基因本体联盟中基于系统发育的功能注释传播

PAINT策展人界面

PAINT为生物验证器提供了一个系统发育树和从PANTHER数据库动态检索的多序列比对，以及诸如基因和蛋白质名称和标识符等辅助信息。此外，它还显示了从实时GO数据库中动态检索的所有基于实验的注释。PAINT允许从PANTHER数据库查询和检索蛋白质家族树、多序列比对和序列注释数据[9]. PAINT还提供了到主要数据库的链接，这些数据库显示了蛋白质结构域和序列特征的注释，例如UniProt记录中的活性位点。这些序列特征在功能推理过程中发挥着重要作用，帮助管理员决定用功能增益和损耗事件注释哪些节点。PAINT将重复描述为方形内部节点，物种形成事件描述为圆形，并将进化距离估计为不同的分支长度。在试图识别和定位功能进化事件时，策展人将重复事件和加速进化率作为重要证据。GO注释以矩阵视图表示，以帮助策展人集成来自各种生物体的基于实验的注释，并对本体结构中相关的注释进行分组。

绘画推理过程

在PAINT中，注释传输是一个显式的两步过程(图1). 在第一步中，生物构造器基于祖先基因的后代的GO注释来推断该基因的GO注释。每一个基于实验的GO术语都被视为一个不同的“特征”，馆长试图推断出每一种功能最有可能是在什么时候首次进化的，并将这一推断捕获为相应祖先基因的注释。请注意，只有实验性的、基于实验的注释才能用于支持祖先的推断。因此，一个祖先基因只能用那些在至少一个后代中实验确定的功能来注释。这种范式的强大之处在于，它能够将来自许多序列的实验证据，甚至跨越本体论的不同方面，整合到祖先的推论中。GO注释由证据代码支持，如GO财团网站所述(http://geneontology.org/GO.evidence.shtml). PAINT使用一个证据码记录注释，该证据码表明注释是从生物后代（IBD）推断出来的，IBD是从序列相似性推断出来的一个子类，并使用该函数的实验数据捕获所有现存后代的数据库标识符，作为祖先注释的证据。由于GO是一个有向无环图，用子项注释的蛋白质被隐式注释到父项。此外，如果注释太具体，无法传播，注释器可以选择传播父项（粒度较小）。

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图1：

涂料的概念。这个例子展示了一个MutS同源家族，显示了“GO项”的实验证据。(A类)对一个术语或其任何祖先（浅绿色标签）的初步实验性注释被用来推断所有这些蛋白质的最新共同祖先（CA）也具有该功能。馆长通过将术语拖到MCRA（橙色框）的节点上来注意到这一点。(B)随后，PAINT将此注释向前传播到其他后代叶（蓝色标签）。

在第二步中，PAINT自动获取祖先基因的每个精心策划的注释（从第一步开始），并通过遗传将其传播到系统发育树中的所有基因后代。在这一步中，PAINT使用了一个证据代码，表明注释是从生物祖先（IBA）推断出来的，并捕获了作为证据基础推断注释的祖先基因的标识符。光标可以手动阻止向后代的传播，方法是在树中的某个点注释函数的丢失（下面讨论函数的丢失），或者从树中删除一个分支序列（“运行”）。当馆长认为序列可能放错了树中的位置，或者可能根本不属于该家族时，就使用修剪。

综合起来，这两个步骤为现有蛋白质的每个推断注释生成了完整的证据线索。

PAINT捕获的功能演变事件

我们希望在PAINT中捕获的两个“基本”功能进化事件是相对于祖先的功能获得和功能丧失。PAINT用这些事件注释祖先基因，但实际的语义是，功能进化发生在通向注释节点的树的分支上，而不是节点本身，并且可能发生得更早。

