圆形Res。作者手稿；PMC 2011年9月18日发布。
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美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院70225
纤维结合蛋白的肝素-II结构域是一种血管内皮生长因子-结合结构域
单一生长因子/基质蛋白协同增强VEGF生物活性
西雅图普吉特湾卫生保健系统退伍军人事务部血管外科和华盛顿大学医学院外科（E.S.W.，M.N.，J.M.，M.S.）；英国伦敦圣托马斯医院国王学院伦敦医学院血栓形成和血管重塑实验室（S.R.，Y.P.）；日本鹿儿岛大学科学与工程研究生院纳米结构与先进材料系和创业商业实验室；以及英国曼彻斯特大学生物科学学院威康信托细胞基质研究中心
联系Error S.Wijelath博士，研究服务-151，1660 S Columbian Way，Seattle，WA 98108。乌德·诺格尼肖.u@wlorre - 补充资料
补充。
GUID:E30EDE06-8668-4673-95E2-D71EF9283537
摘要
我们描述了纤维连接蛋白（Fn）和血管内皮生长因子（VEGF）之间影响整合素生长因子受体串扰和细胞反应的细胞外相互作用。在之前的工作中，我们发现VEGF与纤维连接蛋白（Fn）特异性结合，但不与玻璃体凝集素或胶原蛋白结合。在此，我们报告了VEGF与Fn的肝素-II结构域结合，Fn的细胞结合和VEGF结合结构域在物理连接时，对于促进VEGF诱导的内皮细胞增殖、迁移和Erk活化是必要的和充分的。利用重组Fn结构域，Fn的C末端肝素-II结构域（III型重复序列13至14）被鉴定为关键的VEGF结合位点。FnIII上肝素结合残基的突变13–14消除了FnIII中VEGF结合和与肝素结合序列相对应的肽13–14抑制VEGF与Fn的结合。Fn片段包含α5β1整合素结合域（III 9至10）和VEGF结合域（II 13至14）显著增强VEGF诱导的EC迁移和增殖，并诱导VEGF受体和Erk的强磷酸化。Fn的细胞结合或VEGF绑定片段单独都没有类似的VEGF促生作用。这些结果表明，VEGF/Fn协同作用的机制是通过形成一种新的VEGF/Fn-复合物在细胞外介导的，这种复合物需要将细胞结合域和VEGF-结合域连接在一个分子单元中。这些数据还强调了Fn-C末端肝素结合域的一种新功能，该功能可能对血管生成和肿瘤生长具有重要意义。
关键词：内皮细胞分化、内皮细胞生长、内皮细胞、纤维连接蛋白、整合素、信号转导、血管内皮生长因子、血管内皮细胞生长因子受体
纤维连接蛋白（Fn）和血管内皮生长因子（VEGF或VEGF-A）是血管生长的关键调节因子。1——三基因缺失研究表明Fn和VEGF及其同源受体α5β1和VEGF受体-2（VEGFR-2）对血管发育至关重要。4——9在血管生长过程中，内皮细胞被招募到细胞激活、基因表达、粘附、运动和增殖的严格控制程序中。10,11整合素和生长因子受体（受体酪氨酸激酶，RTK）之间的串扰是这一控制过程的关键部分。12——16EC对VEGF等生长因子的反应由整合素传递的外源信号调节，反映细胞外环境的状况。因此，细胞外基质（ECM）蛋白的局部混合物以及细胞表达的整合素的类型和密度可能会调节其对生长因子的反应。Groopman及其同事发现，特定基质蛋白与整合素的结合可以通过以下途径激活VEGF受体：α5β1,17以及Moro等人对表皮生长因子受体的研究。18其他人已经表明β1Fn激活可调节VEGF反应，19还有那个β三激活可增加肿瘤细胞中VEGF的生成。20相反，VEGFR-2被VEGF占据可以激活整合素。Byzova等人已经证明VEGF激活了αv（v）β三和α5β1在EC上。