低氧诱导因子1是乳腺癌转移生态位形成的主要调节因子

乳腺癌患者中LOX/LOXL的表达。

获得临床洞察力液氧,LOXL2型，以及LOXL4型乳腺癌中的基因表达，我们比较了它们在同一患者的癌组织和周围正常组织中的表达。我们观察到在11例分析的人类乳腺癌中不同LOX成员组合的表达(图1B类). LOX、LOXL2和LOXL4 mRNA分别在11例中的7例、11例中8例和11例中2例中过度表达至少两倍(图1B类). 因此，多个LOX家族成员在不同的乳腺癌中上调。

LOX家族成员的HIF-依赖性表达。

液氧HIF-1对乳腺癌细胞基因表达的调节(8). 为了测试HIFs是否介导其他LOX家族成员的表达，我们产生了稳定的MDA-231和MDA-435转染子，其中shRNA介导的HIF-1α（sh-1α）、HIF-2α（sh-2α）的敲除，或HIF-1α和HIF-2α的双重敲除（DKD）以及空载体（EV）转染子(图S1天和E类). 当MDA-231中HIF-1α、HIF-2α或两者同时被敲除时，低氧诱导LOX和LOXL4 mRNA和蛋白表达受到抑制(图1C类和图S1F类和G公司). 在MDA-435中，只有当HIF-1α被敲除时，LOXL2的低氧诱导才被阻断(图1天).

LOXL4型是HIF靶基因。

LOX和LOXL2被证明是HIF-1的直接靶点(8,11). 检查是否LOXL4型是HIF-1靶点，我们搜索HIF结合位点共识序列5′-RCGTG-3′(12). 在内含子1中有两个拷贝作为反向重复出现(图S2A类). MDA-231中的ChIP分析显示HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β与该DNA序列的低氧诱导结合(图2A类–C类)但不是在RPL13A型基因(图。S2B型)，不受HIF监管。为了验证HIF-1和HIF-2与功能性缺氧反应元件（HRE）结合，一个跨越HIF结合位点的60-bp序列（HRE-WT；图S2A类)被插入到报告质粒pGL2启动子中，其中一个基本SV40启动子驱动萤火虫荧光素酶的表达。生成了第二个结构，其中两个HIF位点都发生了突变（HRE-Mut；图S2A类). 在转染pGL2-HRE-WT的MDA-231细胞中，荧光素酶活性在低氧暴露下增加了2.5倍，而在转染了pGL-HRE-Mut的细胞中，荧光酶的低氧诱导受到损害(图2天). 因此，ChIP和转录分析表明LOXL4型是HIF的直接靶基因。

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图2。

LOXL4型是HIF靶基因。(A类–C类)MDA-231细胞在20%或1%O中培养₂持续4小时。使用IgG、HIF-1α、HIF-2α或HIF-1β抗体进行ChIP测定。LOXL4型内含子1引物用于qPCR，数值标准化为20%O₂-IgG*P（P）<0.05 vs.1%IgG或20%HIF-α**P（P）<0.01 vs.1%IgG或20%HIF-1β，^#P（P）<0.05 vs.20%IgG；学生t吨对数转换值测试（平均值±SEM；n个= 3). (天)将WT和Mut-HRE序列插入萤火虫荧光素酶载体pGL2启动子并与雷尼利亚荧光素酶载体进入MDA-231细胞，在20%或1%的O培养基中培养₂24小时。萤火虫/雷尼利亚计算比率并将其标准化为20%O的值₂. **P（P）<0.01 vs.20%O₂HRE-WT、，^#P（P）<0.05 vs.1%O₂HRE-WT；学生t吨测试（平均值±SEM；n个= 3).

HIF-依赖性LOX/LOXL表达导致胶原重塑。

为了探讨HIF对胶原交联的影响，我们将I型胶原与缺氧或非缺氧MDA-231亚克隆产生的条件培养基（CM）孵育，并通过反射共聚焦显微镜对原纤维胶原成像(图3A类). 来自低氧MDA-231-EV细胞的CM刺激了显著的胶原交联(图3A类). 这种低氧诱导作用在DKD细胞中被消除，表明HIF-1α和HIF-2α表达对胶原交联的重要性(图3A类).

