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《Oncol杂志》。2011; 2011: 232037.
2011年9月29日在线发布。 doi（操作界面）：10.1155/2011/232037
预防性维修识别码：项目经理1184436
PMID：21977030

热休克蛋白70分子伴侣抑制剂MAL3-101的抗骨髓瘤作用

马克·布劳恩斯坦,1 萨迪夸·斯科特,1 克雷格·斯科特,2, 3, Shannon Behrman公司,4 彼得·沃尔特,4 彼得·威普夫,5 杰里米·科普兰,1 威廉·克里科,1 丹妮尔·约瑟夫,1 杰弗里·布罗茨基,2和奥尔卡·巴图曼1,*
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关联数据

补充资料

摘要

多发性骨髓瘤（MM）是第二常见的血液学恶性肿瘤，并且仍然无法治愈，主要是由于治疗难治性/抵抗性疾病。对此采取合理的做法迫切的挑战是开发新药与现有有效代理人。这种方法将减少毒品浓度，避免处理阻力，以及还可以通过以下方式提高治疗效果针对MM中新的和非冗余的途径。为了达到这个目标，我们检查了抗脊髓瘤MAL3-101的作用非ATP位点热休克抑制剂蛋白（Hsp）70分子伴侣。我们发现MAL3-101表现出抗脊髓瘤对MM细胞系的影响在里面体外和体内在一个异种移植性浆细胞瘤模型，以及原代肿瘤细胞与骨髓内皮细胞骨髓瘤患者的细胞。结合使用蛋白酶体抑制剂，MAL3-101显著增强了在体外和体内抗脊髓瘤作用。这些数据支持临床前的基本原理小分子抑制Hsp70功能，单独或与其他药物，作为一种有效的治疗策略MM。

1.简介

本研究探讨了最近开发的Hsp70抑制剂MAL3-101的细胞毒性作用[1]多发性骨髓瘤（MM）肿瘤生长。多发性骨髓瘤是一种浆细胞的骨髓肿瘤，目前仍无法治愈[2]. 尽管通过高剂量化疗和干细胞拯救，以及硼替佐米、沙利度胺和来那度胺的新疗法，患者的预后显著改善[三,4]多发性骨髓瘤的疾病进展导致因基因突变累积、肿瘤生存期延长和治疗耐药性而导致的死亡率[5,6]. 骨髓微环境的肿瘤增强效应在MM发病和进展中同样重要[7,8]，特别是MM小生境的新生血管增加[9]内皮祖细胞[10]. 然而，蛋白酶体抑制通过中断细胞生存途径而显著影响MM的肿瘤和微环境[8,11——13]. 硼替佐米（PS-341；Velcade）是26S蛋白酶体的一流选择性抑制剂，其强大的抗脊髓瘤作用主要是由于细胞应激反应，其特征是热休克蛋白家族（包括Hsp90和Hsp70）的蛋白酶体亚基和分子伴侣的转录，及其下游肿瘤生长调节因子[8,12,14——20]. 因此，目前正在临床前研究和临床试验中探索阻断分子伴侣对其抗脊髓瘤的作用，无论是与硼替佐米协同作用还是与其他药物联合作用[4,21,22].

MAL3-101抑制Hsp40耳蜗刺激Hsp70 ATP酶活性的能力，从而损害Hsp70细胞的基本功能[1,23]. 我们研究MAL3-101抗脊髓瘤作用的理由是四方面的。首先，在浆细胞中，内质网（ER）中的Hsp70同源物BiP可增强正常和错配免疫球蛋白（IGs）的折叠和分泌，并防止其积聚[24]. 其次，MM细胞中Hsp70表达上调[25,26]和治疗耐药MM细胞系[26]尤其是在接触到抑制蛋白质质量控制机制其他成分的临床有效抗脊髓瘤药物后[27]. 第三，Hsp70基因表达和过度表达与人类癌症相关[28——32]. 第四，抑制癌细胞中的Hsp70通过抑制溶酶体膜通透性触发肿瘤特异性凋亡和细胞死亡，这是应激诱导细胞死亡的标志[33,34]后一种机制是通过Hsp70与溶酶体内阴离子磷脂双（单酰甘油）磷酸盐（BMP）结合来稳定溶酶体，后者是溶酶体膜鞘磷脂代谢的必要辅因子[34].

