埃博拉病毒（EboV）和马尔堡病毒（Marburg）丝状病毒感染会在人类中引起一种快速致命的出血热，目前尚无批准的抗病毒药物1丝状病毒的进入是由病毒棘突糖蛋白（GP）介导的，GP将病毒颗粒附着在细胞表面，将其传递到内体，并催化病毒和内体膜之间的融合2.病毒膜融合可能需要内体室中的其他宿主因子。然而，尽管付出了相当大的努力，这些关键的宿主因子仍然无法进行分子鉴定三,4,5在这里，我们描述了人类细胞中全基因组单倍体基因筛查，以确定埃博病毒进入所需的宿主因子。我们的筛查发现67个突变破坏了HOPS多亚单位栓系复合体的所有六个成员，该复合体参与了内体与溶酶体的融合6，和39个破坏内/溶酶体胆固醇转运蛋白Niemann-Pick C1（NPC1）的独立突变7对HOPS复合物或NPC1功能有缺陷的细胞，包括来源于人类尼曼-匹克C1型疾病患者的原代成纤维细胞，对埃博拉病毒和MarV的感染具有抵抗力，但对一系列无关病毒仍然完全敏感。我们表明，丝状病毒糖蛋白介导的膜融合和病毒从囊泡室逃逸需要NPC1蛋白，这与其已知的胆固醇转运功能无关。我们的发现揭示了丝状病毒进入途径的独特特征，并提出了对抗这些致命毒剂的潜在抗病毒策略。
我们开发了单倍体基因筛查，以深入了解与人类疾病相关的生物过程8,9在这里，我们使用这种方法以前所未有的详细程度探索丝状病毒进入途径。为了调查数百万埃博病毒进入缺陷的基因破坏事件，我们使用了一种携带埃博病毒糖蛋白的可复制水泡性口炎病毒（rVSV-GP-EboV）10虽然该病毒在大多数细胞系中复制，但它不能有效杀死近单倍体KBM7细胞(图S1C). 通过OCT4、SOX-2、c-MYC和KLF4的表达诱导KBM7细胞多能性失败11，我们获得了HAP1细胞(图S1A). HAP1细胞粘附生长，不再表达造血标记(图S1B). 早期传代培养中的大多数细胞都是所有染色体的单倍体，包括8号染色体（在KBM7细胞中是二倍体）。与KBM7细胞不同，HAP1细胞对rVSV-GP-EboV敏感(图S1C)允许筛选丝状病毒宿主因子。
我们使用逆转录病毒基因捕捉载体9诱变早期传代HAP1细胞。为了生成控制数据集，我们使用深度排序映射了约800000个插入(表S1). 接下来，我们选择rVSV-GP-EboV-resistance细胞，将其扩展为一个池，并绘制插入位点。通过比较耐药细胞和对照数据集中的基因突变频率，计算基因突变的富集度(图S2). 我们在rVSV-GP-EboV耐药细胞群中发现了一组突变丰富的基因(,第3章和表S2). 几乎所有这些候选宿主因子都与内切/溶酶体室的结构和运输有关。令人欣慰的是，我们的筛选发现了组织蛋白酶B（CatB），这是唯一一种已知的宿主因子，其缺失会抑制埃博拉病毒的进入5进一步检测表明，同源融合和空泡蛋白分选（HOPS）复合物的所有6个亚基（VPS11、VPS16、VPS18、VPS33A、VPS39和VPS41）中的突变高度富集，我们鉴定了67个独立突变。HOPS复合物介导内体和溶酶体的融合6并影响内体成熟12,13对HOPS复合体所有成员的识别表明，我们的屏幕覆盖率很高，可能会饱和。我们还确定了与内体生物发生有关的因素（PIKFYVE、，)14、溶酶体（BLOC1S1、BLOC1S2）15以及靶向内吞途径（GNPTAB）的管腔货物16受打击最大的是尼曼-匹克病基因座NPC1，编码内切/溶酶体胆固醇转运蛋白7NPC1也影响内体/溶酶体融合和分裂17，钙稳态18和HIV-1释放19。
单倍体基因筛查确定HOPS复合物和NPC1是丝状病毒进入的宿主因子a、，与未选择的对照细胞相比，在rVSV-GP-EboV选择的细胞群中富集用于基因陷阱插入的基因。圆圈代表基因，其大小对应于rVSV-GP-EboV选定群体中确定的独立插入数。基因是根据染色体的位置在X轴上排列的。b、，突变克隆中NPC1、VPS33A和VPS11表达水平的RT-PCR分析。c、，VSV伪型与指定丝状病毒糖蛋白的感染性。显示平均值±标准偏差（SD）（n=3）。埃博病毒、埃博拉病毒（扎伊尔）、马尔病毒、马尔堡病毒*低于检测极限。日期：，HAP1克隆感染病毒，包括携带狂犬病或博尔纳病病毒糖蛋白的重组VSV病毒（rVSV-G-RABV和rVSV-GP-BDV），并用结晶紫染色。