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图3。

HIF和LOX/LOXL蛋白调节胶原交联和BMC侵袭。(A类–C类)胶原蛋白凝胶与在20%或1%O中培养的MDA-231和MDA-435亚克隆产生的CM混合₂。胶原蛋白纤维至少在三个随机区域进行计数。结果标准化为20%O₂控制。(天–G公司)涂有基质凝胶的Transwell过滤器与来自乳腺癌细胞的CM在37°C下孵育16小时。无血清培养基中的BMC接种在顶部培养箱中。将含有10%FBS的培养基置于底室中。对通过基质凝胶侵入底部腔室的BMC进行计数，并将其归一化为20%O₂控制（EV或NTC）。^##P（P）< 0.01,^###P（P）<0.001 vs.20%O₂控制（EV或NTC）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001 vs.1%O₂控制（EV或NTC）；Bonferroni校正的单因素方差分析（平均值±SEM；n个= 3).

由于LOX和LOXL4是由MDA-231中的缺氧诱导的，而LOXL2是由MDA 435中的缺氧诱发的，因此我们在MDA 231中产生了稳定的抗LOX（shLOX）或LOXL4（shLOXL4）shRNA转染体(图S3A类和B类)和MDA-435中的LOXL2（shLOXL2）(图S3C类)和非目标控制（NTC）子克隆。与来自NTC细胞的CM相比，与来自敲除亚克隆的CM孵育的I型胶原在纤维大小和数量方面表现出减少的交联(图3B类和C类和图S4A类–C类). 因此，HIF和多个LOX家族成员的表达对胶原纤维的形成非常重要。

HIF-依赖性LOX/LOXL表达是ECM对骨髓细胞侵袭的先决条件。

转移部位BMDC的侵袭是形成转移性生态位所必需的。为了研究癌细胞对骨髓间充质干细胞侵袭的影响，我们在迁移室的transwell过滤器上涂上基质凝胶（肿瘤衍生ECM），将基质凝胶与CM孵育，并在顶部接种骨髓细胞（BMC）(图S4天). 与非低氧细胞CM相比，低氧MDA-231-EV细胞CM处理的Matrigel刺激BMC侵袭增加，当HIF-1α或HIF-2α表达降低时，低氧效应消失(图3天). 用CM预处理低氧MDA-435细胞的基质凝胶也能增强BMC的侵袭性，这种作用在sh-1α和DKD细胞中被消除，但在sh-2α细胞中没有消除(图3E类). 这一结果与我们的发现一致，即HIF-1α（而非HIF-2α）调节MDA-435中LOXL2的表达，并表明LOXL2在MDA-435中的胶原重塑和转移生态位形成中起着关键作用。与MDA-231-NTC细胞相比，MDA-231-shLOX和-shLOXL4细胞中的CM在缺氧条件下不会诱导BMC侵袭(图3F类). 与低氧MDA-435-NTC细胞相比，低氧MDA 435-shLOXL2细胞经CM预处理的基质凝胶侵袭的BMC更少(图3G公司). 因此，乳腺癌细胞中的HIF→LOX/LOXL通路对促进BMC侵袭的ECM重塑非常重要。

乳腺癌细胞需要HIF来预处理肺部以进行BMDC招募。

为了确定转移性生态位形成是否需要HIF-1α或HIF-2α，我们将MDA-231亚克隆原位植入SCID小鼠的乳腺脂肪垫（MFP）。3周后取肺，在偏振光下分析Picrosius红色染色切片，以确定交联胶原纤维。与EV细胞相比，植入sh-1α、sh-2α或DKD细胞的小鼠肺部的交联减少(图4A类)表明MDA-231中HIF-1α和HIF-2α的表达调节荷瘤小鼠肺部的胶原重塑。然后，我们通过流式细胞术分析BMDC向肺部的募集。MDA-231-sh-1α、-sh-2α和-DKD肿瘤招募的CD11b较少⁺CD45型⁺细胞（表示为CD11b⁺与EV肿瘤相比，BMDCs）对肺部的影响(图4B类). EV和DKD荷瘤小鼠肺部的免疫组织化学分析证实了流式细胞术分析的结果(图4C类). 我们还原位植入MDA-435亚克隆，并在注射后45天采集肺部。敲除HIF-1α而非HIF-2α可降低肿瘤生长、胶原重塑、CD11b⁺骨髓基质干细胞的募集和转移(图4天–G公司). 因此，乳腺癌细胞中HIF-1的活性对转移性生态位的形成至关重要。

