多梳驱逐作为一种新的远距离增强功能

摘要

目前还不完全了解基因在分化和发育过程中是如何开启或关闭的。然而，远程监管元素在这一过程中的作用被认为至关重要(2011年膨胀与格鲁丁). 调控许多基因的一个重要表观遗传机制涉及Polycomb（PcG，抑制）和Trithoris group（TrxG，激活）蛋白质的相反作用，它们在干细胞生物学、发育和癌症中起着关键作用(西蒙和金斯顿2009). 大多数PcG/TrxG靶基因的启动子与所有细胞类型中未甲基化的CpG岛相关(Mendenhall等人，2010年; MD Lynch、AJ Smith、M De Gobbi、M Flenley、JR Hughes、D Vernimmen、H Ayyub、JA Sharpe、JA Sloane-Stanley、L Sutherland等人，正在准备中）。在谱系承诺和分化过程中，PcG复合体从沉默基因中清除，并在这些基因启动时被TrxG复合体取代。当PcG（H3K27me3）或TrxG（H3 K4me3）复合体与染色质结合时，这些复合体中的特定组蛋白甲基转移酶产生特征染色质特征。双价染色质模式（H3K27me3和H3K4me3(2010年萨瓦卡和帕罗;Surface等人，2010年). 二价结构域也可能在分化过程中从头出现(Roh等人，2006年;Mohn等人，2008年). PcG和TrxG复合物的招募和移除是一个动态过程。然而，远程顺式-在整个发育和分化过程中，影响抑制和激活之间平衡的作用因素尚未被探索。为了解决这些问题，我们描述了在存在或不存在远处增强子的情况下，转录因子（TFs）、辅因子、染色质相关蛋白（包括PcG和TrxG）的招募变化，以及人类α-珠蛋白CpG岛的相关染色质修饰。

当相关基因的扰动（例如，关键TF）导致细胞命运的扰动时，分析基因调控的这些方面就会出现一个主要问题。在这种情况下，细胞表型随着所研究基因的调节发生改变。为了避免这种情况，这种实验通常在命运固定的细胞系中进行。为了分析人α-珠蛋白在原代细胞中的表达，我们建立了一个实验模型，其中人α-球蛋白簇（117 kb）取代小鼠α-球蛋白质簇（87 kb；人源化模型）(图1;Wallace等人，2007年). 由于α-珠蛋白是基因调控网络的最终产物，因此干扰该基因对细胞命运没有影响。人类α-珠蛋白基因的表达受远程上游调控元件（MCSR1-4）控制，其中MCS-R2（也称为HS-40）(图1)位于α-珠蛋白启动子上游60kb处，是主要的增强子元件(Higgs等人2008). 在人源化系统中，MCS-R2通过同源重组被删除，成年小鼠的红系祖细胞分化正常，因此，就反式-作用环境下，正常细胞和突变细胞可直接比较(Vernimmen等人，2009年). 任何差异完全是由于MCS-R2在顺式发送给发起人。

在单独的窗口中打开

图1。

以人源化小鼠为模型，研究人类α-珠蛋白基因座和人类α-球蛋白簇的组织。小鼠11号染色体上的一个保守联合体区域被人类同源区域所取代(Wallace等人，2007年). 在这项研究中，杂合小鼠被用来避免使用MCS-R2缺失（ΔMCS-R2）的致死性，但也被用来保持其他等位基因（小鼠）作为内源性阳性对照。珠蛋白基因显示为标记的红框。前面描述的DNaseI超敏位点的位置如箭头所示。广泛表达的基因NPRL3号机组（在人类中也称为−14基因，在小鼠中称为Prox基因）从α-珠蛋白的相反链转录而来，如橙色方框所示。短垂直线（黑色）表示ChIP实验中使用的放大器。灰色方框表示先前定义的多物种保守元素（MCS），浅绿色方框表示CpG岛。

这里我们表明，在红系细胞中，当α-珠蛋白基因完全激活时，远程组织特异性增强子（MCS-R2）在清除CpG岛的PcG复合体及其相关修饰（H3K27me3）中起着重要的非冗余作用。此外，在缺乏增强子的情况下，CpG岛不招募H3K27脱甲基酶JMJD3。这表明，除了在启动子处招募TF、辅因子和启动前复合物（PIC）外，远程调控元件在清除抑制性PcG复合物方面也起着关键作用。