感染真正的埃博拉病毒和马尔堡病毒需要NPC1功能a、，NPC1患者成纤维细胞在0.1倍感染率（MOI）下暴露于埃博氏病毒或巨细胞病毒。采集上清液并测量感染病毒的产量*低于检测极限。b、，用DMSO或U18666A（20μM）处理过的Vero细胞，以0.1的MOI感染EboV或MarV，并测量感染病毒的产量。c（c）人外周血单核细胞衍生树突状细胞（DC）和脐静脉内皮细胞（HUVEC）在存在或不存在U18666A的情况下以3的MOI感染，并通过免疫染色测定感染细胞的百分比。日期：，用表达非靶向shRNA（Ctrl）或靶向NPC1的shRNA的慢病毒载体转导HUVEC，在MOI为3时感染EboV或MarV，并测定感染细胞的百分比。细胞的代表性图像也显示：绿色，病毒抗原；蓝色，核染色。对于面板a–d，显示平均值±SD（n=2至3）。在面板中a–b，错误条不可见，因为它们位于符号内。对于面板c–d码，**p值<0.01，***p值<0.001。e、，NPC1的存续+/+和NPC1−/+小鼠（每组10只）腹腔接种约1000 pfu小鼠适应的埃博氏病毒或巨细胞病毒。f、，针对CatB、HOPS复合体和NPC1在埃博拉病毒进入中的作用提出的假设模型。
我们亚克隆了耐药细胞群体，以获得VPS11、VPS33A和NPC1缺失的克隆(图S4A、B和). 这些突变体对rVSV-GP-EboV感染和带有EboV或MarV-GP假型的VSV感染表现出显著的耐药性(和图S4C). 尽管如此，缺乏功能性HOPS复合物或NPC1的细胞仍然完全容易受到其他大量包膜和非包膜病毒的感染，包括携带不同病毒糖蛋白的VSV和重组VSV(和第5章). 通过表达相应的cDNA恢复HAP1克隆对rVSV-GP-EboV感染的敏感性(图S6A、B、C)。
NPC1缺失导致尼曼-匹克病，这是一种以胆固醇和鞘脂在溶酶体中积聚为特征的神经内脏疾病7我们测试了患者原代成纤维细胞对丝状病毒GP依赖性感染的敏感性。NPC1突变细胞被rVSV GP EboV和用丝状病毒GP蛋白假型的VSV感染很少或根本没有感染()通过表达野生型NPC1恢复感染()。
丝状病毒糖蛋白介导的病毒感染需要NPC1而不是NPC2a、，健康个体和携带NPC1或NPC2纯合突变的患者的原代皮肤成纤维细胞用filipin染色，或用rVSV-G或rVSV-GP-EboV攻击。通过荧光显微镜观察到染有菲律宾血迹（黑色）和感染细胞（绿色）。为了清晰起见，将菲律宾染色的图像倒置。蓝色表示赫斯特核染色。b、，对照组和Niemann-Pick成纤维细胞中病毒糖蛋白伪型VSV的感染性*低于检测极限。c、，表达空载体或人类NPC1的NPC1患者成纤维细胞用filipin染色或用rVSV-GP-EboV激发。日期：，用指示浓度的U18666A预培养30分钟后，Vero细胞中rVSV-G和rVSV-GP-EboV的感染性。比例尺，200μm(一,c（c）). 显示平均值±SD（n=3至6）(b条,d日)。
NPC2突变导致相同的临床症状和脂质转运的现象学缺陷20令人惊讶的是，来自不同患者的NPC2-突变成纤维细胞易受丝状病毒GP依赖性感染(和图S7)尽管NPC2和NPC1突变细胞中胆固醇积累相似(). 此外，通过在缺乏脂蛋白的生长介质中培养，从NPC1-完整细胞中清除胆固醇并不会导致敏感性(图S8). 因此，NPC1缺陷细胞对rVSV-GP-EboV的耐药性不是由胆固醇转运缺陷引起的就其本身而言。
丝状病毒表现出广泛的哺乳动物宿主和组织嗜性21,22为了确定丝状病毒GP介导的感染是否通常需要NPC1，我们使用NPC1全中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。NPC1缺失使其对病毒感染具有完全抵抗力(图S6D)这被人类NPC1的表达所逆转(图S6E). 某些小分子，如U18666A23和抗抑郁药丙咪嗪24可能通过靶向NPC1导致类似于NPC1缺乏的细胞表型23。据报道，延长U18666A治疗可适度抑制VSV25然而，我们发现，将Vero细胞和HAP1细胞短暂暴露于U18666A或丙咪嗪可有效抑制由埃博病毒GP介导的病毒感染，但不抑制VSV或狂犬病病毒G(,S9和S10). 由于U18666A仅在早期添加时才抑制rVSV-GP-EboV感染，因此它可能影响进入而非复制(图S10). 因此，NPC1在由丝状病毒糖蛋白介导的感染中具有关键作用，丝状病毒糖蛋白在哺乳动物中保守，并且可能独立于NPC1在胆固醇转运中的作用。