暴露于硼替佐米以及应用抑制Hsp90伴侣蛋白的17-AAG后，MM细胞中Hsp70基因和蛋白表达上调[11,15,16,18,25,35]. 值得注意的是，Hsp70作用于凋亡途径中的几个节点[16,29,36]因此，它的抑制作用可以克服硼替佐米的不同反应性以及在使用它对抗MM时遇到的副作用[20,22,37]. 反过来，小分子抑制剂对Hsp72的抑制被证明可以增强在体外17-AAG对MM肿瘤细胞凋亡的影响[16,21]. 因此，我们推断MAL3-101可能具有协同作用和增强作用在体外和体内蛋白酶体和Hsp90抑制剂的抗脊髓瘤作用。

根据我们的前提，我们发现MAL3-101对MM细胞（包括原代肿瘤细胞和从MM患者获得的内皮祖细胞）的增殖和存活具有强大的抑制作用。MAL3-101诱导的MM细胞生长抑制的特征是阻止细胞周期进展和激活这些细胞的固有凋亡途径。此外，在在体外MAL3-101与蛋白酶体抑制剂和Hsp90的细胞毒性作用。然后研究了MAL3-101和蛋白酶体抑制对MM细胞生长的协同作用体内异种移植性浆细胞瘤小鼠模型的建立[38]. 这个体内研究再现了抑制肿瘤细胞生长的发现在体外这些数据表明，通过靶向肿瘤及其血管微环境中的Hsp70活性，在不影响疗效的情况下减少增效剂的剂量，抑制Hsp70可以通过增加对抗MM的药物库来改进现有策略，并通过规避治疗耐药性来延长生存期。

2.材料和方法

2.1. 试剂和细胞培养

将MAL3-101和MAL3-51（参见doi:10.1155/2011/232037上在线提供的补充材料中的图S1）、蛋白酶体抑制剂MG-132（加利福尼亚州圣地亚哥A.G.Scientific）和硼替佐米（马萨诸塞州沃本LC-Labs，PS-341）以及Hsp90抑制剂17-AAG（加利福尼亚州圣迭戈Calbiochem/EMD Biosciences）溶解在二甲基亚砜（DMSO；密苏里州圣路易斯市Sigma Aldrich），并在−20°C下储存。控制细胞仅接受载体（0.03%二甲基亚砜）。所检测的MM细胞系为NCI H929、RPMI-8226和U266（ATCC、Manassas、Va）。正常外周血单个核细胞（PBMC）和骨髓（BM）细胞来自StemCell Technologies（加拿大温哥华）。原发性MM细胞和EPC来自知情同意后新诊断患者的骨髓吸出物。MM细胞富集至>95%CD138+根据制造商的说明，使用抗CD138 MACS微球进行阳性选择。内皮祖细胞来源于新诊断患者的骨髓抽吸物，保存在EndoCult培养基（StemCell Technologies）中，并在首次传代时使用，如前所述[39,40]. 如前所述，细胞系、PBMC和BM细胞保存在添加10%热灭活胎牛血清的RPMI-1640中[39,40].

2.2。细胞毒性试验

电池（1×105)100年，被镀成96周的微量滴定板（科斯塔，剑桥，马萨诸塞州）μL的生长培养基，并在指定的时间内暴露于指定浓度的化合物中。对照细胞在相同体积的0.03%二甲基亚砜中培养。所有研究均一式三份，并至少重复三次。根据制造商的指示，通过MTS分析（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）测量存活率。在相同的电镀培养物中，通过台盼蓝染料排除测定细胞活力。

根据制造商的说明，使用Annexin-V-FLUOS染色试剂盒测定对照（DMSO处理）或药物处理细胞的凋亡诱导（印第安纳波利斯罗氏）。简单地说，电池（1×105)在处理后的指定时间点采集，将Annexin V荧光素异硫氰酸盐（FITC）和碘化丙啶（PI）添加到单个样品中，并在黑暗中孵育30分钟。荧光通过FACSort流式细胞仪（BD Biosciences，San Jose，Calif）分析，获得每个样品10000个事件。

2.3. 细胞周期分析

对照组（DMSO处理）和MAL3-101处理的NCI-H929细胞（2×10）的细胞周期分析5)通过PI染色和样品的FACS分析进行评估。分析结果DNA分布中细胞的比例G公司 0/G公司 1和G公司 2/M（M）如前所述，细胞加倍和碎片减法门控后的细胞周期阶段[41].

