化合物类别的具体指示。
再现性评估
为了评估质谱仪不同进样的技术一致性，我们计算了每个FFPE段三次进样的每一对相关系数，仅排除了所有三个段中都不存在的代谢物。正常组织和肿瘤组织的这些值一直很高，这表明同一样品制剂的注射之间几乎没有变化。这些相关系数的范围为0.9373至0.9998，很少低于0.9900(). 这些完整的数据可以在表S1接下来，我们计算了每个FFPE块两个截面的平均峰值强度之间的相关系数。尽管低于注入之间的值，但它们仍然表明来自同一区块的两个区段具有高度一致性，大多数相关性高于0.9000。综上所述，我们可以断言，从FFPE组织样本生成的LC/MS/MS数据在相同样品制剂的不同注射和不同FFPE切片中是可重复的。上述分析总结见值得注意的是，在我们分析的这一部分中，没有进行归一化或缺失值插补，因此此处测量的一致性反映了原始LC/MS/MS数据的一致性。
技术性能总结。A、 B）显示了同一FFPE块不同截面MS峰值强度之间的相关性示例。C） 生物复制相关系数的表示。补充材料中提供了包含所有相关信息的完整表格。
已知表型之间的差异
在进行技术再现性评估后，我们排除了60个LC/MS/MS实验中80%以上缺失的任何代谢物。然后，将剩余的缺失值替换为等于数据中最小测量值一半的值，并按照方法部分中的描述进行标准化。使用标准化数据，我们检查了肿瘤/正常配对中的代谢物含量。假设在五种肉瘤亚型中存在更高程度的代谢失调，我们计算了所有样本中所有检测到的代谢物的方差，并假设数据在肿瘤中更加分散。证实了我们的假设，肿瘤标本中代谢物峰值强度的方差显著高于正常标本（肿瘤中平均代谢物方差高24.8%，P<0.05）。
在确定了肿瘤队列中全球代谢物含量的异质性之后，我们尝试使用无监督的层次聚类来研究肉瘤标本是否会从正常配对中分离出来。基于119个通过上述筛选标准的代谢物，我们观察到肿瘤与正常标本分开，只有一个例外。树状图显示在结果显示，一组包含四个肿瘤和一个正常标本，而另一组包含4个正常组织标本和一个肿瘤。我们假设队列的配对性质可能阻止了样本3和样本5的分离，因为来自同一患者的肿瘤和正常组织样本的代谢物含量可能非常相似。对病理报告的进一步检查显示，含有患者3正常组织的石蜡块被一些肿瘤组织污染，我们认为这可能是患者3样本配对特别难打破的原因。因此，层次聚类的结果表明，可以根据FFPE组织的LC/MS/MS数据进行有意义的表型区分。
样本的无监督表型区分。A） 使用119个通过筛选标准的代谢物集合的数据进行层次聚类和B）主成分分析。在上图中，肿瘤标本为红色，正常标本为绿色。
作为非监督分类的另一种方法，我们对队列进行了主成分分析（PCA）(). 在层次聚类中观察到类似的现象，肿瘤和正常标本在第一主成分中分离，但两个样本除外。
不同丰度代谢物的探索
我们试图阐明肉瘤标本和正常标本中哪些代谢产物的差异最为丰富。为此，我们对微阵列（SAM）进行了学生t检验和显著性分析。这两种方法产生的代谢物大多重叠，如总的来说，我们在两组之间检测到八种不同的差异丰富的代谢物，这说明了检测FFPE组织样品中生化中间产物差异的能力。尽管样本量较小，但值得注意的是，这一简短列表中的代谢物，如cyclic-AMP，已经证明在肿瘤中发生了改变。
表2
通过微阵列显著性分析和学生t检验确定不同丰富的代谢物。
| SAM代谢物 | D值 | P值 | T-Test代谢物 | P值 |
| 磷酸氨苄酯 | 3.1031 | 0.013193 | 胞嘧啶 | 0.015548 |
| 化学机械加工 | 2.8751 | 0.020588 | Ng，Ng-二甲基-L-精氨酸 | 0.023861 |
| 磷酸核糖 | 2.8668 | 0.020756 | 烟酰胺 | 0.027013 |
| 胞嘧啶 | 2.7854 | 0.024622 | 环-AMP | 0.027947 |
| 环-AMP | 2.4982 | 0.037059 | | |
| DL-哌啶酸 | 2.301 | 0.04916 | | |