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图4。

MDA-231中HIF的抑制抑制BMDC归巢到肺部。(A类)将MDA-231亚克隆注射到SCID小鼠的MFP中。第24天采集肺部。(左侧)图中显示了偏振光下Picrosius红色染色肺部的典型显微照片。（比例尺=50μm）(赖特)对交叉连接的胶原纤维进行计数，并将其归一化为EV对照。(B类)CD45的流式细胞术分析⁺CD11b细胞⁺荷瘤小鼠肺部的细胞。(C类) (左侧)接受EV或DKD亚克隆MFP注射的小鼠肺切片中CD11b的免疫组织化学染色。（比例尺=50μm）(赖特)CD11b型⁺在10个随机场中以20倍放大率计数细胞簇。(天)向小鼠注射MDA-435亚克隆。肿瘤体积（平均值±SD；n个=4–5）绘制时间曲线。交联胶原纤维的数量（归一化为EV）(E类)和CD11b⁺CD45型⁺BMDC(F类)测定肺中细胞数（占总细胞数的%）。(G公司)通过H&E染色切片的图像分析确定转移瘤所占的肺总面积的百分比*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001 vs.EV；单向方差分析，Bonferroni校正（平均值±SD；n个= 4–5).

MDA-435和MDA-231要求使用LOXL2和LOXL4来形成转移生态位。

为了评估单个LOX成员的功能作用，我们将MDA-435-NTC和-shLOXL2细胞注射到小鼠的MFP中，并监测BMDC募集和肺转移。NTC和shLOXL2亚克隆在原发性肿瘤生长方面没有显著差异(图5A类). 然而，交联较少的胶原蛋白(图5B类和图S5A类)CD11b更少⁺BMDC(图5C类和图S5B类和C类)在与NTC肿瘤相关的shLOXL2肿瘤小鼠的肺部发现。组织学分析和qPCR显示注射shLOXL2细胞的小鼠肺部转移负担降低(图5天和图S5天). 然而，在携带NTC和shLOX肿瘤的小鼠中，未观察到BMDC募集或肺转移的差异(图S5E类–G公司). 因此，只有缺氧诱导的LOX家族成员（LOXL2）的缺失才能损害MDA-435细胞的转移生态位形成和转移。

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图5。

LOX家族成员与乳腺癌转移生态位形成。(A类–天)SCID小鼠接受所指示的MDA-435亚克隆的MFP注射。(A类)绘制肿瘤体积随时间变化的曲线。交联胶原纤维（归一化为NTC）(B类)，CD11b⁺CD45型⁺BMDC(C类)和转移灶(天)在第42天对肺部进行分析。肺部转移灶以20×每视野（每只小鼠3个随机视野）的放大倍数进行计数。(E类–H（H）)非肥胖糖尿病SCID小鼠接受MDA-231亚克隆MFP注射。(E类)绘制肿瘤体积随时间变化的曲线。(F类)交联胶原纤维（归一化为NTC）(G公司)CD11b细胞⁺CD45型⁺BMDC，以及(H（H）)转移负担（用人类qPCR测定香港2号在第52天分析肺中的基因引物并归一化为NTC）。(我–L（左）)将MDA-435细胞注射到SCID小鼠的MFP中，8、16或24天后将其安乐死。(我)在偏振光下对交联胶原纤维进行计数，并将其归一化为原始对照。(J型) (左侧)CD11b的百分比⁺CD45型⁺用流式细胞术分析第16天小鼠肺部的BMDCs。(赖特)分析第16天小鼠肺部的转移负荷。(K（K）)用qPCR分析第24天小鼠肺部转移负荷，并将其归一化为原始对照（平均值±SD；n个= 3). *P（P）< 0.05, **P（P）与NTC相比<0.01；学生t吨试验（平均值±SD；n个= 3–4). (L（左）)MDA-435荷瘤小鼠转移性生态位形成机制和动力学概述。

我们还将MDA-231-NTC和-shLOXL4细胞植入MFP。尽管NTC和shLOXL4原发肿瘤的生长速度相似(图5E类)，荷shLOXL4肿瘤小鼠的肺部显示交联胶原蛋白显著减少(图5F类和图S6A类)，CD11b⁺BMDC(图5G公司和图S6B类)和肺转移(图5H（H）和图S6C类)与NTC荷瘤小鼠的肺部进行比较。在两种转移前均观察到对胶原交联的影响(图S6A类)和转移性(图S6天)肺部的部位。用不同的shRNA敲除LOXL4或敲除LOX重述了结果(图S6E类和F类)证明LOX和LOXL4都是MDA-231细胞形成转移性生态位所必需的。