结果和讨论

使用人源化小鼠，我们先前表明，去除MCS-R2可显著减少染色体环的形成，染色体环通常发生在红系细胞的上游调控元件和启动子之间。在缺乏MCS-R2的情况下，人类α-珠蛋白基因在红系细胞中的表达低于正常水平的2%(Vernimmen等人，2009年). 在这里，我们首先确定了MCS-R2对结合Ter119中α-珠蛋白启动子的关键、细胞类型特异和普遍表达的TF募集的影响⁺成熟成红细胞(Vernimmen等人，2007年). 在缺乏MCS-R2的情况下，TF（如Sp-XKLF和NFY）和辅因子（如组蛋白乙酰转移酶（PCAF、GCN5、CBP和p300）不能有效地被招募（补充表1）。这些发现反映在次优组蛋白乙酰化（补充表1）。值得关注的是，关键时刻的TF入住率逐渐下降顺式染色体上的元素（MCS-R1/HS-48、MCS-R3/HS-33和MCS-R4/HS-10），α-珠蛋白启动子受影响最大（补充图1；补充表1）。此外，在缺乏MCS-R2的情况下，H2B（H2Bub，与活化相关）的泛素化在α-珠蛋白基因上没有有效发生(图2，左侧面板）。H2B的泛素化被认为是Dot1随后使H3K79甲基化所必需的(Shilatifard 2008年)，并且没有MCS-R2，H3K79不能有效地甲基化(图2; 补充图2）。如前所述(Vernimen等人，2007年)在没有MCS-R2的情况下，PIC组件（TBP、TFIIE和TFIIB）的占用率都很低，对PolII的影响更大(图2; 补充图1）与正常染色体进行比较。这些发现证实，在人源化小鼠细胞（如原代人和小鼠细胞）中，上游元件（MCS-R2）的关键作用是在红细胞生成后期促进α-珠蛋白启动子处PIC的募集和/或稳定。

在单独的窗口中打开

图2。

H3K4me3与H2Bub、H3K79me3、Pol II和CGBP无关。使用−MCS-R2中指示的抗体对免疫沉淀染色质进行实时PCR分析(左边)和+MCS-R2(正确的)人源化红细胞（通过自磁激活细胞分选纯化的Ter119阳性细胞）。这个Y（Y）-轴表示输入DNA的富集，归一化为小鼠GAPDH基因中的控制序列。这个X（X）-轴表示所使用的TaqMan探针的位置。编码序列由人类α-珠蛋白基因的三个外显子（启动子/Ex1、Ex2、Ex3）表示，如图1（小鼠Ex1和小鼠Ex2）小鼠α-珠蛋白基因的控制序列；（CpG-Act）小鼠β-actin基因CpG岛上的附加控制序列。以红色突出显示的扩增子代表人源化小鼠中的缺失区域，未观察到PCR信号。误差条对应于至少两个独立ChIP的±1 SD。这里使用的CGBP抗体是从Abcam购买的。

然后我们评估了MCS-R2在组蛋白H3的Lys 4残基甲基沉积中的作用。如人类原代红细胞(De Gobbi等人，2007年)在完全活性的人源化红细胞中，上游元素以单甲基和二甲基H3K4标记（补充图3）。相反，与α-珠蛋白启动子和基因体相关的染色质被H3K4me3修饰(图2，右侧面板；补充图3）。这些发现也与全基因组分析中确定的增强子和启动子的染色质特征相一致(Heintzman等人，2007年). 在没有MCS-R2的情况下，H3K4的单甲基化和二甲基化似乎正常发生（补充图3，左侧面板）。此外，更出乎意料的是，尽管没有可检测到的H2Bub和H3K79me3以及相关的转录（仅表达正常的～2%），α-珠蛋白基因中H3K4me3的总体水平是在完全活性、高转录基因中看到的水平的～50%（考虑到内源性对照上检测到的H3K4me3的数量）(图2; 补充图3）。注意，在没有MCS-R2的情况下，单甲基、二甲基和三甲基H3K4的分布比基因体更偏向启动子。这可能部分是由于与正常情况相比，ΔMCS-R2启动子的H3占用水平较高（补充图4）。有趣的是，在没有增强子的情况下，也可以检测到H3K36me3（转录延伸的标记）（补充图5）。

