公共科学图书馆一号。2011; 6（9）：e24993。
小鼠肝脏中不同数量的肝星状细胞具有不同的维甲酸和脂质储存能力
,1,2 ,1 ,1 ,1 ,三和1,2,*
戴安娜·德安布罗西奥
1美国纽约哥伦比亚大学内科和外科学院医学系
2美国纽约哥伦比亚大学内科和外科医生学院人类营养研究所
何塞·L·瓦卢斯基
1美国纽约哥伦比亚大学内科和外科学院医学系
罗宾·克拉格斯顿
1美国纽约哥伦比亚大学内科和外科学院医学系
保罗·伯克
1美国纽约哥伦比亚大学内科和外科学院医学系
理查德·A·里普
三美利坚合众国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学医学系胃肠病和肝病科
威廉·S·布兰纳
1美国纽约哥伦比亚大学内科和外科学院医学系
2美国纽约哥伦比亚大学内科和外科医生学院人类营养研究所
Naglaa H.Shoukry，编辑器
1美国纽约哥伦比亚大学内科和外科学院医学系
2美国纽约哥伦比亚大学内科和外科医生学院人类营养研究所
三美利坚合众国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学医学系胃肠病和肝病科
加拿大蒙特利尔大学
构思并设计了实验：DND WSB。执行实验：DND RDC。分析数据：DND JLW RDC PDB RAR WSB。贡献的试剂/材料/分析工具：JLW RAR WSB。论文撰写人：DND。
收到日期：2011年6月14日；2011年8月22日接受。
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- 补充资料
图S1：
微阵列分析中使用的样品的质量评估。对6只小鼠分离的AF-HSCs和5只小鼠分离出的GFP-HSCs进行基因芯片分析。从这些群体纯化的cDNA在Affymetrix小鼠基因组430 2.0阵列上运行，并使用GeneSifter软件分析数据。（A） 结蛋白mRNA水平归一化为18S。学生的t吨-测试用于分析各组之间的统计显著性差异。当p<0.05时，组间差异显著。（B） 显示最大值和最小值的箱线图摘要，1标准和3第个四分位数，以及AF和GFP组的中位数。（C） 散点图摘要显示了身份线周围数据点的分布情况。GFP组中所有过度表达的基因均显示为红色；AF组中过度表达的基因以绿色显示。（畅通节能法）
GUID:C43E1AD4-1DAB-4876-B2AB-978245B68E40
图S2：
CCl治疗小鼠肝脏中的总视黄醇水平4.每周给WT C57雄性小鼠注射玉米油或0.5 ul CCl4/g B.W.在玉米油中给药4周，然后处死。显示总视黄醇（视黄醇+视黄醇酯）水平，表示为每克肝脏的nmol总视黄醛。重要性由学生的t吨-试验，*p值<0.05。（畅通节能法）
GUID:CCD62691-8510-40A8-8960-59200BC7377C
表S1：用于qRT-PCR分析的ABI引物。从Applied Biosystems（ABI）购买的商用引物显示了所有基因的ABI登录号，并对其进行了qRT-PCR分析。（文件）
GUID:9FB65F63-F321-43EE-B285-20ECA2C97ECD
摘要
肝星状细胞（HSC）脂滴是储存维甲酸的特殊细胞器，占体内维甲酸总量的50-60%。当HSC激活时，视黄酯水平逐渐降低，脂滴消失。本研究的目的是确定健康、未受损肝脏中的HSC人群在脂质滴中的维甲酸和脂质储存能力是否存在异质性。为此，我们使用了两种分离HSC的方法，这两种方法利用了这些细胞的不同特性，包括其维生素A含量和胶原蛋白表达。HSC是从C57BL/6遗传背景的野生型（WT）小鼠中通过Nycodenz密度梯度浮选分离出来的，然后根据维生素a自身荧光进行荧光激活细胞分选（FACS），或者从胶原蛋白绿色荧光蛋白（GFP）中分离出来的FACS小鼠基于由I型胶原启动子驱动的GFP转基因GFP表达。我们发现GFP-HSC具有：（i）HSC活化的典型标记物表达增加；（ii）视黄醇酯水平降低，伴随着肝视黄醇酯类合成（LRAT）所需酶的表达降低；（iii）降低甘油三酯水平；（iv）与脂质分解代谢相关的基因表达增加；和（v）维甲酸稳定细胞色素CYP2S1的表达增加。结论：我们的观察结果表明，健康、无损伤肝脏中的HSC群体是异质性的。HSC总人群中有一个亚群表达HSC激活的早期标志物，可能已经“启动”并准备好对急性肝损伤作出快速反应。
介绍
类维生素A（天然和合成维生素A及其代谢物）对许多生理过程至关重要，包括生殖、胚胎发育、骨骼生长、免疫和视力[1]–[3].体内70%的维甲酸储存在肝脏中[4],[5]其中90-95%储存在肝星状细胞（HSC）内的脂滴中[6]这些脂滴是HSC的一个显著特征，由于其维甲酸含量和对饮食维甲酸状态的反应性，被认为是维甲酸储存的专门细胞器[7]维甲酸酯约占这些液滴中脂质的40%，比任何其他单一脂质种类都多[8],[9]虽然剩下的60%都是非维甲酸类脂质，包括甘油三酯、胆固醇酯、胆固醇、磷脂和游离脂肪酸，但文献中有大量数据表明，这些脂滴的形成和维持是维甲酸依赖的过程[7].