2.4. 西方印迹法

使用哺乳动物细胞裂解试剂盒（Sigma-Aldrich）制备全细胞裂解物，并通过Western blot分析进行分析。用SDS-PAGE分离等量的蛋白质并将其电转移到尼龙膜上。检测caspase-3（细胞信号技术，丹弗斯，马萨诸塞州）、多聚ADP-核糖聚合酶（PARP；Abcam，马萨诸塞诸塞州剑桥市）和β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich）与辣根过氧化物酶结合羊抗鼠多克隆二级抗体（BD Biosciences，新泽西州富兰克林湖）一起使用。增强化学发光底物（Pierce Biotechnology，Rockford，IL）用于抗体检测。

2.5。XBP1 mRNA剪接的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析

通过SuperScript逆转录酶逆转录的总RNA的PCR扩增（Invitrogen，Carlsbad，Calif.），测定处理后NCI-H929细胞的未剪接（XBP-1u，285 bp）和剪接（XBP-1s，259 bp）XBP-1 mRNA水平。PCR引物（5′-TTACGAGAGAAAAACTCATGGC-3′和5′GGGTCCAACTTGTCCAGAAATGC-3′）侧翼XBP1 mRNA的26-nt内含子，用于PCR扩增Ex Taq公司聚合酶（Takara Bio，Shiga，日本）。

2.6. 人免疫球蛋白轻链酶联免疫吸附试验（ELISA）

分泌和细胞内水平κ和λ根据制造商的说明，使用人类卡帕和兰姆达（结合和游离）ELISA定量试剂盒（德克萨斯州蒙哥马利市贝瑟尔实验室）测定轻链（LC）。从10个样品中获得颗粒和上清液6细胞在无血清培养基中培养过夜。使用Bio-Rad蛋白质测定法（加州Hercules的Bio-Rad实验室）测定细胞颗粒和上清液全细胞裂解液中的总蛋白，每个ELISA中使用500 ng总蛋白。为了解释MM细胞系之间与LCs合成相关的分泌差异，将LC生成量评估为分泌的LC与细胞内LC水平的比例。

2.7. 异种移植物浆细胞瘤小鼠模型

NOD/SCID/IL-2Rγ阴性（NSG）小鼠（42–52天龄）取自Jackson Laboratories（Bar Harbor，Me），并在SUNY Downstate Medical Center动物资源设施的无病条件下进行饲养。这项研究是根据Downstate Medical Center动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行的。用3×10接种小鼠右侧皮下注射7100个NCI-H929细胞μRPMI 1640的L和100μLeBlanc等人描述的Matrigel基底膜基质L（BD Biosciences，Bedford，Mass）[38]. 然后将小鼠分为四个治疗组，每组包含4只小鼠，每只小鼠接受载体（DMSO和PBS），或1 mg/kg PS-341（硼替佐米），或40 mg/kg MAL3-101，或1毫克/kg PS-341,40 mg/kg MAL3-101。所有组均按相同的时间表每周两次进行腹腔注射。在治疗当天，使用卡尺测量肿瘤的最长直径，以使用以下公式估算肿瘤体积：4π/3×（宽度/2）2×（长度/2），表示椭圆的三维体积。当肿瘤达到5.5厘米或坏死时，处死动物；最早的献祭是治疗第20天的一只车用动物。动物研究是独立复制的，并且显示了所有实验的数据。

2.8. 统计分析

通过Student’st吨-测试或由Dunnett的事后（post-hoc）测试遵循显著重复测量的单向方差分析。所有测试都是双尾的，统计显著性设置为P（P）≤ .05. 使用CalcuSyn软件（Biosoft、Ferguson、Mo和Cambridge，United Kingdom）根据Chou-Talalay方法进行等辐射图分析，得出组合指数（CI）值[14].

这个体内研究的组成部分通过两种方法进行分析。首先，使用一般线性模型（GLM）分析浆细胞瘤的生长程度，将肿瘤测量天数作为重复测量和治疗条件（载体、MAL3-101、PS-341或PS-341加上MAL3-102组合）作为分类变量。在GLM中，我们调整了收集数据的两个实验（实验1和实验2）。我们检查了一项重复测量条件效应的统计分析，以评估治疗期间条件之间的差异。对每天的条件效应进行方差分析，然后进行事后Tukey诚实显著性差异（HSD）检验。第二，使用GLM分析，我们使用载药臂作为参考点，计算每种单独治疗的平均百分比差异，以及联合治疗与载药对肿瘤生长的影响。结果根据实验数量进行了调整。使用事后测试和Tukey的HSD测试对条件进行比较。

3.结果

3.1. MAL3-101抑制人MM细胞生长并诱导其凋亡

为了确定MAL3-101对MM细胞系的影响，将NCI-H929、U266和RPMI-8226细胞与浓度增加的MAL3-1101进行培养，并在处理后的不同时间点收获。对照细胞用载体（DMSO）处理。通过MTS试验评估，在NCI-H929细胞中观察到最高水平的细胞毒性(图1（a）)；40小时暴露的剂量反应研究表明，IC50为8.3μ米(图1（b）). 暴露于MAL3-101超过48小时不会导致细胞死亡或凋亡的额外增加（数据未显示）。相比之下，对10或20没有反应μM MAL3-51型(图1（b）)，一种效力明显较弱的Hsp70调制器[42]. 这些数据强烈表明，MAL3-101的细胞毒作用与其抑制NCI-H929细胞中Hsp70活性的能力直接相关。在RPMI-8226细胞系中也观察到MAL3-101的细胞毒性作用，尽管其程度低于NCI-H929细胞(图1（a）).