更复杂的事件被解释为功能获得和丧失的综合效应，通常是基因复制。基因复制为功能分化提供了机会[11]因此，人们通常认为直系基因（通过物种形成事件分化的基因）比副基因（通过基因复制事件分化的遗传基因）更有可能继承共同的功能。然而，这一假设仍在争论中[12]. 当蛋白质家族中存在基因复制事件时，策展人对一个或两个重复中功能获得或损失的可能性特别敏感。然而，他们并没有假设直系同源基因具有相同的功能，也没有假设特定的祖先功能在基因复制事件后一定会丢失。相反，为了推断功能进化事件最可能的系统发育位置，他们整合了来自多个来源的证据，包括GO和UniProtKB注释、树拓扑结构、序列特征（包括活性位点和蛋白质域）、生物生物学和进化速率。

功能增益

功能的获得是在蛋白质中添加功能，同时保留其其他现有功能。在PAINT中，生物验证器显示了给定家族中所有基于实验的基因GO注释。对于每一个注解，馆长都会推断出在家族进化史中，某一特定功能最有可能是在什么时候首次进化的，即哪个祖先“获得”了该功能。这被记录为系统发育树中内部节点处基因的注释，意味着该功能被推断为沿着导致该基因的分支进化而来。推断注释的位置决定了推断注释的可能“系统发育跨度”，因为只有被注释的祖先基因的直系后代才能继承该注释。功能的获得可能发生在物种形成事件之后，这意味着同源基因不会共享所有功能。一个例子发生在PTHR11361的MSH2亚家族中，其中一个最初参与识别DNA错配和募集DNA修复机制的基因在动物中被选择来调节细胞凋亡，在脊椎动物中被选择来介导免疫球蛋白基因的体细胞超突变(图2).

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图2：

功能增益。所有真核生物MSH2同源序列（最左边的橙色圆圈）的MRCA可能已经在DNA修复（从LUCA遗传，数据未显示）和DNA重复的维持中发挥作用。然后，该基因在动物MRCA中与凋亡有关，随后在脊椎动物MRCA上与免疫球蛋白基因的体细胞过度突变有关。祖先基因（橙色圆圈）的推断基于绿色显示的基因的实验GO注释，这是通过后代的遗传推断得出的，包括蓝色显示的现存生物体中的未特征化基因。因此Bos金牛例如，将由PAINT注释，其功能与中的正交函数不同酿酒酵母.

功能丧失

当生物特征在进化过程中丢失时，我们用前缀为“NOT”的限定词来注释祖先（或现存）基因NOT’注释与其他GO注释一样，由后代继承，此外还防止继承相应的正向注释。”NOT对祖先基因的注释必须有证据支持：（i）对后代序列的基于实验的注释，表明它缺乏这种功能；或（ii）序列中缺少特定残基，例如缺少活性位点残基；长分支长度表示序列快速演化。在PANTHER数据库中的磷酸葡萄糖变位酶（PGM）家族PTHR22573中可以观察到功能丧失(图3). 根据系统发育和实验注释，磷酸葡萄糖变位酶活性最有可能在最后一个通用的共同祖先之前进化，并且在大多数真核生物和真核生物中发现。该家族脊椎动物祖先的基因复制事件导致两个基因在人类中成为PGM1和PGM5。实验证明小鼠和人类PGM5都失去了磷酸葡萄糖变位酶活性。这些实验注释强烈表明，这种损失发生在鼠-人类共同祖先之前，但多久以前呢？根据几乎所有脊椎动物PGM5蛋白中存在的活性位点突变，生物验证器确定脊椎动物共同祖先中发生了功能丧失。

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图3：

功能丧失。根据PGM的3D蛋白质结构，在CDD数据库中注释了PGM1亲属的活性位点残基草履虫在PAINT中，生物验证器使用集成的多序列比对查看器来确定所有脊椎动物PGM5同源序列中的关键活性位点残基都发生了突变，这表明磷酸葡萄糖变位酶活性在复制后不久就丧失了。生物验证器相应地用“非磷酸葡萄糖变位酶活性”注释了PGM5的脊椎动物祖先，然后PAINT将其传播到所有PGM5脊椎动物直系祖先。

油漆注释指南

绘画策划过程是基于手动注释的手动过程。在某种程度上，这些手动程序是主观的，并且由于各种因素（例如注释的完整性和馆长专业知识的差异）而具有可变性。此外，手册注释是从文献中提取的，在实验描述和数据解释方面缺乏标准化。这甚至会导致产生PAINT注释的基于实验的注释中出现一些不一致。

为了增加注释的一致性和再现性，我们详细阐述了注释指南，可在http://wiki.geneontology.org/index.php/PRINT_SOP.