森和木等。研究表明，HSC脂滴的脂质组成受饮食中维甲酸状态的强烈调节，但不受饮食中甘油三酯摄入的影响[8]低视黄醇饮食可降低HSC脂滴视黄醇脂质种类，高视黄醇膳食可升高视黄醇和非视黄醇脂类；然而，无论是维甲酸还是非维甲酸含量都不受低脂肪或高脂肪饮食的影响。其他高度暗示类视黄醇在这些液滴中的作用的数据与卵磷脂∶视黄醇酰基转移酶（LRAT）有关，LRAT是肝脏中唯一已知能够合成视黄酯的酶。奥拜恩等。结果表明，野生型（WT）小鼠的HSC有大而明显的脂滴，而LRAT-null小鼠的细胞没有脂滴[10]因此，在HSC中合成和储存视黄酯的能力对于HSC脂滴的存在是必要的。
众所周知，当HSC激活以应对肝脏损伤或疾病时，HSC会释放其脂滴含量并同时降低视黄酯水平。Leo和Lieber发现，随着酒精性肝炎的发展，肝总视黄醇水平下降了近5倍，而随着肝硬化的发展，又下降了约4倍[11]在培养的HSC中也发现，储存在HSC脂滴中的视黄酯首先被水解，然后以视黄醇的形式释放到培养基中[12]当HSC从静止表型转变为肌纤维母细胞表型时，它们会增加细胞外基质的生成，包括增加I型胶原的合成，并成为成纤维细胞[13],[14]尚未明确确定HSC脂滴的丢失是激活的原因还是结果。
我们有兴趣了解调节HSC类视黄醇在脂滴中作为视黄醇酯储存的因素，以及调节HSC脂滴生成和溶解的因素。在本研究中，我们采用了两种分离HSC的方法，这两种方法利用了这些细胞的不同特性。一种方法依赖于HSC脂滴维生素A的含量，另一种方法则依赖于I型胶原的HSC表达。最近的研究表明，伴随HSC活化的基因表达变化和视黄醇酯脂滴的丢失在HSC中受到不同的调节在体外和体内激活模型[15]同样，本研究的目的是确定不同的HSC分离方法是否会产生表型不同的细胞群，以及这如何反映给定时间肝内HSC的异质性。我们特别感兴趣的是这些人群在维甲酸储存和脂滴形成能力方面的比较。我们的调查结果如下。
材料和方法
动物
使用WT和胶原蛋白绿色荧光蛋白（GFP）小鼠，这两个菌株具有C57BL/6遗传背景的同源性。胶原蛋白-GFP小鼠先前已有描述[16]简单地说，构建了一个含有3122 bpα1（I）胶原蛋白的基因结构(第1a1列)与GFP报告基因连锁的基因启动子[16].I型胶原的肝脏表达仅在HSC中[17],[18]，当细胞被激活时，其表达增加[19],[20]因此，来自该转基因的GFP表达可用于鉴定和分离HSC。研究中使用的所有小鼠都是90至120天龄的雄性小鼠。允许动物进入随意获得水和标准的营养完整的啮齿类食物（W.F.Fisher and Sons，Inc.，新泽西州萨默维尔）。所有小鼠在常规屏障设施中维持12小时的暗光循环，黑暗期为上午7:00至下午7:00。本报告中描述的动物实验是根据国家研究委员会的《实验动物护理和使用指南》进行的，并得到了哥伦比亚大学动物护理机构委员会的批准（IACUC协议#AC-AAAA9687）。
肝纤维化诱导
每周给WT C57BL/6小鼠注射0.5µl四氯化碳（CCl4)用玉米油或同等体积的玉米油单独给药4周，然后处死。在分析之前，立即收集肝组织并将其储存在−80°C下。
肝细胞分离
灌注了肝脏就地分别用EGTA 5分钟和胶原酶D（0.5mg/ml，Roche Diagnostics，Indianapolis，IN）15分钟，流速为5ml/min。灌注后，切除部分消化的肝脏，消化物通过100µm尼龙网以去除未消化的物质，并重悬于Dulbecco改良鹰培养基（DMEM；Gibco，Grand Island，NY），含1%青霉素/链霉素。通过在4°C下按以下顺序离心，将肝细胞从非实质细胞和碎片中分离出来：在20℃下离心两次，持续5分钟克一次在50 g时持续10分钟，另一次在20 g时持续5分钟。吸取上清液，并将颗粒中的肝细胞重新悬浮在DMEM中。细胞产量通过血细胞仪计数确定。