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MAL3-101在多发性骨髓瘤（MM）细胞系中诱导分级细胞毒性效应。（a） MM细胞系（1×105)暴露于10μM MAL3-101用于指示的培养期，通过MTS分析测定处理细胞与对照细胞中活细胞百分比的倍数变化。（b） 将NCI-H929细胞暴露于指示浓度的MAL3-101或MAL3-51中40 h，通过MTS分析评估与对照细胞相比，DMSO处理细胞的存活率。数据以三个独立实验的平均值和SD表示*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001.

因为MAL3-101通过其阻止细胞周期的能力以及激活乳腺癌细胞中caspase-3和PARP的裂解来启动凋亡[23]，我们接下来检查了NCI-H929细胞的这些特征。FACS分析表明，接触10μM MAL3-101导致细胞凋亡的时间依赖性增加(图2（a）). 这种治疗也抑制了细胞周期的进展，如亚单位蛋白增加近3倍所示-G公司 0/G公司 1细胞数减少2.5倍G公司 2/M（M）培养48小时内的阶段(图2（b）). 免疫印迹分析证实了这一结果，显示暴露于MAL3-101后caspase-3和PARP的裂解随时间增加(图2（c）). 综上所述，这些结果表明，MAL3-101抑制MM肿瘤细胞生长并启动凋亡程序，在某些细胞系中的疗效显著高于其他细胞系。

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MAL3-101诱导多发性骨髓瘤（MM）细胞系NCI-H929的细胞周期阻滞和caspase介导的凋亡。（a） MM细胞系暴露于10μ流式细胞术检测MAL3-101处理细胞与对照细胞相比凋亡的倍数变化。数据以三个独立实验的平均值和SD表示*P（P）< 0.05. （b） NCI-H929细胞在G公司 0/G公司 1和G公司 2/M（M）每个面板上都显示了细胞周期的各个阶段。这一结果代表了三个产生类似结果的独立实验。（c） NCI-H929细胞暴露于10μM MAL3-101，并用一级抗体进行免疫印迹以检测胱天蛋白酶-3和聚（ADP核糖）聚合酶（PARP）。为了确保载荷相等，β-作为对照，检测肌动蛋白水平。显示了与完整和裂解的caspase-3和PARP相对应的条带。这些数据代表了四个实验。

3.2. 接触MAL3-101增强MG-132的抗骨髓瘤作用

在MM细胞中，蛋白酶体抑制导致错误折叠和聚集蛋白的积累，包括未组装的IG重链和轻链，这些蛋白质可以诱导细胞凋亡[12,17,19,43]. 因此，我们询问MAL3-101是否会增强蛋白酶体抑制的抗脊髓瘤作用。将NCI-H929细胞暴露于一系列MAL3-101或MG-132浓度或两种药物组合的一系列浓度下。我们发现这些药物组合的IC50下降了三个数量级（0.008μM） 与使用MAL3-101（IC50 8.3μM） 或MG-132（IC50 1.7μM）(图3（a）和补充表）。值得注意的是，当单独检查时，每种化合物在结合时获得的IC50下都无效。事实上，MAL3-101和MG-132对NCI-H929细胞的协同和细胞毒性作用发生在一个浓度范围内（0.01–0.1μM） ，正如CI值<1所证实的那样，这表明了强大的协同作用(图3（b）). 正如预期的那样，在接触这两种化合物组合的NCI-H929细胞中也观察到凋亡的协同增加（图S2）。

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MAL3-101和MG-132对多发性骨髓瘤肿瘤细胞和内皮祖细胞具有协同的细胞毒性作用。（a） NCI-H929细胞（1×105)暴露于指示浓度的MAL3-101、MG-132或这些药物的组合中40小时，通过MTS分析评估存活率；给出了七个独立实验中其中一个实验的代表性数据；错误条表示来自复制数据点的SD。明显没有误差线表示差异最小。（b） 本实验中非活性细胞与对照、DMSO处理细胞的比例用于等谱分析。简言之，受影响的细胞分数（Fa）是基于指示的MTS测定，使用以下公式计算的：Fa=100减去活细胞的百分比。CalcuSyn使用指示药物浓度下的Fa值导出组合指数（CI）值，其中CI=1表示加性效应，CI<1表示协同作用，CI>1表示拮抗作用[14]. （c） 将来自多发性骨髓瘤患者的骨髓源性肿瘤细胞（黑条）和融合内皮祖细胞（白条）暴露于指定浓度的MAL3-101、MG-132或其组合，并通过MTS分析评估生存率。Dunnett检验，在进行显著的单向重复测量方差分析后(P（P）肿瘤细胞和内皮祖细胞分别为0.004和0.002），比较用MAL3-101、MG-132或MAL3-101+MG-132处理的培养物中的对照值与细胞活力(*P（P）≤ 0.05, **P（P）≤ 0.001). （d） 将正常外周血单个核细胞（PBMC，黑条）、骨髓单个核细胞和汇合的骨髓源性内皮祖细胞（白条）暴露于指定浓度的MAL3-101、MG-132或这些药物的组合中，并通过MTS分析评估存活率。