丝状病毒与一个或多个细胞表面分子结合2,26,27并被大量胞饮作用内化28,29在VPS33A和NPC1突变细胞中，我们观察到Alexa 647标记的rVSV-GP-EboV的结合或内化没有显著差异(,图S11和图S12A). 使用荧光埃博病毒样颗粒流式细胞术也获得了类似的结果(图S12B). 此外，通过电子显微镜可以很容易地在细胞外周和质膜内陷处观察到子弹状VSV颗粒，类似于新生的大嵌合体(). 最后，VPS33A和NPC1-null细胞对通过大胞饮作用进入痘苗病毒完全敏感(图S13). 因此，GP介导的进入在NPC1或HOPS缺陷细胞的病毒附着或早期内化步骤中不受抑制，表明存在下游缺陷。
在HOPS复合物和NPC1缺乏的细胞中，埃博拉病毒的进入在后期被阻止a、，病毒颗粒附着并内化为HOPS和NPC1缺陷细胞。指示的HAP1克隆在4°C下感染Alexa 647标记的rVSV-GP-EboV（蓝色）。非内部结合病毒颗粒（蓝色）也用GP特异性抗体（绿色）染色，质膜用Alexa 594-小麦胚芽凝集素（红色）染色(顶部面板). 为了评估病毒内部化，将细胞加热至37°C(底部面板). 内化病毒颗粒（蓝点）对酸剥离具有抵抗力，并且无法获得GP抗体。b、，细胞接种rVSV-GP-EboV并通过透射电子显微镜检查。显示了早期进入步骤的典型图像。c、，在玻璃体中，rVSV-GP-EboV不能绕过VPS11中观察到的感染阻断燃气轮机，VPS33A燃气轮机和NPC1燃气轮机细胞。所示HAP1克隆中嗜热菌溶血素分离rVSV-GP-EboV的感染性*低于检测极限。d日HOPS复合物和NPC1缺陷细胞阻止病毒逃逸到细胞质。用U18666A（10μg/ml）处理的野生型HAP1细胞和所指示的突变克隆用VSV或rVSV GP埃博拉病毒感染3h，并进行VSV M染色（红色）。标点染色用箭头表示。e、，感染rVSV-GP-EboV的VPS33A-和NPC1缺陷HAP1细胞以及NPC1缺陷成纤维细胞的电子显微照片显示，在囊泡室中有子弹状VSV颗粒聚集。所有图像均在接种后3小时拍摄。星号突出显示横截面中的rVSV-GP-EboV粒子。
病毒膜融合需要组织蛋白酶L（CatL）辅助CatB裂解EboV GP三,5突变的HAP1细胞具有正常的CatB/CatL活性(图S14B、C)并且对利用CatB或CatL进入的哺乳动物呼肠孤病毒完全敏感(图S14D). 此外，这些细胞对玻璃体叶片中的rVSV-GP-EboV颗粒仍然不敏感()不再需要Vero细胞内的CatB/CatL活性(图S14A). 因此，HOPS复合物和NPC1可能需要在产生启动进入中间体的初始GP蛋白水解酶处理步骤的下游。
最后，我们使用内部VSV M（基质）蛋白的细胞内分布作为膜融合的标记(). 用天然VSV或rVSV-GP-EboV感染细胞，并进行免疫染色以观察传入的M蛋白。任何一种病毒进入野生型HAP1细胞都会引起进入的病毒M在细胞质中重新分布() (图S15A). 相反，在用rVSV GP EboV或rVSV GP MarV感染的药物处理和突变细胞中，仅获得点状的核周M染色(和图S15B). 感染rVSV-GP-EboV的突变细胞的电子显微照片显示，病毒颗粒在囊泡室中聚集(和S16A型)包含LAMP-1(图S16B)这表明传入病毒的融合和脱膜被阻止。同样，U18666A治疗增加了NPC1和LAMP1阳性内体中病毒颗粒的数量(图S17). 因此，NPC1和HOPS复合物是丝状病毒进入的后期步骤所必需的，导致病毒膜融合并从溶酶体室逃逸。
接下来，我们测试了NPC1突变的原发性患者成纤维细胞中是否感染了真正的埃博病毒和巨细胞病毒。突变细胞中两种病毒的子代产量都显著降低(). 用U18666A处理的Vero细胞也能降低病毒产量(). 此外，U18666A大大降低了人外周血单核细胞衍生树突状细胞和脐静脉内皮细胞（HUVEC）的感染()，不影响细胞数量或形态(图S19). 最后，HUVEC中NPC1的敲除减少了丝状病毒的感染(和第18节). 这些发现表明，NPC1对真正的丝状病毒感染至关重要。