为了对体内转移进行成像，我们植入了表达萤光素酶的MDA-231-NTC和-shLOXL4细胞。MFP中原发肿瘤产生的信号没有差异(图S7A类). 然而，shLOXL4荷瘤小鼠的肺部显示CD11b减少⁺BMDC细胞(图S7B类)和转移性乳腺癌细胞，如qPCR所示(图S7C类)通过生物发光成像(图S7天). 敏感的生物发光成像也可以分析这些小鼠的淋巴结转移。我们发现，与NTC荷瘤小鼠相比，shLOXL4的腋窝淋巴结发光降低(图S7E类).

细胞培养研究。

中描述了以下内容SI材料和方法和表S1：shRNA载体的构建、细胞转染、慢病毒的制备以及稳定转染细胞系的建立；细胞染色质的分离和分析；pGL2 HRE荧光素酶报告子的构建及共转染检测；实时qPCR分析；Western blot分析；和体外胶原重塑试验。

BMC分离和侵袭试验。

用PBS冲洗小鼠股骨和胫骨，然后通过Histopaque（Sigma）沉淀，从小鼠中获取BMC。将Transwell插入物（Corning）在37°C下涂上基质凝胶（BD Biosciences）1 h。CM是在20%或1%的O浓度下从MDA-231或MDA-435细胞中生成的₂在涂有基质的嵌件上放置48 h，持续16 h。取下CM，并取下1×10⁶新分离的BMC或3×10⁵将未经处理的乳腺癌细胞重新悬浮在无血清DMEM（CellGro）中，并接种到上腔。补充有10%（vol/vol）FBS的DMEM作为化学引诱剂放置在底室中。细胞被允许侵入20小时。对于BMC侵入试验，在下室悬浮液中发现穿过膜侵入的细胞。侵入细胞通过血细胞仪或Countess自动细胞计数器（Invitrogen）进行计数。

原位植入研究。

所有动物方案均由约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准。总计2×10⁶将再次悬浮在基质凝胶中的乳腺癌细胞注射到5-7周龄SCID或非肥胖糖尿病SCID小鼠的第二个左MFP中。用卡尺测量肿瘤生长。处死小鼠，用PBS灌注肺部。用低熔点琼脂糖膨胀左肺进行固定/石蜡包埋，切片进行H&E染色和免疫组织化学分析。取右肺进行DNA提取和流式细胞术。生物发光信号通过IVIS光谱光学成像设备（Xenogen）检测。小鼠腹腔注射100 mg/kgd日-荧光素（Caliper Life Sciences）在原发肿瘤成像前5分钟。对小鼠实施安乐死，切除它们的肺和淋巴结进行离体成像。

肺组织制备、基因组DNA提取和流式细胞术分析。

用裂解缓冲液和蛋白酶K在55°C下消化肺部过夜，用酚氯仿提取基因组DNA，用异丙醇沉淀，并用乙醇洗涤。使用200毫微克基因组DNA进行qPCR以量化人类香港2号和鼠标18秒rDNA序列。为了制备用于流式细胞仪分析的肺细胞，将组织切碎，并在37°C下用1 mg/mL 1型胶原酶（Sigma）消化30分钟。消化后的组织通过70μm细胞过滤器过滤。细胞与Fc Block（BD Pharmingen）孵育，然后与周霉素-叶绿素蛋白结合CD45抗体（BD Farmingen）和别藻蓝蛋白结合CD11b抗体（eBiosciences）孵养，然后进行流式细胞术分析。在每次实验中制备未染色对照、CD45单染色和CD11b单染色细胞用于门控。通过侧向散射和正向散射分析将死亡细胞选通。

我们感谢Karen Padgett（Novus Biologicals Inc.）提供针对HIF-1β、HIF-2α、LOXL2、LOXL4、CD11b和IgG对照的抗体，以及Rashmi Bankoti、Sergio Rey和Weibo Luo的建议。这项工作得到了翡翠基金会和国家卫生研究院的资助（U54-CA143868）。D.M.G.得到了NIH拨款T32-CA130840的支持。G.L.S.是约翰·霍普金斯大学医学院的C.迈克尔·阿姆斯特朗教授。C.C.-L.W.是克劳彻基金会的研究员。