MAL3-101和MG-132的协同抗髓细胞瘤作用也在原代MM细胞中得到证实。如所示图3（c）从骨髓中提取的MM细胞的存活率降低了33%±8(P（P）=0.02）和44%±10(P（P）=0.07），分别被MAL3-101和MG-132降低，并进一步降低了75%±4(P（P）=0.001）。除了对肿瘤细胞的作用外，与MAL3-101和MG-132的联合治疗也对MM微环境产生协同作用。如所示图3（c）（白色条），内皮祖细胞的存活率降低了10%±14(P（P）=0.7）和16%±17(P（P）=0.3）分别通过MAL3-101和MG-132，而它们的组合使EPC活性降低了60%±7(P（P）= 0.001). MAL3-101对MM肿瘤和微环境影响的特异性表现为正常对照BM、PBMC和EPC人群缺乏细胞毒性(图3（d）). 这些结果与之前在正常淋巴细胞中观察到的蛋白酶体抑制抵抗相一致[44]并进一步表明MAL3-101对MM肿瘤细胞的特异性作用。因为Hsp90分子伴侣稳定癌蛋白，有助于维持MM细胞内环境稳定，并与硼替佐米协同作用在体外[15,18]接下来，我们评估了MAL3-101与抗骨髓瘤Hsp90抑制剂17-AAG联合治疗的效果。当NCI-H929细胞同时暴露于比其IC50（10μM） 随着17-AAG浓度的增加，我们发现MAL3-101和17-AEG的组合将17-AAG的IC50从0.4降低μM至0.03μM（图4（a）和4（b）和补充表）。这些结果与抑制Hsp90的抗脊髓瘤作用的预测一致，抑制Hsp70的作用导致Hsp70基因表达上调[15,18]，可以通过同时抑制Hsp70功能来增强。

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MAL3-101和17-AAG对MM细胞系NCI-H929表现出协同的细胞毒性作用。（a） NCI-H929细胞（1×105)单独或联合接触17-AAGμM的MAL3-101持续40小时，通过MTS分析评估生存率。显示了三个实验之一的代表性数据；错误条表示来自复制数据点的SD。明显没有误差线表示差异最小。（b） 与对照组相比，本实验中DMSO处理的非活性细胞的分数用于CalcuSyn中的等谱分析，以得出组合指数（CI）值，其中CI<1表示协同作用[14].

为了开始研究这些化合物是如何单独或联合影响NCI-H929细胞的活性的，我们询问服用这些化学品是否会诱导未折叠蛋白反应（UPR）。在内质网应激和UPR诱导条件下，编码X-box结合蛋白1（XBP-1）转录因子的mRNA被剪接。这种剪接事件导致54kDa的XBP-1剪接（XBP-1s）异构体的翻译，而不是33kDa的XBP-1未剪接（XBP-1u）异构体的翻译。剪接亚型对浆细胞分化和可能的MM进展至关重要[6,12]和XBP-1拼接代表UPR的敏感、可量化读数。在相对较早的时间点，当UPR诱导最大时，在NCI-H929细胞暴露于导致协同细胞毒性的浓度MAL3-101、MG-132或17AAG后，未观察到XBP-1 mRNA剪接(图5（a）). 与这些结果一致，我们发现，在暴露于MAL3-101、MG-132和/或17-AAG的NCI-H929细胞中，ER管腔BiP伴侣的水平没有变化，其合成通过UPR激活而增强（数据未显示）。然而，在较高浓度的MAL3-101（30μM、 约为IC50的4倍），XBP-1 mRNA剪接的时间依赖性增加(图5（b）). UPR的诱导可能是由于翻译、新生蛋白折叠、通过分泌途径的蛋白质转运和/或转录中普遍存在Hsp70依赖性阻滞所致[12,42,45].