我们评估了NPC1突变在EboV和MarV感染致死小鼠模型中的作用。杂合NPC1（NPC1−/+)用小鼠适应的埃博拉病毒或MarV攻击敲除小鼠及其野生型同窝小鼠，并监测28天。鉴于NPC1+/+小鼠迅速死于丝状病毒NPC1感染−/+老鼠受到了很大的保护()。
我们利用人类细胞中的全球基因破坏来发现丝状病毒使用的异常进入途径的组成部分。大多数已鉴定的基因影响溶酶体功能的各个方面，这表明丝状病毒利用这种细胞器的方式与我们测试的所有其他病毒不同(). 遗传病基因NPC1在病毒进入、感染和发病机制中的意外作用可能会促进抗丝状病毒治疗药物的发展。
方法在线
细胞
KBM7细胞及其衍生物保存在添加10%FCS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的IMDM中。Vero细胞和原始人类皮肤成纤维细胞（科里尔医学研究所）保存在补充了10%FCS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的DMEM中。野生型和NPC1-null（CT43）中国仓鼠卵巢（CHO）成纤维细胞保存在补充10%FCS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的DMEM-Ham的F-12培养基（50-50混合）中30。
为了产生树突状细胞（DC），原代人单核细胞在37°C、5%CO下培养2在补充有10%人血清、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES、青霉素-链霉素、重组人粒细胞-单核细胞集落刺激因子（50ng/ml）和重组人白细胞介素-4（50ng/ml）的RPMI中培养6天。每两天添加一次细胞因子，用新鲜培养基替换一半培养液。在第6天收集DC，用流式细胞仪进行表征（见下文）并立即使用。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）取自Lonza（Walkersville，MD），并保存在内皮生长培养基（EGM；Lonza）中。
HAP1细胞用于单倍体筛选，成纤维细胞或CHO细胞用于hit验证和功能研究。Vero细胞通常用于丝状病毒复制的研究，因为它们极易感染。DC和HUVEC类似于体内丝状病毒感染的早期和晚期靶细胞类型31,32。
DC流式细胞术
在与小鼠抗人CD11c-APC（BioLegend）和小鼠抗人CD209-PE或同型对照品孵育之前，用Fc-block（BD-Pharmingen）处理人DC。使用BD FACSCanto II流式细胞仪（BD Biosciences）对DC进行清洗并重新悬浮在PBS中进行流式细胞术分析。使用FlowJo软件完成数据分析。>95%的细胞被常规观察为CD11c+，DC信号+。
病毒
如前所述，恢复并扩增表达eGFP和EboV-GP（rVSV-GP-EboV）的重组VSV10重组rVSV-GP-BDV由Juan Carlos de la Torre慷慨提供。rVSV-G-RABV是通过替换VSV-eGFP中的VSV-G ORF而产生的33用SAD-B19狂犬病病毒株的重组病毒进行了回收和扩增34.如前所述，产生了携带埃博病毒、苏丹病毒和MarV衍生糖蛋白的VSV假型35。
使用了以下非重组病毒：腺病毒5型（ATCC）、柯萨奇病毒B1型（ATCC）、脊髓灰质炎病毒1型Mahoney（Christian Schlieker慷慨提供）、HSV-1型KOS（Hidde Ploegh慷慨提供），流感A/PR8/34（H1N1）（Charles Rivers）、裂谷热病毒MP-12（Jason Wojcechowskyj慷慨提供），哺乳动物呼肠孤病毒血清1型（由Max Nibert慷慨提供）。
HAP1细胞的产生