为了证实这个列表的相关性，我们进行了监督分层聚类()和PCA()仅使用这些代谢物的LC/MS/MS峰值强度，实际上，我们观察到肿瘤/正常对的分离。
监督样本的表型差异。A） 利用t检验或SAM确定的差异显著丰富的代谢物子集的数据，对肿瘤和健康标本进行层次聚类和B）PCA。
FFPE组织中保存了多种生化中间体
考虑到FFPE组织的治疗条件，人们可能会合理地担心LC/MS/MS回收的代谢物可能会限制对相对较少的途径进行分析，且生物相关性有限。因此，为了确认检测到的代谢物代表了广泛生化过程的保存，我们对119个通过筛选标准的代谢品的整个列表进行了路径富集分析(图S3). 富集分析使用一系列化合物作为输入，并生成一系列已知途径，这些途径以输入代谢物最为典型。使用我们的列表，我们确定了一些潜在的受影响过程，其中许多涉及细胞能量生产，尽管我们看到了广泛的代谢途径。这向我们保证，我们对代谢物的检测并不局限于细胞过程的一小部分，而是涵盖了广泛的代谢活动。有趣的是，一些最具代表性的途径——包括糖酵解、谷氨酸代谢和柠檬酸循环——已在癌症背景下进行了广泛研究。在糖酵解过程中，十一种化合物中有五种被检测到；在谷氨酸代谢中，十八分之九被测定；在TCA循环中，11种化合物中有5种出现在我们的数据中。该富集分析的摘要报告于关于从四种高度代表性的途径中检测到的特定代谢物的其他信息，请参见图S4（4A–糖酵解，4B–磷酸戊糖途径，4C–柠檬酸循环，4D–谷氨酸代谢）。除了上述分析之外，我们还对我们列出的八种不同存在的化合物进行了富集算法，发现涉及cyclic-AMP的细胞内信号过程与其他几种途径一起富集（参见图S1). 与对检测到的化合物的完整列表进行的分析相反，我们在这里检查了与正常样品相比，肿瘤中哪些途径可能发生改变。为了强调这些分析的关键发现，所代表的途径是多样的，这表明在未来的临床研究中，可以使用LC/MS/MS对FFPE标本进行广泛的生物化学过程的可靠检测。
途径富集分析总结。以上显示了信号通路的多样性，在所有119个通过筛选标准的代谢物的基础上进行了丰富。最显著的p值为红色，最不显著的为黄色和白色。
讨论
尽管技术进步，但对肿瘤组织标本进行的临床代谢组学研究相对较少[5]据我们所知，尚未有任何出版物证明从FFPE组织中成功获得基于LC/MS/MS的代谢组学数据。在本研究中，我们表明可以从保存在石蜡块中的软组织肉瘤切片中获得可重复的数据。此外，我们证明了这些数据如何用于探索与表型差异相关的生化中间产物的石蜡队列。
基于LC/MS/MS的代谢组学研究方案的一个问题是样品制备降解潜在代谢物的程度[11],[12]考虑到福尔马林固定和石蜡包埋过程中对组织的损伤，这一挑战被放大了。FFPE组织的局限性包括相关化合物的降解和磨损。例如，研究表明，与冷冻组织提取液相比，FFPE制剂中的mRNA水平显著降低，人们可以合理地预期在研究代谢物时会出现类似的情况[13]因此，从这些具有挑战性的标本中获取可靠的LC/MS/MS数据将是加速翻译代谢组学研究的重要一步。与应用于新鲜和冷冻组织的相同方案相比，我们观察到可检测化合物的磨损程度非同寻常[14；未发表的数据]。然而，我们仍然检测到从FFPE队列中提取的大量极性代谢物。由于本研究中患者的冷冻组织样本不存在，我们无法直接将我们的数据与高质量样本生成的数据进行比较，尽管这个问题值得在未来的工作中进行研究。
导致化合物磨损的其他可能因素包括福尔马林固定过程中的降解、甲醇萃取过程中化合物的损失以及石蜡的低效脱交联，尽管我们无法确定这些因素在多大程度上影响了我们的检测率。
重要的是，当我们检查从我们的方案中获得的原始数据时，我们发现同一样品制剂的不同注射之间几乎没有变化。这使我们确信，样品制备方案可生成含有广泛代谢物的均匀溶液。此外，紧密的相关性表明，各运行之间几乎没有技术差异。然而，对于研究人员来说，同一石蜡块不同切片之间的高度相关性尤为重要。在十个区块中，有七个区块的横截面相关性高于0.95，九个区块的相关性高于0.90。这些结果表明，石蜡包埋组织中代谢物含量的测量可能不受较大采样误差的限制。