注释祖先基因

使用PAINT制作注释所涉及的决策过程如所示图4步骤1是根据对给定术语或其在本体中的相关术语的基于实验的注释来确定要注释哪个祖先。最初的假设是，该术语是从一个共同祖先那里继承的，因此PAINT通过自动高亮显示树中的节点来协助这一过程，该节点对应于通过实验用特定术语或其子代注释的所有序列的最新共同祖先（MRCA）。馆长可以通过考虑所有其他注释来调整这个祖先，这些注释可以是通过GO关系直接相关的注释（例如类-子类关系），也可以是生物学上相关但位于本体的不同部分甚至方面的注释。

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图4：

使用PAINT注释功能演变事件的一般工作流。第1步：馆长使用基于实验的注释给出一个初始假设，即该功能首先出现在所有基因的MRCA中，并带有相关的基于实验的注解。第二步：馆长决定哪一个祖先最适合注释：要么是最初假设的MRCA（选项A）；更早的祖先（选项B），这意味着步骤1中的MRCA很可能继承了早期祖先的注释；或更近的祖先（选项C），这意味着存在同源性，并且来自步骤1的MRCA不是该功能最初出现的地方。

考虑到这个最初的假设，馆长需要在三种可能性之间做出决定：

• 选项A：最初的假设可能是正确的，即实验注释序列的MRCA可能是它最初进化的地方。
• 选项B。实际注释应该更古老；换句话说，MRCA很可能从更古老的祖先那里继承了这种功能。在做出这一决定时，馆长考虑了诸如复制事件/形态、序列保守性、必需/活性位点残基的存在、分支长度、，以及具有不一致的实验注释的基因（即带有注释的后代，或特征明确的基因中缺少注释，这些注释很可能与注释不兼容）。确定注释的兼容性或互斥性需要馆长的仔细判断。最后，传播的实际术语也很重要：注释者对BP注释比对MF注释更保守。策展人积极寻找数据是否与重复事件或长分支后发生的功能分歧一致。
• 选项C。注释应该更新，并且可能出现多次（同构或收敛进化）。馆长认为，这种可能性更可能出现在机制上更容易聚合进化的功能，例如真核生物中的线粒体靶向（相对较短的N末端靶向肽的获得或丢失）或活性位点中的取代导致酶功能的丧失。同样，后代之间相互矛盾的注释是有帮助的，这以及评估独立进化事件的可能性都需要策展人的判断。

与现有高通量函数推理方法的比较：案例研究

与现有的全自动基于序列的算法相比，PAINT方法在人类管理员的指导下构建功能进化的显式模型，并使用该模型推断未标记基因的功能，具有一些优势。两种高度使用的算法例证了通过同源性进行自动函数预测的两种通用方法：基于家族的和基于紧密正交的。在一种基于蛋白质家族/基序的方法中，InterPro策展人手动注释以隐马尔可夫模型（HMM）表示的相关序列组（通过家族或域），以及它们可能具有的共同功能，包括GO术语[15]. 手动指定的家族GO术语会自动转移到属于该家族的每个蛋白质。由于GO分配是自动化的，因此为此分配的证据是从电子注释中推断出来的（IEA；GO_REF:00000002）。该方法准确、快速。主要限制是，由于族可以包含具有发散函数的非常发散的序列，GO赋值往往是高级项，以避免错误的注释。