产生了编码SOX2、C-MYC、OCT4和KLF4的逆转录病毒36用浓缩病毒感染近单倍体KBM7细胞，连续三轮旋转感染，间隔12小时。采集菌落并测试其倍性。进一步生长并鉴定了一个克隆衍生细胞系（称为HAP1）。核型分析表明，大多数细胞（27/39）是完全单倍体，少数群体（9/39）是除8号染色体以外的所有染色体的单倍体。除8号染色体为四倍体外，其余染色体均为二倍体，不到10%（3/39）。
单倍体基因筛查
通过转染pGT-GFP、pGT-GF+1和pGT-GF1+2，结合pAdvantage、CMV-VSVG和Gag-pol，在293T细胞中产生基因陷阱病毒。病毒在Beckman SW28转子中以25000转/分的速度超速离心浓缩1.5小时。1亿HAP1细胞被感染。采集一部分细胞进行基因组DNA分离，以创建控制数据集。在筛选中，1亿突变细胞在MOI~100下暴露于rVSV-GP-EboV。耐药菌落扩大，约3000万个细胞用于基因组DNA分离。
基因陷阱插入位点的序列分析
如前所述，通过对基因组DNA侧翼基因陷阱前病毒DNA进行测序来确定插入位点8简而言之，在使用rVSV-GP-EboV进行选择之前，生成了一个包含突变HAP1细胞中插入位点的对照数据集。从约4000万个细胞中分离基因组DNA，并进行线性PCR，然后使用基因组分析仪平台（Illumina）进行连接、PCR和测序。将插入位点定位到人类基因组，并鉴定出位于Refseq基因中的插入位点。此控制数据集中的插入包含约400000个满足此标准的独立插入(表S1). 为了生成实验数据集，用rVSV-GP-EboV选择后在突变的HAP1细胞中的插入物通过逆转录聚合酶链反应（PCR）协议进行鉴定，然后使用基因组分析仪进行测序。计算每个基因的失活突变数（即感觉方向或外显子中存在的突变）以及所有基因的失活性插入总数。通过比较基因在屏幕上突变的频率与基因在控制数据集中插入的频率来计算屏幕上的基因丰度。使用单侧Fisher精确检验计算每个基因的p值（错误发现率校正）(表S2)。
HAP1突变株系的特性
使用Qiamp DNA迷你试剂盒（Qiagen）分离基因组DNA。为了确认细胞是真正克隆的，并确认没有野生型DNA位点，使用以下引物对插入位点两侧的引物进行PCR：（NPC-F1，5′-GAAGTGGTCTTGGCGATGGAG-3′；NPC1-R2，5′-AAGGTCCTGTAAACTCTAG-3′；VPS 33 a–F 1，5′-TGTCTACGGCCGAGGAACC-3′；VPS 33 A–R 1，5′-CTGTACACTTTTGCTCAGTTTCC-3′；VPS 11-F 1，5′-GAAGGAGCCGCTGAGCAATGATG-3′；VPS 11-R 1，5′-GGCGAGAATTTAGTAGCAAC-3′。为了确认基因陷阱在不同位点的正确插入，使用NPC1、VPS11和VPS33A的反向（R1）引物结合基因陷阱载体的特异引物PGT-F1进行PCR；5′-TCTCCAAATCTCGGTGGAAC-3′。为了测定NPC1、VPS11和VPS33A的RNA表达水平，使用Superscript III（Invitrogen）逆转录总RNA，并使用基因特异性引物进行扩增：（VPS 11:5′-CTGTTCCAAGTCCTTTGC-3′and d 5′-AAGATCGAGAGTGG-3′；NPC1:5′-CCACAGAGAGACCTC-3′和5′-CAGCTCACAAACAGTTCAG-3′；VPS 33 A:5′-TTAAACACCTCTCTGCCACTCAG-3′和5′-TGTGTCTTCCTCGAATGCTG-3′。
表达NPC1-FLAG融合蛋白的稳定细胞群的产生
将人cDNA内切NPC1（Origene）在框架内连接到三重FLAG序列，并将编码C末端FLAG标记NPC1蛋白的基因亚克隆到pBABE-puro逆转录病毒载体中37在293T细胞中通过三重转染产生包装NPC1-FLAG基因或无插入物的逆转录病毒颗粒，并用于感染对照组和NPC1缺陷的人成纤维细胞和CHO细胞系。产生耐嘌呤霉素的稳定细胞群。
用于病毒治疗的细胞活力测定
KBM7和HAP1细胞以每孔10000个细胞接种在96周的组织培养板中，并用指定浓度的rVSV-GP-EboV处理。三天后，使用XTT比色法（Roche）测量细胞活力。与未经处理的对照组相比，以生存率百分比绘制生存率。为了比较HAP1突变体对不同病毒的敏感性，将其接种在每孔10000个细胞中，并用不同的溶细胞病毒处理，处理浓度为中试实验中产生广泛细胞病变效应的最低浓度。治疗三天后，用4%甲醛将存活的贴壁细胞固定在磷酸盐缓冲液（PBS）中，并用结晶紫染色。