评估任何“组学”应用潜在临床研究价值的一个关键指标是检测数据中已知结构和信息的能力。此外，就代谢组学而言，人们对检测到的化合物所涉及的代谢途径的广度感兴趣。能够使用无监督的方法准确地将样本分类为癌性和非癌性，这很好地表明了该应用的价值，也表明至少有一部分被检测的化合物是差异代谢活动的真正指标。值得注意的是，在被鉴定为显著改变的化合物中，cyclic-AMP（通过两种不同的分析方法检测）已被证明与几种致瘤过程有关[15]–[17]此外，与癌症有关的细胞能量学途径，如糖酵解、磷酸戊糖代谢和柠檬酸循环，通过筛选标准的代谢物集合显著代表了这些途径[6]–[8]我们还检测到几种磷酸化代谢产物，这些代谢产物被鉴定为显著改变，这表明磷酸化在石蜡组织中可能比以前认为的保存得更好。综上所述，这些观察结果与现有的癌症文献一致，并表明许多在癌症生物学中至关重要的代谢过程可以使用LC/MS/MS在FFPE组织中进行研究。
总之，我们已经证明了在SRM模式下使用LC/MS/MS从FFPE软组织肉瘤标本中可重复获取代谢组数据。我们的数据表明，涉及更多不同恶性肿瘤队列的更大研究可能有助于进一步确定该方法的可靠性和通用性，并且使用该方法可以在广泛可用的存档标本中成功地研究广泛的临床和生物学问题。
材料和方法
道德声明
这项工作是根据贝思以色列女执事医疗中心（BIDMC）机构审查委员会（IRB）批准的档案组织收集和使用协议进行的。BIDMC的IRB放弃了患者同意书的要求。
FFPE肉瘤标本
福尔马林固定和石蜡包埋的组织样本由贝斯以色列女执事医疗中心病理科取回。肿瘤和正常组织块来自同一患者，在手术切除时获得。对于某些标本，肿瘤和正常组织类型相同。值得注意的是，对于那些没有相关正常组织来源的样本，例如滑膜肉瘤，正常组织样本取自肿瘤块直接相邻的区域。
靶向质谱分析
从十个FFPE块中的每一个块中，丢弃一个40µm的切片，以尽量减少试样的污染。然后将第二和第三个40µm切片放置在两个单独的1.5 mL微型离心管中，这两个试管对应于从每个样品中分析的两个切片。向每片切片中添加1 mL 80%甲醇，并通过涡流混合。然后将切片在70°C下培养45分钟，以熔化石蜡并提取代谢物。接下来，将样品置于冰上5分钟，在冷室中以14xG的速度离心10分钟，然后将上清液转移到新鲜的1.5 mL微量离心管中。在相同条件下重复离心一次，将上清液再次转移到新试管中。样品用SpeedVac隔夜干燥。使用35µL HPLC级水重新悬浮样品以进行质谱分析。使用5500 QTRAP三重四极杆质谱仪（AB/Siex）结合Prominence UFLC HPLC系统（岛津），通过对249种内源性水溶性代谢物进行选择反应监测（SRM），注射10µL，并对样品进行稳态分析。选择监测的249种化合物是因为它们参与了一些恶性肿瘤的重要中枢通路。一些代谢物以正离子和负离子模式靶向，共298次SRM转换。正离子模式下的ESI电压为+4900V，负离子模式下为-4500V。每次SRM转换的停留时间为4ms，总循环时间为1.89秒。每个检测到的代谢物获得大约8-11个数据点。使用4.6 mm i.d×10 cm Amide XBridge HILIC柱（Waters）以300µL/min的速度通过正相色谱将样品输送至MS。梯度从85%缓冲液B（HPLC级乙腈）到35%B，从0-3.5分钟开始；35%B至2%B，时间为3.5-11.5分钟；在11.5-16.5分钟内保持2%B；16.5-17.5分钟，2%至85%；85%B保持7分钟以重新平衡色谱柱。缓冲液A由20 mM氢氧化铵/20 mM醋酸铵（pH=9.0）在95:5的水（乙腈）中组成。使用MultiQuant v2.0软件（AB/Siex）整合每个代谢物SRM过渡的总离子电流的峰面积。LC/MS/MS平台每天使用H929癌细胞的极性代谢物提取物进行质量控制。使用已知的色谱洗脱时间和预期的峰面积强度对选定数量的代谢物进行评估。