21最后，整合素和受体酪氨酸激酶（RTK）共享许多重要的信号分子，包括Src、FAK和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）。13我们之前的工作集中在Fn和VEGF及其同源受体之间相互作用的特异性上，α5β1和VEGFR-2。22,23我们发现VEGF与Fn结合，血小板分泌VEGF/Fn复合物。在配体VEGF和Fn存在的情况下，它们相应的受体共同免疫沉淀。Fn（而非vitronectin）诱导持续的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活以响应VEGF。因此，我们预测Fn的VEGF增强活性部分归因于其与VEGF的结合。
本研究旨在更精确地定位Fn C末端区域内VEGF的结合位点，并确定Fn诱导VEGF活性增强的机制。利用重组Fn片段和合成肽，我们将VEGF结合位点映射到Fn III型模块13至14的已建立的肝素-II（Hep-II）位点。24,25Fn的这种VEGF结合域被认为是必要的，但其本身并不足以促进VEGF的生物活性。只有二价Fn结构包含α5β1和VEGF结合域显著促进内皮细胞迁移、增殖和维持Erk磷酸化。纯共刺激信号（通过整合蛋白和VEGFR-2受体的占据）对VEGF活性的影响较小，因为VEGF与含有细胞和VEGF结合域的单价Fn片段的混合物显示出较少的迁移、增殖，并且没有Erk磷酸化的晚期。
材料和方法
细胞培养
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）（级联生物制剂）保存在MCDB-131生长培养基（含有5%FBS、2 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子[bFGF]、10 ng/mL VEGF和10μg/mL肝素）。第3代至第8代之间的HUVEC用于实验。
cDNA构建
利用人肝mRNA通过RT-PCR获得人Fn cDNA，并对其进行测序，以验证PCR扩增过程中无碱基变化。以Fn cDNA为模板，通过PCR扩增获得FnⅢ型模块。我们使用以下术语来描述重组Fn结构：rFnIII9–10表示包含III型重复序列9至10的重组Fn蛋白；rFnIII公司9–10/12–14，包含III型的单个蛋白质重复9到14次，省略11次。A rFnIII型12–14如前所述，FnIII结构域13和14上的肝素结合位点发生突变（Arg或Lys→Ser，称为“gag AC”）。26有关rFn质粒的构建及其表达和纯化的详细信息，请参阅在线数据补充，网址为http://circres.ahajournals.org.
EC迁移分析
在存在不同rFn片段（0.2μ摩尔/升；底部腔室）。如前所述，使用了96孔ChemoTx微量滴定板（Neuro Probe Inc）。22,27阳性和阴性对照组包括10岁时的天然Fn、卵磷脂或白蛋白μg/mL，代替测试的rFn片段。
内皮细胞增殖试验
在含有纤维连接蛋白缺失的FBS（0.25%）的MCDB-131培养基中培养96周板中的早期HUVEC（3000个细胞/孔）。将细胞与白蛋白、单独的VEGF（10ng/mL）或VEGF与天然Fn（10μg/mL）或rFn片段（0.2μmol/L）持续72小时。肝素的最终浓度为1μg/mL。根据制造商的说明，使用CyQuant试剂（分子探针）测定细胞生长。
Western Blot分析
Erk磷酸化分析，5×105HUVEC被镀到60cm2培养皿，在MCDB-131生长培养基中培养过夜。然后将细胞清洗两次，并在无血清MCDB-131培养基中培养4小时。用VEGF（10 ng/mL）或不同Fn组合的VEGF刺激细胞。在不同的时间点，如前所述，对细胞进行裂解并检测Erk磷酸化。28通过NIH Image程序量化信号密度，磷酸化蛋白的激活表示为基础（非刺激）水平的倍数增加，并根据总蛋白负荷进行调整，从单独的印迹中测量。