VSV感染性测量
如前所述，在感染后16–26小时，使用荧光显微镜对eGFP阳性细胞进行人工计数，以测量VSV假型的感染性5如前所述，通过荧光焦点分析（FFA）测量.rVSV-GP-EboV感染性10。
菲林染色
Filipin染色显示细胞内胆固醇38在室温下用多聚甲醛（3%）固定细胞15分钟。在三次PBS洗涤后，细胞与来自菲律宾链霉菌（Sigma-Aldrich）（50μg/mL）在黑暗中室温下放置1小时。三次PBS洗涤后，通过DAPI通道中的荧光显微镜观察细胞。
半胱氨酸组织蛋白酶活性的测定
如前所述，用荧光肽底物Z-Arg-AMC（Bachem Inc.，Torrance，CA）和（Z-Phe-Arg）2-R110（Invitrogen）对Vero细胞、人成纤维细胞和CHO系的酸化核后提取物中CatB和CatL的酶活性进行了测定39作为测定特异性的对照，还评估了用E-64（10μM）预处理的提取物中的酶活性，E-64是一种广谱半胱氨酸蛋白酶抑制剂，如前所述10用荧光标记的基于活性的探针GB111（1μM）标记完整细胞内的活性CatB和CatL，并通过凝胶电泳和荧光成像进行可视化，如前所述40。
rVSV-GP-EboV的纯化及染料偶联
rVSV-GP-EboV被纯化并用Alexa Fluor 647（分子探针，Invitrogen Corporation）标记，如前所述41稍作修改。简言之，Alexa Fluor 647（分子探针，Invitrogen公司）以10 mg/mL溶解于二甲基亚砜中，并以31.25μg/mL的浓度与纯化rVSV-GP-EboV（0.5 mg/mL）在0.1 M NaHCO中孵育三（pH 8.3）在RT下保持90分钟。通过超速离心将病毒从游离染料中分离出来。标记的病毒在NTE中重新悬浮（10 mM Tris pH 7.4，100 mM NaCl，1 mM EDTA），并储存在−80°C。
病毒结合/内化分析
用200–500份Alexa 647标记的rVSV-GP-EboV的MOI在4°C下接种细胞30分钟，使病毒与细胞表面结合。随后将细胞固定在2%多聚甲醛中（以检查病毒结合），或在37°C下培养2小时，然后用酸洗去除表面结合的病毒。用1μg/mL Alexa Fluor 594小麦胚芽凝集素（分子探针，Invitrogen）在PBS中培养细胞15分钟，在RT下标记细胞质膜。使用1:2000稀释的抗体265.1（一种对埃博拉GP特异的小鼠单克隆抗体）检测外部病毒颗粒。GP抗体由Alexa 488-共轭山羊抗鼠二级抗体（分子探针，Invitrogen）检测。用PBS清洗后，使用Prolong防褪色试剂（Invitrogen，分子探针）将细胞安装到玻片上。用外荧光显微镜（Axiover 200M；Carl Zeiss，Inc.；Thornwood，NY）监测荧光，并使用Slidebook 4.2软件（Intelligent Imaging Innovations；Denver，CO）获取代表性图像41,42。
VSV M蛋白释放试验
在涂有聚-D-赖氨酸（Sigma-Aldrich）的12 mm盖玻片上生长的细胞用5μg/ml嘌呤霉素预处理30分钟，并在存在嘌呤菌素的情况下，以200–500的MOI接种rVSV。3小时后，用PBS清洗细胞一次，并在室温下用2%多聚甲醛在PBS中固定15分钟。为了检测VSV M蛋白，用1:7500稀释的单克隆抗体23H12（道格·莱尔斯的礼物）培养固定细胞43)在含有1%BSA和0.1%Triton X-100的PBS中，在RT条件下培养30分钟。用PBS冲洗细胞三次，并使用1:750稀释的Alexa 594结合山羊抗鼠二级抗体检测抗M抗体。用DAPI对细胞进行反染色以观察细胞核。细胞清洗三次并安装在玻片上，然后使用尼康TE2000-U倒置荧光显微镜（尼康仪器公司；纽约州梅尔维尔）获取M定位图像。使用Metamorph软件（Molecular Devices）获取代表性图像。