HSC隔离
根据既定方案分离原代小鼠HSC[9],[21],[22]简单地说，对肝脏进行灌注就地分别以5 ml/min的流速使用EGTA 5 min、pronase E（0.4 mg/ml，EMD Chemicals Inc.，Gibbstown，NJ）5 min和胶原酶D（0.5 mg/ml，Roche Diagnostics）8 min。肝脏从体内切除后，通过细胞过滤器过滤肝脏消化液，并用Gey’s Balanced Salt Solution（Sigma，St。路易斯，密苏里州）含有DNase I（2 mg/ml，罗氏诊断公司）。对于WT C57小鼠，通过在Gey’s平衡盐溶液（不含NaCl）中漂浮9%（w/v）Nycodenz（挪威奥斯陆Axis-Shield PoC AS），从剩余的非实质细胞和肝细胞衍生碎片中纯化HSC。随后，使用FACS Calibur（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ）通过FACS分离细胞，并根据维生素A在460 nm处的发射收集自荧光细胞。这种分离HSC的方法产生大约10%的肝内HSC。对于胶原蛋白-GFP小鼠，通过50 g离心2分钟，从非实质细胞中分离出实质细胞和碎片。然后用FACS分离剩余的非实质性细胞悬浮液，并根据其在530nm处的发射收集GFP阳性细胞。这种分离HSC的方法产生大约10%的肝内HSC。
RNA的分离和cDNA的合成
使用Qiagen RNeasy试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚市Qiangen）从HSC中分离出总RNA。使用NuGEN WT-Ovation Pico RNA扩增试剂盒（NuGEN，加州圣卡洛斯）进行cDNA合成和扩增。然后使用Qiagen-QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化得到的cDNA。使用NuGEN FL-Ovation cDNA生物素模块V2试剂盒（NuGEN）进行cDNA片段化和标记。
DNA微阵列分析
对Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array（Affymotrix，Santa Clara，CA）进行阵列分析，并使用GeneSifter基因表达分析套件（Geospiza，Seattle，WA）进行分析。个体基因表达值归一化为中位数。样本集之间基因表达的显著变化由一名学生的t吨-测试和随后的Benjamini–Hochberg校正，以p值0.05作为统计显著性的标准。所有微阵列数据都符合MIAME标准，并以ArrayExpress登录E-MEXP-3231的形式存放。
定量实时PCR
使用商用引物探针集通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）确认差异基因表达(表S1，加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）。在LightCycler 480（罗氏诊断）上进行qRT-PCR。
免疫组织化学
将来自胶原GFP小鼠的肝组织样品收集到10%福尔马林中。Herbert Irving综合癌症中心组织学服务使用标准方案进行免疫组织化学。使用抗结蛋白单克隆鼠抗人抗体（Dako，Carpindia，CA，克隆D33，IR606）以1∶400的稀释度定位结蛋白表达，使用抗GFP兔多克隆抗体以1∶500的稀释度（Invitrogen，Carlsbad，CA，a-11122）定位GFP。使用带有Apotome的蔡司Axiover 200 M显微镜（Zeiss，哥廷根，DE）以40倍放大率拍摄荧光图像，并使用AxioCam MRm相机（蔡司）拍摄图像。