为了测量VEGFR-2磷酸化，HUVECs（2×106细胞）在MCDB-131生长培养基中培养48小时。在检测之前，对培养物进行清洗，并用含有ITS补充剂（BD Bioscience）的无血清MCDB-131替换，然后再培养4小时。然后在没有或存在rFNIII的情况下，用低剂量VEGF（1 ng/mL）刺激培养板9–10/12–14在37°C下保持2分钟。细胞裂解物与抗VEGFR-2兔单克隆抗体（细胞信号）在4°C孵育16小时，免疫复合物与蛋白G sepharose沉淀。蛋白质样品被还原，用Bis-Tris PAGE凝胶分离，转移到聚二氟乙烯（PVDF）膜上，用抗磷酸VEGFR-2抗体和化学发光产生的信号进行探测。去除印迹物，并用抗VEGFR-2重新进行标记。
125I-VEGF固相结合分析
直接结合的测量125如前所述，对Fn片段进行I-VEGF。22对于肽竞争分析，使用相同的结合分析方法，重组C末端rFn III9–10/12–14或rFnIII12–14固定在盘子上。
表面等离子体共振分析
进行表面等离子体共振分析（SPR）结合实验以测量VEGF之间的平衡结合参数165和天然纤维连接蛋白或rFnIII9–10/12–14详细方法在别处描述。29简言之，使用2通道SPR670M仪器（Moritex Corp）和PBS（0.05%吐温-20）的流动缓冲液，流速为15μ室温下L/min。基质蛋白固定在金芯片上，使用N个-羟基琥珀酰亚胺偶联、VEGF浓度范围内（25至800 nmol/L）记录的传感器图，以及使用制造商软件得出的动力学结合参数。
统计分析
单独的实验至少进行三次，所提供的数据是至少3到4次独立实验的平均值和SEM，如前所述。学生的t吨试验用于比较不同处理。
结果
纤连蛋白片段的表达与纯化
说明了天然纤维连接蛋白的示意图和重组片段的设计。按照材料和方法中的描述，每种蛋白质都被表达和纯化到同质性。Bis-Tris PAGE凝胶显示纯化蛋白的代表性样品。
人类Fn域结构示意图，显示了I型、II型、III型及其功能。图中还显示了本研究中使用的重组Fn III型结构域，左边是纯化片段的典型SDS-PAGE凝胶。
VEGF与重组Fn结构域的结合及肽竞争
我们首先测量了125I-VEGF（血管内皮生长因子）165结合不同的固定化重组Fn片段。这些实验都是在没有外源性肝素的情况下进行的，这表明肝素不是VEGF/Fn结合所需的辅因子。在初步实验中，通过蛋白质分析测量沉积在平板上的实验蛋白质的实际数量，确认所有测试蛋白质的最终涂层密度是可比较的。如所示，VEGF结合的rFnIII12–14和rFnIII8–14以集中相关的方式。绑定到rFnIII8–11可以忽略不计。在随后的结合分析中，涂层浓度为0.2μ所有蛋白质均使用mol/L。然后评估VEGF与单个rFnIII结构域的结合。表明VEGF与所研究的任何单个III型结构域都没有显著结合，但与所有含有FnIII的片段都有结合13–14连续性（即本机Fn、rFn8–14，rFn12–14).显示了α5β1rFnIII的整合素结合域12–14（如结构rFnIII8–14或III9–10/12–14)与rFnIII相比，VEGF结合进一步增强12–14独自一人。血管内皮生长因子与rFnIII的结合8–14和rFnIII9–10/12–14与天然Fn相比，Fn始终较高，表明这些片段的亲和力较高。表面等离子共振结合分析用于比较rFnIII的VEGF亲和力9 –10/12–14到本地Fn。rFnIII9–10/12–14碎片的离解常数降低了43%(K（K）d日73.5与129.3 nmol/L），开启速率更快，关闭速率更小(补充表一). 因为FnIII区域12–14是一个重要的肝素结合区，24,25,30我们想确定FnIII的关键肝素结合残基12–14需要结合VEGF。为此，构造rFnIII2012年9月10日至14日gagaAC如前所述，将重复序列13和14的赖氨酸和精氨酸突变为丝氨酸。26