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NCI-H929细胞对伴侣蛋白和/或蛋白酶体抑制的反应不诱导未折叠蛋白反应。RT-PCR分析评估NCI-H929细胞中XBP-1 mRNA的剪接，右侧箭头表示285 bp未剪接（XPB-1u）和259 bp剪接（XPB-1s）mRNA提取总RNA进行RT-PCR扩增。NCI-H929细胞用5μg/mL衣霉素（TM）作为阳性对照诱导XBP-1 mRNA剪接。（b） 将NCI-H929细胞暴露于0、24、48和72小时至30小时μM MAL3-101，提取总mRNA进行RT-PCR扩增。

强有力的实验证据表明，肿瘤MM细胞对蛋白酶体抑制的敏感性与单克隆IG的产生共价[17,19,46,47]. 因此，我们测量了MAL3-101处理的MM细胞系中IG的产生和贩运。当对细胞内和分泌的IGs进行量化时，我们观察到NCI-H929细胞中IG分泌的相对量最高，这也表明了对MAL3-101诱导的生长抑制的敏感性最高(表1). 这些数据表明，MM细胞对Hsp70抑制的敏感性是由于产生和分泌单克隆IGs的额外细胞应激所致。

表1

MM细胞系NCI-H929是单克隆IG的高分泌细胞。多发性骨髓瘤（MM）细胞系生长于1×106 ELISA中分别使用细胞/毫升16小时、细胞裂解液中的总蛋白500 ng和无血清上清液中的500 ng来测定细胞内和分泌的免疫球蛋白（IG）轻链（LC）水平。相对LC分泌量显示为分泌量与细胞内LC水平的比例。数据表示为3个独立实验的平均值±SD。

MM细胞系生产轻链（LC）秘密LC（ng/106单元格）细胞内LC（ng/106单元格）相对LC分泌（分泌/细胞内）
NCI-H929标准 κ 505 ± 2293 ± 9.95.46 ± 0.4
U266型 λ 639±30387 ± 321.66 ± 0.2
RPMI-8226型 λ 56±511271 ± 180.16 ± 0.1

确定量化MAL3-101介导的对MM细胞生长抑制反应MAL3-1101的可行性体内，我们在NSG受体小鼠中使用皮下NCI-H929肿瘤（浆细胞瘤）异种移植[38]. 皮下肿瘤细胞注射24小时后，开始使用载体（DMSO和PBS）或40 mg/kg MAL3-101和1 mg/kg PS-341（硼替佐米），或40 mg/kgMAL3-1101和1 mg/kgPS-341的联合静脉注射。通过对肿瘤生长的初步观察来支持药物的剂量和时间表，以替代剂量和时间表使用MAL3-101进行治疗（图S3）。

观察到治疗条件下的整体重复测量(F类(15,50) = 4.89;P（P）=0.00001），如所示图6（A）与经车辆治疗的对照组相比，MAL3-101和PS-341从最初治疗起均延迟肿瘤生长20天以上；然而，结合起来，MAL3­-101和PS-341通过延缓肿瘤进展和缩小肿瘤大小，比单一治疗有更大的效果。在第6、9、13、16和20天观察到显著的方差分析影响(图6（A）). 在第6-20天，载体的肿瘤体积显著大于与MAL3-101和PS-341联合治疗的肿瘤体积，在第13、16和20天，载体肿瘤体积显著高于单独使用PS-341的肿瘤体积。与仅MAL3-101相比，未发现车辆存在差异。为了比较条件对肿瘤进展的影响，我们计算了每种治疗与载体的平均百分比差异，如图6（B）.注意到整体状况的影响(F类(2,7) = 10.25;P（P）= 0.008). 分析还表明，与单独使用PS-341或MAL3-101治疗相比，联合使用PS-341/MAL3-101治疗对肿瘤抑制率的影响更大（Tukey的HSD试验，P（P）= 0.02;P（P）分别=0.008）(图6（B）). 总之体内数据与我们的在体外结果表明，MAL3-101同时抑制蛋白酶体和Hsp70对早在MM模型第6天检测到的肿瘤生长具有稳定的抑制作用。