电子显微镜
在6孔板中的汇合细胞单层接种rVSV-GP-EboV，MOI为200-500，接种时间为3小时。细胞在室温下固定在2.5%戊二醛、1.25%多聚甲醛和0.03%苦味酸的混合物中，在0.1 M的碳酸钠缓冲液（pH 7.4）中至少1小时。样品在0.1 M二氯二甲酸钠缓冲液（pH 7.4）中广泛清洗，并在室温下用1%四氧化锇和1.5%亚铁氰化钾在水中处理30分钟。处理后的样品在水中清洗，在1%醋酸铀酰水溶液中染色30分钟，并按醇级（70%、90%、2×100%）脱水5分钟。用亚丙基氧化物从培养皿中取出细胞，并以3000 rpm的转速造粒3 min。在室温下用与亚丙基氧（1:1）混合的Epon渗透样品2 h。将样品嵌入新鲜Epon中，并在65°C下聚合24–48 h。在Reichert Ultracut-S切片机上切割超薄切片（约60–80 nm），并放置在铜网格上。为了制备冰冻切片，用PBS冲洗一次携带病毒的细胞，并用PBS中的0.5 mM EDTA从培养皿中取出。细胞悬浮液分层在eppendorf管中8%多聚甲醛缓冲垫的顶部，并以3.000 rpm的速度造粒3 min。去除上清液并添加新鲜的4%多聚甲醛。培养2小时后，用PBS替换固定剂。在液氮中冷冻之前，用2.3 M蔗糖在PBS中渗透细胞颗粒15分钟。冷冻样品在−120°C下切片，并转移到formvar-carbon涂层铜网格中。使用针对LAMP1（H4A3；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）的小鼠单克隆抗体对网格进行溶酶体染色。用蛋白-A金二级抗体观察LAMP1抗体。在冰上，在2%甲基纤维素中0.3%乙酸铀酰酯中对标记网格进行对比/嵌入。在TecnaiG2 Spirit BioTWIN任务电子显微镜中检查所有网格，并使用AMT 2k CCD相机记录图像。
真正的丝状病毒和感染
用缺乏或含有U18666A（20μM）的培养基在37°C下预处理Vero细胞1 h。将VERO细胞和原代人皮肤成纤维细胞暴露于1995年埃博·扎伊尔病毒（EboV-Zaire 1995）或马病毒Ci67（MarV-Ci67）中，MOI为0.1，暴露时间为1小时。去除病毒接种物，并添加新鲜的含有或不含药物的培养基。收集培养上清液样本，并将其储存在−80°C的温度下，直至完成菌斑分析。
收集树突状细胞并将其接种在96周的聚-d-赖氨酸涂层黑板（Greiner Bio-One）中（5×10）4细胞/孔或在106培养基中每个孔的细胞，并在37°C下孵育过夜。用缺乏或含有上述U18666A的培养基对其进行预处理。DC在MOI为3的情况下暴露于1995年埃博·扎伊尔病毒（EboV-Zaire 1995）或MarV-Ci67，持续1h。去除病毒接种物，并添加新鲜的含有或不含药物的培养基。使用或不使用药物的未感染细胞作为阴性对照。细胞在37°C下培养，并在指定时间用10%福尔马林固定。HUVEC以5×10接种在96周的聚-d-赖氨酸涂层黑板中4培养基中每孔的细胞，用U18666A处理，感染，并按上述DC处理。
细胞毒性分析
DC和HUVEC接种在96周板中。在37°C下培养过夜后，添加与病毒感染研究相同浓度的U18666A。未使用药物的培养基中的细胞作为未经处理的对照。在处理后的指定时间，向培养基中含有细胞的微孔中添加等量的细胞滴定-Glo试剂（Promega）。使用平板阅读器测量发光度。
丝状病毒滴定的菌斑分析
在改良Eagle培养基中用厄尔平衡盐和非必需氨基酸（EMEM/NEAA）加5%热灭活胎牛血清制备培养上清或血清的十倍系列稀释液。将每种稀释液接种到6孔板的一个孔中，该孔板含有融合的Vero 76细胞单层。在37°C下吸附1小时后，用1份1%琼脂糖（Seakem）和1份2X Eagle基础培养基（EBME）、30mM Hepes缓冲液和5%热灭活胎牛血清的混合物覆盖单层。在37°C、5%CO2、80%湿度下培养6天后，添加第二层5%中性红。第二天对斑块进行计数，滴度表示为PFU/ml。
丝状病毒感染培养物的免疫荧光分析