表明这些肝素结合残基的丢失完全消除了VEGF结合。
浓度相关125I-VEGF与固定化rFn片段的结合。125I-VEGF在涂有越来越多rFn片段浓度的微孔中培养2小时。清洗后，用0.1 mol/L NaOH/1%SDS洗脱结合的VEGF，并在γ计数器中定量放射性。数据表示为三次测定的平均值±SEM。
绘制C-末端Fn上的VEGF结合位点。A和B，125在涂有单个或连续rFn III型结构域（0.2μmol/L）（A）或覆盖rFn分子的孔，包括整合素（9至10）和肝素结合域（12至14）（B）。GagAC表示III型模块13和14上肝素结合域的突变。清洗后，用0.1 mol/L NaOH/1%SDS洗脱结合的VEGF，并在γ计数器中定量放射性。数据是一式三份的3到4个独立实验的平均值±SEM。虚线是对照组与白蛋白结合的95%置信区间。
包含FnIII中天然肝素结合区域的肽（表中列出）13–14也被用作125I-VEGF与固定化rFnIII的结合12–14或rFnIII9–10/12–14.还研究了另外两种肽：一种截短的肽，含有FnIII的假定关键肝素结合位点13以及von Willebrand因子（vWf）A1结构域的一个特征良好的肝素结合位点31(). 与rFnIII结合的VEGF的肽竞争结果12–14，或rFnIII9–10/12–14底物没有显著差异，因此数据被合并。这个显示其估计IC50（抑制VEGF结合50%的浓度），以及显示了它们的抑制曲线。最有效的肽是FnIII中的肝素结合区14（核心主题是PRAR）。排名第二和第三的是来自FnIII的肝素结合肽13（核心图案PRRAR）和FnIII14（IYVIALKNNQKSEPLIGRKKT）。截断FnIII的肝素结合域13消除了其与固定化Fn片段竞争结合VEGF的能力。将每个肽竞争对手的效力与其总碱基残基数相关联。肽电荷解释了肽对VEGF的某些而非全部表面亲和力。最有效的Fn肽与vWf肝素结合肽具有相同的净电荷，但具有IC50这要低600倍。共享PRRAR或PRAR基序的其他2 Fn肽具有相同数量的肝素结合残基，但亲和力相差3.5倍。
抑制血管内皮生长因子与rFnIII结合的肽9–10/12–14.125I-VEGF/Fn结合分析是在含有.A，结果表示为在没有竞争对手的情况下观察到的VEGF结合的百分比（100%），并且是一式三份进行的4-6个独立实验的平均值±SEM。B、 集成电路50(μmol/L）对每种肽进行插值，并与碱基残基/肽的总数进行绘图。
相对抑制125I-VEGF（血管内皮生长因子）165肝素结合肽结合
| 蛋白质 | 肽序列 | 国际资本50(μ摩尔/升） |
|---|
| rFnIII公司13 | 1814年vspprrarvtdatettitiswrtktetitgfq | 43 |
| rFnIII型13（已截断） | 1814 pprrarv | >1000 |
| rFnIII公司14 | 1926年praritgyiikyekpgspprevvpvprpgv | 0.4 |
| rFnIII公司14 | 1971年iyvialknqksepligrkkt | 150 |
| von Willebrand因子 | 568 kdrkrselrriasqvk | 250 |
促进VEGF介导的EC细胞迁移和增殖的Fn结构域的特异性