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MAL3-101和PS-341对骨髓瘤细胞生长的影响体内试验。（A） 在右侧皮下接种3×10的NSG小鼠中显示了作为条件效应的重复措施7NCI-H929细胞。小鼠接受40 mg/kg MAL3-101、1 mg/kg PS-341、这些药物的组合或每周腹腔注射两次载体(n个= 16). 在指定的日期进行肿瘤体积评估。观察到治疗条件下的整体重复测量(F类（15,50）=4.89；P（P）=0.00001），MAL3-101和PS-341均延迟肿瘤生长超过20天；然而，结合起来，MAL3­101和PS-341通过延缓肿瘤进展和缩小肿瘤大小，比单一治疗有更大的效果。垂直条表示0.95置信区间。a–e是指日间治疗对肿瘤抑制作用的ANOVA结果。（a） 第6天的整体状况影响：F类(3,10) = 5.40;P（P）= 0.018; Tukey HSD：车辆>MAL3-101和PS-341组合。（b） 第9天的整体状况影响：F类(3,10) = 5.25;P（P）= 0.02; Tukey HSD：车辆>MAL3-101和PS-341组合。（c） 第13天的整体状况影响：F类(3,10) = 10.57;P（P）= 0.002; Tukey HSD：车辆>MAL3-101和PS-341组合；车辆>PS-341。（d） 第16天的整体状况影响：F类(3,10) = 8.16;P（P）= 0.004; Tukey HSD：车辆>MAL3­-101和PS-341组合；车辆>PS-341。（e） 第20天的整体状况影响：F类(3,10) = 7.33;P（P）= 0.01; Tukey HSD：车辆>MAL3­-101和PS-341组合；车辆>PS-341。（B） 条形图显示了每个治疗组与溶媒的计算平均百分比差异。注意到整体状况的影响(F类(2,7) = 10.25;P（P）=0.008）。与PS-341或MAL3-101单独治疗相比，PS-341和MAL3-102联合治疗对肿瘤抑制率的影响更大（Tukey的HSD试验，P（P）= 0.02;P（P）=0.008，分别），尽管每个单独的治疗彼此之间没有显著差异*表示统计显著性。垂直条表示0.95置信区间。

4.讨论

本研究的重点是测量MAL3-101对在体外和体内我们的结果提供了证据，证明MAL3-101对MM细胞具有细胞毒性，并且当该化合物与Hsp90或蛋白酶体抑制剂联合使用时，观察到协同作用。

在MM中，由于IG合成和分泌增加，蛋白质折叠机制过载，大量IG可能会折叠错误；事实上，一些MM细胞产生未组装的IG单链。这些蛋白质在内质网中的浓度可能会因逆转录回细胞质而降低，在细胞质中被蛋白酶体降解，这一过程被称为内质网相关降解（ERAD）[48,49]. 由于IGs在内质网中折叠并通过分泌途径进行运输，蛋白酶体抑制导致内质网错误折叠蛋白的负荷增加，从而触发细胞凋亡。因为内质网和细胞质中的Hsp70同源物在ERAD中起关键作用[28,48,49]当蛋白酶体和Hsp70同时被抑制时，我们观察到协同细胞毒作用对MM细胞存活率的影响可能并不奇怪。我们还通过联合抑制Hsp70和Hsp90观察到MM细胞的协同细胞毒性，进一步支持MM细胞易受损害蛋白质质量控制的治疗的观点。

MAL3-101反应最灵敏的细胞系NCI-H929是单克隆IG的高分泌细胞[50]与其他公布的数据一致，即IG负荷与质控机构抑制剂的敏感性相关[17,43]. 尽管先前有报道称MM细胞缺乏UPR诱导[12]，我们设想，当Hsp70和蛋白酶体都受到抑制时，可能会触发这种反应，因为ERAD底物会积累。MAL3-101、Hsp90和蛋白酶体抑制剂在低浓度下缺乏UPR诱导，诱导协同凋亡可能是多因素的：虽然NCI-H929细胞合成并分泌大量IGs，但它们可能无法诱导持续的UPR。或者，凋亡可能通过不依赖于UPR激活的途径发生，包括自噬[45]或恶意处置[14]; 因此，在分子水平上更好地确定调节细胞应激反应的机制是很重要的[51]. 还需要进一步研究以确定MAL3-101是否对MM细胞上调的通路有影响[14,45]. 然而，Davenport和同事们[15]表明硼替佐米对MM细胞系蛋白酶体的抑制不一定导致XBP1的产生，但内质网应激和内在凋亡途径的激活是明显的。此外，暴露于17-AAG后2小时，UPR迅速启动，导致内质网应激和内在凋亡途径激活。最近，同一研究小组发现，在MM细胞系中，17AAG诱导的UPR通过抑制Hsp72而协同增加[21]. 类似地，我们发现暴露于MAL3101 48小时后XBP1的水平增加。然而，在有效的抗髓细胞瘤浓度下，当MAL3-101和17-AAG联合给药时，我们没有观察到XBP1，除非使用更高的浓度和延长的孵育时间。我们认为，观察到的不同效果可能是由用于抑制Hsp70的化合物的性质造成的，和/或独特的Hsp70家族成员的活性可能会受到这些化学品的不同影响。