原代HSC培养
如上所述，从WT和胶原蛋白-GFP小鼠中分离出HSC。约0.5×106将细胞重新悬浮在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中，接种在35 mm玻璃底皿（MatTek Co.，Ashland，MA）上，并在37°C下培养过夜。使用FSX100奥林巴斯显微镜（Olympus America Inc.，Center Valley，PA）拍摄相位对比度和荧光图像。
反相高效液相色谱分析
肝脏和HSC视黄醇酯水平由上述程序测定[10]简单地说，使用Polytron均质机（纽约州韦斯特伯里Brinkmann Instruments）将200 mg肝组织均匀化于2 ml PBS（10 mM磷酸钠，pH 7.2，150 mM氯化钠）中，并取200µl等分样品进行进一步分析。对于HSC，将100000个细胞的等分样品重新悬浮在1ml PBS中。然后用等量的含有已知量醋酸视黄酯的无水乙醇作为内标物处理所有样品，并将匀浆中存在的类视黄酯萃取到己烷中。提取的维甲酸在4.6×250 mm Ultrasphere C上分离18列（Beckman，Fullerton，CA）前面加一个C18保护柱（Supelco，Bellefonte，PA），使用70%乙腈、15%甲醇、15%二氯甲烷作为流动溶剂，流速为1.8 ml/min。视黄醇和视黄醇酯（棕榈酸视黄醇酯、油酸视黄醇酯、亚麻酸视黄醇酯和硬脂酸视黄醇酯）在325nm处检测，并通过比较实验化合物的保留时间和光谱数据与真实标准进行鉴定。组织中视黄醇和视黄醇酯的浓度通过比较每种视黄醇类化合物的积分峰面积与已知量的纯化标准物的积分峰区域来定量。提取过程中的损失是通过调整细胞和组织均质后立即添加的内标物的回收率来计算的。
甘油三酯分析
约200 mg肝脏或0.5×106使用Polytron均质器在1 ml PBS中均质HSC。然后将匀浆中的脂质提取到氯仿∶甲醇（2∶1 v/v）中，并收集低氯仿相。用额外体积的氯仿∶甲醇重新萃取上相，以确保完全回收甘油三酯，并在N2然后将一毫升2%Triton X-100存于氯仿中用于肝脏或50µl用于HSC，添加到样品中，并在N2对于肝脏，通过向玻璃管中添加1mL去离子水溶解甘油三酯进行比色分析。根据制造商的说明，采用矩阵加化学参考标准（Verichem Laboratories Inc.，Providence，RI），使用Infinity甘油三酯试剂（Thermo Fisher Scientific Inc.，Middletown，VA）在96 well板中对5µl每个肝脏样品进行比色甘油三酸酯分析。对于HSC，将200µl甘油三酯试剂直接添加到干燥样品中，并在比色分析中读取整个体积。在Multiskan Plus微量板阅读器上测量520 nm处的颜色发展。
蛋白质印迹分析
用Western blot分析HSC蛋白。对于所有分析的蛋白质，在10%SDS–PAGE凝胶上分离5µg总蛋白，并在4°C下于100 V下转移到聚偏氟乙烯膜（Millipore Immunobilon-P转移膜）上1 h。然后在室温（RT）下用10%的牛奶封闭缓冲液培养细胞膜1小时，然后在4°C下与以下主要抗体过夜培养：α-平滑肌肌动蛋白（1∶100，兔多克隆，Abcam，Cambridge，MA，ab5694），脂肪分化相关蛋白（1：500，家兔多克隆，Abcam，ab52356），CYP2S1（1∶500，兔多克隆，Abcam，ab69650）、CYP2E1（1：500，兔多克隆，Abcam，ab28146）和LRAT（1∶50，小鼠单克隆，由凯斯西储大学药理学系Krzysztof Palczewski博士赠送）。