我们假设，独特的细胞外VEGF/Fn复合物的形成促进了VEGF的生物活性，部分由Fn同时结合的双价能力介导α5β1和血管内皮生长因子。因此，我们测量了在不同的天然和重组基质蛋白存在下，血管内皮细胞对血管内皮生长因子的迁移和增殖。显示在缺乏基质成分或添加rFnIII的情况下，细胞向VEGF的迁移最小12–14独自一人。大多数含有整合素结合域的蛋白质（例如，卵黄凝集素、rFn9–10和rFn2012年9月10日至14日gagaAC)支持向VEGF迁移。相反，所有二价矩阵都包含α5β1和VEGF结合域（FnIII8–14和FnIII9–10/12–14)细胞迁移增加2到3倍。为了区分通过独立配体（即整合素和生长因子受体）的简单共刺激信号，在rFnIII分离结构域混合物的等效浓度下，还测量了向VEGF的趋化迁移9–10和rFnIII12–14这种混合物确实支持基线以上的少量细胞迁移，但并没有增加到连接这两个结构域的二价Fn结构体诱导的迁移程度。
A、 在rFn片段存在的情况下，EC向VEGF迁移。将悬浮在含有0.1%卵清蛋白的无血清MCDB-131培养基中的HUVEC接种到ChemoTx微量滴定板上，并按照材料和方法中的描述进行迁移分析。实验一式三份，结果用平均值±SEM表示。最后一条横线（由9-10+12-14表示）表示用rFnIII的单独片段的混合物进行处理9–10和rFnIII12–14，每个为0.2μmol/L.B，EC对VEGF和rFn片段的增殖反应。将96孔板中的HUVEC（3000个细胞/孔）在含有Fn贫化FBS（0.25%）的MCDB131培养基中孵育。细胞分别与VEGF单独培养（10 ng/mL）、VEGF（V）与天然Fn培养（5 ng/mL）或rFn片段培养（0.2μ摩尔/升）。在一些实验中，肝素（hep）的最终浓度为1μg/mL。72小时后测定细胞生长。实验一式三份，结果表示为平均值±SEM。
接下来我们研究了rFn片段是否促进VEGF诱导的HUVEC增殖。如所示在天然Fn或rFnIII的存在下，HUVEC对VEGF的反应程度增强9–10/12–14与细胞或VEGF结合域（rFnIII）相比9–10或rFnIII12–14). 添加肝素（1μg/mL）进一步增加VEGF/Fn复合物的增殖，与肝素单独增加VEGF增殖的程度相同。Fn的细胞结合片段和VEGF结合片段的混合物（在相同浓度下，10μg/mL）与二价片段相比，增殖增加较少。
特定rFn域对VEGF介导信号的调制
此前，我们的实验室报告称，VEGF/Fn复合物延长了VEGF单独诱导的细胞信号传导，22提示这种细胞外复合物可能影响细胞信号的大小和持续时间。因此，我们检测了Erk信号对VEGF和不同Fn域的时间进程和敏感性。如所示VEGF与天然Fn结合后，早期（5分钟）磷酸化峰值较高，在1.5到3小时时活化更持久。与原生Fn相比，rFnIII9–10/12–14诱导了更高的早期峰值和大约1.5小时的第二个Erk激活峰值。rFnIII混合物9–10和rFnIII12–14（在与其他测试片段相同的单个浓度下）未诱导任何晚期Erk激活。当单独测试时，细胞结合（rFnIII9–10)或VEGF-结合域（rFnIII12–14)没有诱导任何晚期Erk激活。二价重组Fn片段rFnIII9 –10/12–14，即使在非常低的VEGF浓度（0.1至0.5 ng/mL）下，也显著增强VEGF诱导的Erk磷酸化(). 接下来我们研究了rFnIII的影响9–10/12–14低剂量VEGF激活的VEGFR-2磷酸化状态。显示单独的VEGF（1ng/mL）没有显著诱导VEGFR-2磷酸化。然而，在rFnIII在场的情况下9–10/12–14，观察到显著的VEGFR-2磷酸化。用VEGF和rFnIII刺激细胞9–10或rFnIII12–14未显示VEGFR-2磷酸化增强。