我们研究的一个关键结果是证明了Hsp70和蛋白酶体抑制对MM微环境的协同作用。我们和其他人已经在MM EPC中观察到IG基因重排[40,52]; 因此，蛋白质错误折叠和随后的内质网应激反应可能决定了肿瘤内皮细胞（至少在一组患者中）对Hsp70和蛋白酶体抑制的敏感性。正常骨髓、淋巴细胞和内皮细胞对MAL3-101缺乏敏感性支持了这种可能性，其中大多数不产生IG。因此，MAL3-101在MM中的临床应用不仅可以通过增强其他蛋白质量控制抑制剂的作用来帮助克服耐药性，还可以通过抑制肿瘤血管生成来限制MM的生长。

MAL3-101的抗脊髓瘤作用在与15-脱氧番石榴素（一种Hsp70调节剂，Hsp70的KD为~5）类似的浓度下明显μM.15-Deoxyspergualin已在临床试验中证明是成功的[53]; 然而，这种化合物是一种非特异性伴侣抑制剂，可能表现出其他非途径效应[54]. 我们的结果也与最近的数据一致，这些数据显示，在基线时，MM细胞系中Hsp70的表达很强，细胞外基质（ECM）粘附后Hsp70表达显著上调[26]. 在同一份报告中，还证明抑制Hsp70基因表达会导致肿瘤细胞对ECM的粘附减少，随后MM细胞的凋亡增加。

总之，我们认为MAL3-101是一种Hsp70调制器，它与Hsp70特异结合并影响其与耳蜗的相互作用[1,28,55]，可以提供增强蛋白酶体和Hsp90抑制剂的抗髓细胞瘤作用的可行手段。联合用药策略可能会降低MM治疗的耐药性，并允许目前不能耐受硼替佐米的患者使用[13]因为较低浓度的药物可以与MAL3-101-like分子结合使用。除了直接抗肿瘤特性外，MAL3-101还可能通过靶向微血管来影响微环境。我们使用异种移植浆细胞瘤模型的实验表明，肿瘤细胞生长体内MAL3-101也能延缓和减少蛋白酶体的抑制，并且这种抑制作用对蛋白酶体抑制是协同作用的，在开始联合治疗后的第一周内观察到了这种协同作用。在这个模型中，因为我们在肿瘤发生24小时内开始使用化合物进行治疗，所以在广泛骨骼受累之前，这些发现可能在临床上转化为疾病早期阶段的有限影响。还可能需要含有更高剂量MAL3-101和蛋白酶体抑制的组合来控制更大的肿瘤和晚期MM。这些结果强调了阐明MAL3-101的药代动力学特性的必要性，以优化MAL3-102暴露的剂量和频率计划。尤其重要的是，在确定影响与毒性时，测量血浆水平以及化合物的清除率和程度。在后一方面，我们确实知道高达160 mg/kg i.p.的浓度是可以耐受的，没有毒性（数据未显示）。这里的结果强烈表明，需要对MAL3-101药代动力学进行更详细的研究。

补充材料

抑制浓度比较（IC50)表S1显示了NCI-H929细胞中MAL3-101、MG-132和17-AAG的指示组合（与DMSO处理的对照细胞相比）。MAL3-101和MAL3-51的结构如图S1所示。图S2中所示的点图显示了NCI-H929细胞因暴露于指示浓度的MAL3-101、MG-132或其组合（通过双膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）染色和流式细胞术获得）而导致的凋亡。

图S3显示了初步情况体内NSG小鼠接种肿瘤24小时后腹腔注射20 mg/kg MAL3-101的肿瘤进展实验(n个=1）或肿瘤接种后8天(n个=1）如图所示。每种药物时间表都由一只用载体治疗的动物进行控制。所有老鼠(n个=4）在右侧皮下接种3×107NCI-H929细胞。每周通过腹腔注射20 mg/kg MAL3-101或载体两次。肿瘤接种日视为第0天x个-轴。显示了肿瘤接种后第0、14和29天的肿瘤体积分析。显示了车用治疗动物的平均肿瘤体积。

资金来源

O.Batuman承认国家癌症研究所的R21CA115832-01号拨款；J.L.Brodsky承认收到了治愈与高盛慈善合作伙伴关系、Alpha One基金会和NIH第GM75061号拨款；P.Wipf承认NIH-NIGMS第P50-GM067082号拨款支持匹兹堡大学化学方法学和图书馆开发中心。

致谢

作者感谢纽约州立大学下州分校移植免疫学和免疫遗传学实验室主任Allen J.Norin博士的支持，以及纽约州立大学下州分校移植免疫学Mary Mondragon Escorizo女士在流式细胞术方面的专业帮助。他们感谢SUNY Downstate的Chongmin Huan博士和Sarah Nataraj博士对细胞周期分析的贡献。他们还要感谢克里斯托弗·尼奇塔博士（杜克大学）提供抗血清。感谢Eric Smith博士的有益讨论和统计支持。

工具书类

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