技术性能评估
对每个样品每个部分的所有注射对进行技术再现性评估。共有60次LC/MS/MS运行，包括每个样品制备的三次10µL进样。在每对注射之间取皮尔逊相关系数，仅排除三次注射都没有记录到信号的代谢物。然后，对所有代谢物取三次注射的平均峰值强度，并计算同一样品两部分的平均峰值密度的皮尔逊相关系数，仅排除平均值为零的代谢物。检测到的代谢物的平均数量计算为每个样品每个部分所有三次注射的平均值。
过滤和规范化
原始峰值强度上传至Metaboanalyst.ca，这是一个在线免费软件程序，旨在分析代谢组学数据[18],[19]。如果10µL注射液中80%以上没有代谢物，则首先从进一步分析中去除代谢物。我们选择80%的临界值是为了确保我们不排除可能只在一类（肿瘤或正常）中检测到的化合物。剩余的缺失值被计算为原始LC/MS/MS输出中最小正值的一半。在进行统计分析之前，将所得数据通过求和和log2变换进行归一化。合成的峰值强度矩阵包含119种独特的代谢物，用于进一步分析。在某些情况下，LC/MS/MS无法区分异构体；我们故意省略了这些化合物的化学侧基位置指数。为了完整性，我们还尝试通过中值进行归一化，然后进行log2转换，得到了几乎相同的结果（请参见图S2A和B f或分层聚类和PCA）。
层次聚类与主成分分析
使用通过筛选标准的119个代谢物的整个集合，使用皮尔逊相关度量和完整链接进行无监督的层次聚类。根据metaboanalyst界面上的默认设置执行主成分分析。利用t-检验和SAM确定的代谢物联合，使用皮尔逊相关度量和Ward连锁法进行监督聚类。
不同丰度代谢物鉴定
通过学生t检验（p值截止值为0.05）和对δ值为0.4的微阵列进行显著性分析，确定了不同丰富的代谢物。
路径丰富分析
使用119种通过我们筛选标准的化合物，并使用学生t-test和SAM确定的化合物列表的联合进行途径富集（表征）分析。使用的代谢物集库是“代谢途径相关代谢物集合”采用超几何检验进行表征分析。如果输入列表中与代谢途径有关的化合物明显多于随机概率预期的数量，则此算法的输出将标记出由化合物输入列表显著表示的代谢途径。该分析在Metaboanalyst中进行。
支持信息
图S1
使用在肿瘤和健康组织中检测到的差异显著的代谢物进行路径富集分析总结。有效p值为红色，而不太有效的p值为黄色或白色。
（畅通节能法）
图S2
样本的无监督表型差异。A） 使用中值归一化数据对肿瘤和健康组织样本进行层次聚类和B）主成分分析。
（畅通节能法）
图S3
通过筛选标准的119种代谢物代表的途径表。标记为“hits”的列表示我们从每个途径中检测到的代谢物数量，而标记为“total”的列则表示过程中的中间产物总数。
（畅通节能法）
图S4
路径表示摘要。上图以粗体显示了我们有力检测到的代谢产物，它们参与A）糖酵解、B）磷酸戊糖途径、C）柠檬酸循环和D）谷氨酸代谢。
（畅通节能法）
表S1
完整总结每个部分注射之间的成对相关性。每个部分包括三次LC/MS/MS注射的所有成对皮尔逊相关系数（ρ）。截面用样本号表示。截面号_tumor/正常状态；因此，样本5中肿瘤对的第一个切片将表示为：“样本5.1肿瘤”
（文件）
脚注
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
基金：这项工作得到了国家卫生研究院/国家癌症研究所1 K22 CA138716-01A2奖（DS）、5 P01 CA120964-05（JA）和5 P30 CA006516-46（JA）的支持。作者还想感谢Richard博士和Virginia Clemmer博士对Beth Israel女执事医疗中心肉瘤项目的捐赠。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
工具书类
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