VEGF和Fn部分对HUVEC-Erk磷酸化的反应。HUVEC暴露于10 ng/mL的VEGF165结合指示的Fn蛋白（0.2μ摩尔/升）。在这些时间点，收集并处理细胞，通过Western blotting测量磷酸化Erk和总Erk蛋白。图表上的每个点是从4到5个单独的实验中获得的数据的平均值，并按照材料和方法中的描述进行量化。
rFnIII公司9–10/12–14在低VEGF浓度下促进Erk和VEGFR-2磷酸化。A和B，HUVEC在缺乏（A）或存在（B）rFnIII的情况下暴露于不同浓度的VEGF9–10/12–14(0.2μ摩尔/升）。Western blotting检测Erk磷酸化。显示了来自两个单独实验的代表性印迹。C、 在没有或存在重组Fn片段（0.2）的情况下，用低剂量VEGF（1 ng/mL）刺激HUVEC培养物μ摩尔/升）。用抗VEGFR-2兔单克隆抗体免疫沉淀细胞裂解物，然后用抗磷酸VEGFR-2兔单抗进行Western印迹。去除印迹并用抗VEGFR-2抗体进行复制。实验重复了两次，结果相似。
讨论
基于我们之前的研究，我们假设Fn可能是VEGF的独特生物伴侣：当Fn与VEGF复合时，它们与同源受体的协同结合增强了对VEGF的特异性细胞反应。这些细胞外事件可能是调节从受体连接到细胞反应的复杂信号通路的重要步骤。在本报告中，我们将VEGF的一个关键Fn-结合位点物理映射到III型重复序列13-14（Hep-II结构域）内的纤维连接蛋白C末端结构域。先前的研究已将该位点确定为肝素结合域。24,25,30Hep-II位点是一个主要的合成癸烷结合位点，在局部粘附和应力纤维形成中发挥作用。32本报告揭示了Hep-II区作为VEGF结合位点以及VEGF活性调节剂的新功能。进一步缩小结合位点，我们观察到从FnIII的N末端获得的肽14在阻断VEGF结合方面最为有效，尽管代表肝素结合位点的其他肽也受到抑制。此外，该Fn结构域的肝素结合特性在VEGF亲和力中占很大一部分。肝素突变片段不能结合VEGF，也不能促进VEGF的生物活性。
这些实验的第二个重要发现涉及VEGF和Fn之间的生物协同机制。我们发现，单独的Fn的VEGF结合结构域不足以增强VEGF介导的细胞迁移、增殖或生长因子信号传导，即使它强烈地结合VEGF。然而，在rFn的构建中，细胞结合域和VEGF结合域在物理上相连，显著增强了这些细胞反应，甚至比天然Fn更为明显。rFn片段仅包含细胞结合域（FnIII9–10)确实适度增强了VEGF的生物反应。这些结果可能反映了已知存在于α5β1然而，目前的数据表明，当其受体被一种特殊的VEGF/Fn复合物占据时，这些协同途径能够产生更强烈的反应。rFnIII9–10/12–14构建物显著增加了对VEGF的早期Erk磷酸化反应，并在1.5小时诱导了Erk激活的主要晚期峰值。因此，这些配体/受体相互作用的协调细胞外调节对VEGF的细胞内信号反应施加了更严格的方向。
一些证据表明，VEGF和Hep-II结构域之间的结合相互作用是复杂的。VEGF不与任何单个孤立的固定化III型重复序列结合，但VEGF与包含III型重复片段的Fn部分结合12–14连续重复。这表明Hep-II结构域中更复杂的三级结构对VEGF结合是必要的。我们观察到构造rFnIII8–14和rFnIII9–10/12–14结合的VEGF多于rFnIII12–14独自一人。如果FnIII9–10它本身没有固有的VEGF结合特性（正如我们观察到的那样），为什么包含FIII的更大的构造应该9–10更积极地结合VEGF？这些较大的构造（FnIII8–14和FnIII9–10/12–14)很可能假设一种构象能更好地显示VEGF结合位点。这得到了表面等离子共振研究的支持，研究表明rFnIII9–10/12–14与天然Fn相比，VEGF的亲和力更高。包含整合素和VEGF结合位点的二价Fn结构体也比天然Fn更具生物有效性。这也可能是由于构象差异，或缺乏天然Fn的大部分N端和C端区域，这可能对VEGF功能起负面调节作用。