二级抗体在RT下与驴辣根过氧化物酶结合的抗兔IgG抗血清（1∶10000，GE Healthcare，Piscataway，NJ，cat#NA934V）或山羊辣根过氧化物糖结合的抗鼠IgG抗体（1∶0000，EMD Chemicals Inc.，Gibbstown，NJ）孵育1小时。免疫印迹是使用ECL系统开发的（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific）。
统计分析
所有数据均以平均值±S.D.A学生的t吨-测试用于分析各组之间的统计显著性差异。当p＜0.05时，各组被认为有显著差异。
结果
HSC隔离方法
为了获得相对富含维生素a的HSC群体，我们对通过常规Nycodenz浮选肝脏蛋白酶消化物中存在的细胞获得的HSC进行了FACS。维生素A在350 nm激发时在460 nm处发出自荧光，因此暴露于该激发波长使我们能够收集富含维生素A的细胞群。这群富含脂滴和维生素A的HSC随后将被称为AF-HSC。本研究中使用的第二种HSC分离方法利用了由第1a1列这些小鼠的启动子[16]数据表明肝脏中I型胶原的表达仅发生在HSC中[17],[18]我们对非实质性细胞的消化液进行了FACS，并根据其在488nm处的激发收集了GFP阳性细胞。这种表达GFP的HSC群体将被称为GFP-HSC。为了证实GFP的表达仅限于HSC，我们使用GFP抗体和HSC标志物结蛋白进行免疫组化[23]我们发现GFP仅在HSC中表达，GFP表达与结蛋白表达共存，在肝脏的其他主要细胞类型中未发现(). 我们进一步用结蛋白mRNA表达作为HSC纯度的标记，通过qRT-PCR分析了这些群体的完整性，并且我们表明两种不同的HSC分离方法产生了具有等效结蛋白表达的细胞群体(图S1A).
GFP表达与HSC标志物结蛋白表达的共定位。使用HSC标记结蛋白（A）和GFP（B）抗体对胶原蛋白-GFP小鼠的肝脏切片进行免疫组织化学。合并图像显示结蛋白和GFP表达（C）的共定位。合并图像中还显示了细胞核的DAPI（蓝色）染色。缩微照片放大40倍。比例尺，15µm。箭头指向肝星状细胞。插图显示了一个HSC的放大视图。
微阵列分析概述
在本研究中，我们对从6只小鼠分离的AF-HSCs和从5只小鼠分离出的GFP-HSCs进行了基因芯片分析。从这些群体中纯化的cDNA在Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Arrays上运行，覆盖了45000多个小鼠基因组转录本，并使用GeneSifter软件分析数据。AF组和GFP组的方框图和散点图摘要证明了所用样本的质量，这表明两组中所有阵列数据点的分布是相同的(图S1B和S1C). 与AF-HSC相比，五千三百六十三个探针组在GFP-HSC中的上调或下调超过2倍(). 作为第二阶段筛选和生物学意义分析，根据200条以上已知KEGG（京都基因和基因组百科全书）途径筛选AF-和GFP-HSC之间存在显著差异表达的转录物列表。该分析确定了15条KEGG通路，其中大量基因上调或下调(). 通路水平的显著性定义为绝对值大于2的z评分。如Walewski所述等。，z值大于或等于2的阳性表示差异表达基因列表中的大量基因在该特定途径中显著上调或下调[24]值得注意的是，本研究确定的许多丰富的KEGG途径与细胞外基质（ECM）有直接或间接的关系，ECM是处于激活早期的HSC放松管制的目标[13]这些途径分为细胞粘附分子（CAM）、ECM-受体相互作用、局部粘附和缝隙连接().