H3K4me3修饰是由人类TrxG蛋白施加的，其中包括几个复合物（hSet1和MLL1-5）(Shilatifard 2008年). 最近有研究表明，CpG岛上的H3K4甲基化可能通过hSet1复合物介导，该复合物包含CpG岛带结合蛋白（CGBP或Cfp1）。CGBP被认为与未甲基化的富含CpG的序列结合而与转录无关，从而招募hSet1(汤姆森等人，2010年). 这意味着非甲基化CpG岛的染色质可能被H3K4me3修饰为默认状态。在这里，我们发现在人类非红细胞中，在相关的CpG岛上无法检测到CGBP/Cfp1（由两种不同的抗体判断）（补充图6）。同样，当人源化小鼠MCS-R2突变体中的α基因严重下调时，CGBP/Cfp1的水平很低(图2; 补充图7）。因此，CGBP/Cfp1仅在与高水平α-珠蛋白表达相关的情况下容易检测到。因此，ΔMCS-R2突变体中相对较高水平的H3K4me3（当α基因以相对较低水平表达时）似乎不太可能反映CGBP/Cfp1介导的默认状态。相反，它表明H3K4me3可能是基础转录的敏感标记。有趣的是，之前有人建议以H3K27me3标记的CpG岛可能排除CGBP的结合(汤姆森等人，2010年). 我们之前已经证明，功能抑制性PcG复合体结合在与人类非红细胞中的人类α-珠蛋白启动子相关的CpG岛上，其中α基因转录沉默(Garrick等人，2008年). 在这里，我们通过比较人类非挤压（PcG结合）细胞与表达（PcG未结合）细胞，表明CGBP确实被排除在由PcG结合的CpG岛之外（补充图6）。因此，我们接下来确定ΔMCS-R2突变体中CGBP招募的缺乏是否与PcG持续结合有关。

PcG复合体通常与人类胚胎干细胞和多能干祖细胞中的成体（α）和胚胎（ζ）珠蛋白CpG岛结合，其中α基因的表达水平极低(De Gobbi等人，2011年). Polycomb仍然与成熟红细胞中沉默的胚胎（ζ）基因结合。相反，当该基因在成熟的红细胞中高水平表达时，PcG从相邻的α-珠蛋白CpG岛中清除(Garrick等人，2008年;De Gobbi等人，2011年). 这种模式在人性化鼠标系统中完全重现(图3，右侧面板；补充图8）。此外，我们在这里显示，随着PRC2相关染色质修饰（H3K27me3）被清除，组蛋白H3K27脱甲基酶JMJD3被招募(图3，右侧面板；补充图8）。

在单独的窗口中打开

图3。

多梳阻遏物复合物的清除依赖于MCS-R2，并与JMJD3的招募相关。图形显示如下图2在这些实验中，使用了位于胚胎ζ-珠蛋白基因（142、147和149）两侧的额外扩增子来突出突变体人类等位基因ΔMCS-R2中观察到的两个独立的PcG结构域（如左边面板）。阴影区域代表成人α-珠蛋白CpG岛，红细胞正常等位基因中的PcG通常从该岛清除（如正确的面板）。(左侧)在没有MCS-R2的情况下，PcG没有从α-珠蛋白基因中清除，因此仍然存在于这两个结构域。M Gata6代表PcG绑定的积极控制。使用的JMJD3抗体识别蛋白质的N末端区域（Millipore）。

接下来，我们研究了MCS-R2被删除的人源化小鼠，以确定上游增强子在红细胞生成期间是否在清除α-珠蛋白CpG岛上的PcG复合体中正常发挥作用。如前所述，在没有MCS-R2的情况下，沉默的ζ基因在分化过程中始终与PcG结合。然而，在缺乏MCS-R2的情况下，PRC2不再从α-珠蛋白CpG岛清除，JMJD3也不再被招募(图3，左侧面板；补充图8）。我们之前表明，α-珠蛋白基因的PcG阻遏可能由HDAC1介导（至少部分），HDAC1通常在红细胞生成过程中用PcG复合物清除(Garrick等人2008). 这里，在没有MCS-R2的情况下，HDAC1仍然与α-珠蛋白基因结合(图3). 在两个相邻的CpG岛上进行的对比观察表明，MCS-R2在成人红细胞生成过程中对α-珠蛋白（而不是ζ-珠蛋白）基因的PcG清除有特殊作用。