FnIII的肝素结合特性12–14结构域显然很重要，如肝素突变体片段未能结合或调节VEGF活性所示。肝素突变蛋白行为的另一种解释可能是突变改变了Fn片段的构象。Mostafavi Pour的研究表明，这些突变不会严重改变蛋白质的构象。26此外，突变（或野生型重组）蛋白的构象变化也不能解释为什么从这些肝素结合域中选择的肽成功地与rFnIII竞争9–10/12–14用于结合VEGF。
然而，肽竞争实验也表明肝素结合并不是整个VEGF/Fn结合过程。III中的肝素结合位点13被认为是肝素的主要交互位点，24,25然而，其肽域在阻断VEGF结合方面不是最有效的，其截短形式（核心肝素结合残基）也没有保留活性。同样，肽电荷与抑制效力的比较表明，非静电、蛋白质/蛋白质相互作用也可解释VEGF/Fn结合。vWf肝素结合肽是一种高电荷的经典肝素结合域，对VEGF的亲和力相对较低。这个相同的vWf蛋白结构域被证明会干扰细胞粘附强度和趋化性，可能是因为它会干扰细胞合成癸烷与Fn的Hep-II结构域的结合。33因此，从细胞表面合成聚糖的角度来看，vWf肝素结合域可能模拟Fn-Hep-II区域，但从VEGF的角度来看则不然。最后，rFn-VEGF结合不需要外源性肝素(和). 肝素对rFn/VEGF复合物的生物活性具有与其单独对VEGF的作用相同的轻度刺激作用（这一点已得到很好的描述）。
整合素/生长因子协同作用的许多机制已被提出，许多强调细胞内信号串扰的途径。来自的信号α5β1连接（和syndecan结合）可以支持或加强VEGFR-2到Erk的下游信号传导。22相反，VEGFR-2激活可导致整合素激活。21对于与VEGF通路协同作用的主要整合素是否为α5β1或αv（v）β三.21,34这可能是由于细胞在受到VEGF刺激时所接触的ECM蛋白类型所致。我们以前的研究表明，VEGF/Fn复合物主要导致VEGFR-2和α5β1，但不是αv（v）β三.22此外，我们还表明，VEGF/Fn复合物以及肝细胞生长因子/Fn复合体存在并从凝血酶刺激的脱颗粒血小板中释放出来。22,35这些观察结果表明血小板可能在促进血管生成中发挥作用。Kisucka等人最近的研究表明，血小板在调节体内血管生成中发挥着作用。36我们还观察到α5β1深度抑制VEGF介导的内皮祖细胞迁移和分化。22,23这些发现支持Hynes及其同事的观点，即α5β1是血管发育的关键整合素。6,37,38目前的实验表明，Fn诱导的VEGF活性增强的机制来自与细胞表面受体相互作用的细胞外复合物的形成以及由此产生的整合素和VEGF受体协同刺激信号的促进。自由、独立配体与整合素和生长因子受体的简单结合不会诱导相同质量或数量的信号传导，尤其是晚期持续的Erk磷酸化。为了支持我们的假设，最近对平行系统的研究表明，碱性成纤维细胞生长因子与纤维蛋白原的结合是增强碱性成纤维生长因子诱导的血管生成所必需的。39
还需要更多的工作来确定VEGF内的交互位点，并定义Fn的CS-1结构域的作用，在这方面仍有待阐明。对这些协同作用的结构/功能关系的进一步了解应允许开发和优化Fn-衍生结构，该结构专门放大（或抑制）VEGF的生物作用。
致谢
资金来源
这项研究得到了NIH（R01HL39003和HL079182）、退伍军人事务部医学研究服务（M.S.）、美国心脏协会（E.S.W.）和日本科学技术署（Y.S.）的资助。
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