表1
差异表达基因摘要。
| 方法 | p值截止 | 更改的总数 | 增加 | 降低 |
| 学生的t吨-测试 | 0.05 | 5363*
| 2676 | 2687 |
| 0.01 | 3563 | 1901 | 1662 |
| 0.001 | 1673 | 825 | 848 |
| 韦尔奇的t吨-测试 | 0.05 | 5074 | 2361 | 2713 |
| 0.01 | 2674 | 1064 | 1610 |
| 0.001 | 985 | 230 | 755 |
表2
KEGG通路富集。
| z评分 | KEGG通道 | 基因集 | 更改的总数 | 向上 | 向下 | z评分 |
| 向上 | 细胞粘附分子（CAM） | 131 | 51 | 34 | 17 | 5.64 |
| 细胞因子-细胞因子受体相互作用 | 232 | 74 | 48 | 26 | 4.95 |
| 利什曼病 | 66 | 30 | 19 | 11 | 4.72 |
| I型糖尿病 | 44 | 19 | 14 | 5 | 4.50 |
| 白细胞跨内皮迁移 | 114 | 44 | 26 | 18 | 4.16 |
| ECM-受体相互作用 | 76 | 27 | 18 | 9 | 3.63 |
| 年轻人的成熟型糖尿病 | 25 | 10 | 8 | 2 | 3.41 |
| 类固醇生物合成 | 17 | 6 | 6 | 0 | 3.25 |
| 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 | 30 | 9 | 8 | 1 | 2.80 |
| 向下 | Axon制导 | 127 | 54 | 24 | 30 | 4.76 |
| 焦点粘连 | 189 | 70 | 33 | 37 | 4.01 |
| 缝隙连接 | 83 | 25 | 7 | 18 | 3.25 |
| 细胞周期 | 123 | 27 | 4 | 23 | 2.89 |
| ErbB信号通路 | 84 | 22 | 6 | 16 | 2.48 |
| 趋化因子信号通路 | 173 | 47 | 20 | 27 | 2.11 |
GFP-HSC的表型与早期激活的HSC相似
激活后，HSC产生更多的I型胶原，同时丢失含视黄醇酯的脂滴[18],[19]。因为我们选择了表达第1a1列，我们对GFP-HSC是否会显示激活HSC的特征感兴趣。该阵列表明，GFP HSC中的许多HSC激活标志物升高，包括α-平滑肌肌动蛋白(学报2)、血小板衍生生长因子C(Pdgfc公司)，转化生长因子β2(Tgfb2型)和内皮素(编辑1) (). qRT-PCR证实所有标记的高表达；然而，只有学报2上调被发现是显著的(). 蛋白质印迹分析也显示ACTA2蛋白水平升高().
HSC活化标记物的mRNA和蛋白表达。（A） 相对mRNA表达水平第1a1列,学报2,Pdgfc公司,Tgfb公司、和教育1图中显示了AF-HSC（实心钢筋）和GFP-HSC（剥离钢筋）。将数值标准化为18S，并给出5次AF和5次GFP HSC隔离的平均值±1 S.D。重要性由学生的t吨-测试，***p值<0.001。ND表示“未检测到”。（B）AF-HSC和GFP-HSC中ACTA2的蛋白质水平。重复实验，结果相似。
表3
HSC激活标记。
| AFFY ID | 基因名称 | 基因ID | 常设费用 | p值 |
| 1449254_安特 | 分泌磷蛋白1 |
Spp1型
|
115.5
| 0.000001 |
| 1419123_a_阿特 | 血小板衍生生长因子C多肽 |
Pdgfc公司
|
39.3
| 0.002963 |
| 1449351秒_秒 | 血小板衍生生长因子C多肽 |
Pdgfc公司
|
32.5
| 0.003461 |
| 1456658_吨 | 肌动蛋白，α2，平滑肌 |
行动2
|
5.5
| 0.001718 |
| 1456156_安 | 小鼠苗条素受体 |
勒普
|
4.2
| 0.007139 |
| 1451924_a_at | 内皮素1 |
教育1
|
4.2
| 0.000544 |
| 1416454秒 | 肌动蛋白，α2，平滑肌 |
学报2
|
3.5
| 0.016302 |
| 1438303_吨 | 转化生长因子β2 |
Tgfb2型
|
2.7
| 0.002149 |
| 1448729_a_阿特 | 9月4日 |
9月4日
|
0.49
| 0.003582 |
| 1443434_秒 | 树脂C1 |
Plxnc1公司
|
0.45
| 0.000309 |
| 1455851_吨 | 骨形态发生蛋白5 |
英国标准普尔5
|
0.40
| 0.000004 |
HSC激活标记物水平的升高促使我们检查GFP-HSC是否具有较少的视黄酯和甘油三酯，这是静止HSC脂滴中存在的两种主要脂质物种[8]我们发现，虽然WT和胶原蛋白-GFP小鼠的肝脏中两种脂质的水平相当()，GFP-HSC的视黄酯明显较少()和甘油三酯(). 为了进一步评估这些细胞中的脂滴含量，通过FACS分离AF和GFP HSC，并在玻璃板上培养过夜。通过相位对比和荧光显微镜评估脂滴数量和大小(). 我们发现GFP-HSC平均每个细胞比AF-HSC有更多的脂滴(); 然而，这些液滴的尺寸较小，这是由每个细胞中脂滴的平均直径（以微米为单位）决定的(). 我们还计算了每个细胞的理论脂滴体积，假设脂滴是一个完美的球体。两种人群中每个细胞的总脂滴体积相同()此外，脂滴相关蛋白脂肪分化相关蛋白（ADRP）在AF-和GFP-HSC中的表达水平相同().