越来越多的证据表明，CpG岛，例如那些与α-珠蛋白启动子相关的岛，构成至少一种元素，可以介导PcG和TrxG复合物向哺乳动物启动子的募集(Mendenhall等人，2010年; MD Lynch、AJ Smith、M De Gobbi、M Flenley、JR Hughes、D Vernimmen、H Ayyub、JA Sharpe、JA Sloane-Stanley、L Sutherland等人，正在准备中）。如前所述，PcG结合位点是动态的，核小体缺失，组蛋白周转迅速（PcG的驻留时间约为几分钟）(Ficz等人，2005年). 因此，PcG结合被认为是动态的，对TrxG蛋白的拮抗作用以及其他TF和辅因子的正负输入敏感。然而，在发育和分化过程中，PcG沉默复合物从靶细胞中的驱逐是否取决于远端调控元件的存在或仅取决于作用于近端的（co）因子，目前尚不清楚顺式元素。在这项研究中，我们使用小鼠实验模型分析了在两种状态下与人类α-珠蛋白启动子相关的CpG岛：在终末分化的红系细胞中，无相互作用的远距离增强子和有相互作用的远距离增强子。我们还比较了CGBP在非表达细胞和表达细胞中的招募情况。在非红系细胞中，与α-珠蛋白基因相关的非甲基化、核酸不敏感的CpG岛被PcG结合，并且转录沉默（称为“沉默状态”）(图4A). 在没有MCS-R2的红系细胞中（称为“基础状态”），与非红系细胞相反(Garrick等人，2008年)，启动子可被某些TF访问，并与一些活性染色质修饰（例如H3K4me3）相关，转录水平相对较低（正常的约2%）(图4B). 然而，PcG复合物及其相关修饰（H3K27me3）在α-珠蛋白CpG岛上仍然很突出。我们还证明了PcG和CGBP绑定是互斥的（参见。图2和​和3）。三). 在具有MCS-R2（称为“活性状态”）的红系细胞中，PcG复合物从CpG岛上完全去除(图4C). 此外，组蛋白H3K27脱甲基酶JMJD3也被高水平招募，该酶可以去除H3K27me3，从而促进转录。SAGA复合物（如PCAF和GCN5）的募集变得突出，并建立了下游效应（如H2Bub和H3K79甲基化的沉积）。在这个阶段，高水平的转录与CGBP的结合有关。因此，我们表明，α-珠蛋白CpG岛上去甲基酶JMJD3的招募和PcG抑制复合物（包括PRC2和HDAC1）的完全清除取决于远程调控元件介导的一种或多种活动，并与基础转录和完全激活转录之间的转换有关。

在单独的窗口中打开

图4。

表观遗传调控的长期控制。(A类)在非红系细胞中，CpG岛被PcG和HDAC1完全沉默，与抑制性组蛋白标记H3K27me3相关。启动子“P”对DNaseI不敏感，不发生转录。(B)在缺乏增强子的红细胞中，该基因仍被PcG抑制，并以H3K27me3标记。在这个基本表达水平上，启动子可以被一些TF和染色质修饰酶所访问，并以中等水平的H3K4me3为标志，这反映了非常低的转录水平。(C类)在增强子存在的情况下，PcG被清除，H3K27me3组蛋白标记被去甲基酶JMJD3的招募清除。乙酰化（H3ac和H4ac）、H3K79me3和H2Bub随着HAT和Bre（SAGA）沿着编码序列“C”的扩散而增加。在这个激活阶段，剩余的TF，包括Pol II，现在完全被招募，并且发生了高转录率。CpG岛在此阶段也受CGBP的约束。

这些发现首次表明，CpG岛上PcG结合模式可能受到以下因素的影响顺式-作用元件远离相关启动子。相反，与TrxG活性（H3K4me3）相关的染色质修饰似乎更依赖于在基础转录背景下发生的CpG岛的局部变化。未来的研究将探讨长程增强子是如何发挥这些作用的。转录激活本身可能与PcG复合物的竞争性结合竞争，并负责清除这些复合物（MD Lynch、AJ Smith、M De Gobbi、M Flenley、JR Hughes、D Vernimmen、H Ayyub、JA Sharpe、JA Sloane-Stanley、L Sutherland等，预备）。第二种是上游元件也传递新的蛋白质（例如JMJD3）或修饰蛋白质（例如组蛋白），以促进PcG的去除。过去，对珠蛋白基因的详细分析确立了许多哺乳动物基因调控的一般原理，因此，远端调控元件在从靶启动子中去除PcG方面的新作用可能具有相当大的普遍重要性。

材料和方法

致谢

脚注

工具书类