相比之下，Compara[16]在所有已测序脊椎动物物种以及一些重要的非脊椎动物物种的蛋白质之间产生成对的正交关系。由人类和小鼠的实验数据支持的GO注释会自动转移到其他脊椎动物物种。为了最大限度地减少错误赋值，GO注释传输仅限于包含一对一正交的组（即在物种形成之后没有重复事件）。对于InterPro2GO，由于将GO术语分配给蛋白质的步骤是自动化的，因此分配的证据代码是IEA（GO_REF:000019）。

我们提供了两个案例研究来说明PAINT如何比较这两种高通量注释推理方法，总结如下表2选择这些例子是因为它们是由几个同源群和直系群组成的多基因家族。Compara和InterPro的注释是在2011年4月从QuickGO获得的GOA基因关联文件。

SOD1/CCS

我们首先考虑来自SOD相关家族的两个同源人类基因，SOD1和CCS。SOD1编码SOD，CCS是铜的“伴侣”，向SOD输送铜(图5). InterPro2GO用以下GO术语对它们进行了注释：“超氧物代谢过程、氧化还原过程、金属离子结合”。这些是所有家庭成员的共同职能。InterPro2GO不将SOD1与其主MF关联, ‘SOD的活性，因为这一功能并非由所有家庭成员共享，尤其是CCS分支。

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图5：

SOD家族的简化系统发育（PTHR10003）。最后一个通用的共同祖先，LUCA，在真核生物的祖先中被复制（方形节点）。与祖先差异最小的复制后代也保留了SOD活性。这在CCS分支中丢失了。

将注释扩展到其他物种

定期构建新树，以包含改进的序列或来自其他生物的序列。目前，PANTHER树包含48个完全测序的基因组的基因，计划将这个数字增加到UniProt团队与更广泛的直系预测社区合作开发的新兴标准(http://www.ebi.ac.uk/reference_proteomes/). 油漆衍生GO注释已经可用于这48种生物体的基因。PANTHER树构建过程为节点分配稳定的标识符，以便在生成PANTHER数据库的新版本时，PANTHEL将报告哪些树节点发生了拓扑更改。当这种情况发生时，树将被标记，以验证注释是否仍然有效，并且重新注释是否合适。我们已经证明，当添加更多序列时，用于树构建的算法非常健壮，超过85%的树完全不变，只有2%的树发生了重大变化[10]. 因此，由于更改了树拓扑，注释中的修订应该很少。我们希望这些重新注释应该很容易地集成到定期注释更新中，这些更新需要随着新数据的发布而定期进行。

PAINT功能预测的局限性

绘画的一个主要限制是需要手动管理时间。为了估计所需的时间，我们进行了一项初步研究，在该研究中，对覆盖GO参考基因组中约1%基因的家族进行了注释。这涵盖了PantherDB 7.0版中48个物种的70个蛋白质家族和大约9100个蛋白质。这需要约40天的生物测定时间，使所有基因（在至少有一个实验特征基因的家族中）的注释成为GO联盟的可行目标。此外，尽管我们已经制定了许多关于绘画策展的指南，正如在任何手动策展过程中一样，我们预计由于个别策展人的培训和专业知识的差异，以及对特定家庭可用策展时间的依赖性，注释会发生变化。最后，与任何函数预测方法一样，主要的局限性是实验注释的全面性。例如，对于人类PGM5，如果我们没有任何关于磷酸葡萄糖变位酶活性所需残基的信息，也没有脊椎动物中PGM5直向同源物的任何实验结果，我们的过程就会错误地将人类PGM5注释为具有磷酸葡萄糖变位酶活性，就像InterPro2GO所做的那样。绘画推论的完整证据线索在这方面非常重要，因为它使我们能够准确地知道馆长做出了哪些推论。随着更多实验证据的积累，这将简化注释的更新和更正。我们已经有了一个软件管道，可以检测经过PAINT注释的族中的注释更改，并相应地进行更新。