在与初级抗体孵育之前，用1%牛血清白蛋白溶液封闭福尔马林固定的细胞。用EboV GP特异性单克隆抗体13F6培养EboV感染细胞和未感染对照44或KZ5245用MarV GP特异性单克隆抗体9G4孵育MarV感染的细胞和未感染的对照。在与山羊抗鼠IgG或与Alexa 488偶联的山羊抗人IgG孵育之前，用PBS清洗细胞。用Hoechst染色（Molecular Probes®）对细胞进行复染，用PBS洗涤并保存在4°C下。
图像分析
在Discovery-1高含量成像仪（分子器件）上使用10×物镜在9个场/孔采集图像，或在Operetta（Perkin Elmer）高含量设备上使用20×物镜采集6个场/井图像。使用MetaXpress软件中的“活/死”模块分析Discovery-1图像。根据Harmony软件中的图像分析功能，使用定制方案分析Operetta图像。
动物和丝状病毒挑战实验
描述了鼠用埃博病毒46。由Sina Bavari提供鼠用MarV Ci6747.内螺纹和外螺纹BALB/c NPC1+/负极小鼠和BALB/c NPC1+/+小鼠（5-8周龄）取自杰克森实验室（马萨诸塞州巴尔港）。小鼠被安置在特定的无色素条件下。研究是按照《动物福利法》和其他有关动物和动物实验的联邦法规进行的，并遵循《实验动物护理和使用指南》（国家研究委员会，1996年）中规定的原则。进行这项研究的机构得到了国际实验动物护理评估和认证协会的充分认证。对于感染，在生物安全4级实验室中，用1000 pfu（30000 X 50%致死剂量）的小鼠适应的埃博拉病毒或小鼠适应的MarV Ci67病毒的目标剂量对小鼠进行腹腔接种。研究人员和公正的第三方在激发后28天观察小鼠。每日观察包括评估小鼠的临床症状，如梳毛减少、毛发皱褶、驼背姿势、刺激反应减弱、鼻涕和出血。从幸存小鼠中收集血清以确认病毒清除。通过斑块试验对激发剂量进行反向滴定，确定感染埃博氏病毒的小鼠接受900 pfu/小鼠，而感染MarV的小鼠接受700 pfu/鼠。
RNA干扰
表达NPC1特异性shRNA的慢病毒载体（Sigma-Aldrich；克隆号#TRCN0000005428；序列CCACAGATCTCATATT）或非靶向对照shRNA（Sigma-Aldrich，SHC002；序列CAACAGAGACCAA）通过在HEK-293T细胞中转染将其包装成HIV-1假型病毒，在转染后36和48小时收集含慢病毒的上清液，并在6μg/mL聚乙烯存在下，以2500 rpm、25℃、90 min的速度在12孔板中离心到HUVEC上。HepG2细胞按上述方法转导，但没有离心步骤。细胞在最后一次慢病毒转导（HepG2，1μg/mL；HUVEC，1.5μg/mL）24小时后接受嘌呤霉素选择，然后收获用于实验。通过细胞提取物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和α-NPC1多克隆抗体（Abcam）的免疫印迹来评估NPC1的敲除水平。
埃博氏病毒复制子检测
埃博病毒支持质粒是通过克隆核电厂,VP35型,VP30（视频处理30）和L（左）来自cDNA的基因（Elke Mühlberger慷慨提供48)通过Quik-Change定点突变（Stratagene）产生突变型pL-D742A质粒。EboV非编码序列的截短版本由重叠延伸PCR产生，并附加到电子GFPORF公司。复制子pZEm的制备如前所述49复制子RNA序列的5′端由一个截短的T7启动子和一个鸟嘌呤核苷酸组成，3′端由HDV核酶序列和T7终止子组成。转录的复制子RNA由以下埃博拉病毒扎伊尔序列组成（Genbank登录{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AF086833”，“term_id”：“10141003”}}AF086833型)以下为：[5′] –单鸟苷nt−176 nt基因组5′末端-55 ntL（左）mRNA 3′UTR–电子GFPORF（反义定向）–100 nt核电厂mRNA 5′UTR–155 nt基因组3′末端[3′].病毒复制子分析如前所述进行49除了U18666A（20μg/mL）包含在补充的DMEM中（如有指示）。使用蔡司Axioplan倒置荧光显微镜直接从6厘米培养皿中采集图像。