肝脏和HSC中的总视黄醇酯和甘油三酯水平。（A） WT和胶原蛋白-GFP小鼠肝脏中的视黄酯（RE）水平，表示为微克RE/克肝脏重量。（B） AF-HSC和GFP-HSC中的视黄酯水平，表示为微克RE每百万个细胞。（C） WT和胶原蛋白-GFP小鼠肝脏中的甘油三酯（TG）水平，表示为每克肝脏重量的微克TG。小鼠在处死和组织收集之前禁食4小时。（D） AF-HSC和GFP-HSC中的TG水平，表示为微克每百万细胞的TG。重要性由学生的t吨-试验，*p值<0.05。（E） AF-HSC和GFP-HSC中LRAT的蛋白质水平。重复实验，结果相似。
过夜培养后AF-HSC和GFP-HSC中脂滴含量的评估。AF-HSC和GFP-HSC通过FACS分离，并在37°C的玻璃底皿中培养过夜。AF HSC（A）和GFP HSC（B）均以60倍放大率拍摄相位对比和荧光图像。比例尺代表30µm。脂滴平均数（C）、脂滴平均直径（µm）（D）和总脂滴体积（µm）三)（E）根据HSC显示。（F） AF-HSC和GFP-HSC中ADRP的蛋白质水平。重复实验，结果相似。
维甲酸和脂质相关基因表达的变化
为了更好地了解GFP-HSC中较低水平的视黄酯和甘油三酯，我们将阵列分析的重点放在视黄醇和脂质相关基因的表达上。类视黄醇和脂质核受体备受关注，因为这组基因代表了具有许多下游效应物的基因调控的主要途径。阵列数据表明，维甲酸X受体α的水平(Rxra公司)、维甲酸受体α和γ(拉拉和拉格)过氧化物酶体增殖物激活受体α(帕帕拉)GFP-HSC较低(). 然而，qRT-PCR分析并未证实这些基因在该细胞群中的表达存在显著差异(). 类似地，阵列显示视黄醇和脂肪酸结合蛋白，特别是视黄醇结合蛋白的差异表达(4卢比)，细胞视黄醇结合蛋白1(卢比1)和脂肪酸结合蛋白4(工厂4) (). mRNA水平的qRT-PCR分析证实工厂4在GFP-HSC中有明显较高的表达(). 该阵列还表明，GFP-HSC中脂质含量改变的基础上可能存在与脂质代谢相关的显著基因转录变化。两种甘油三酯脂肪酶、二酰甘油脂肪酶和β(达格尔布) ()和芳基乙胺脱乙酰酶(阿达克) (). 许多磷脂酶在GFP-HSC中表现出较高的表达，包括A和C亚家族的不同成员(). 值得注意的是，阵列显示羧酸酯酶3(塞斯3)GFP-HSC的表达是GFP-HSCs的82倍()，并通过qRT-PCR证实了该升高塞斯3信使核糖核酸水平(). 鉴于许多羧酸酯酶被认为是肝视黄酯水解酶，这一点很有趣[25],[26]此外，我们通过qRT-PCR分析发现脂蛋白脂肪酶(磅/升)GFP-HSC中mRNA表达升高().
维甲酸和脂质相关核受体的mRNA水平。相对mRNA表达水平Rxra公司,拉拉,拉格、和Ppara公司图中显示了AF-HSC（实心钢筋）和GFP-HSC（剥离钢筋）。将数值标准化为18S，并给出5次AF和5次GFP HSC隔离的平均值±1 S.D。
视黄醇和脂肪酸结合蛋白的mRNA水平。相对mRNA表达水平工厂4,4卢比、和卢比1图中显示了AF-HSC（实心钢筋）和GFP-HSC（剥离钢筋）。将数值标准化为18S，并给出5次AF和5次GFP HSC隔离的平均值±1 S.D。
脂质水解酶mRNA水平。相对mRNA表达水平塞斯3和磅/升图中显示了AF-HSC（实心钢筋）和GFP-HSC（剥离钢筋）。将数值标准化为18S，并给出5次AF和5次GFP HSC隔离的平均值±1 S.D。重要性由学生的t吨-测试，*p值<0.05，**p值<0.01。
表4
维甲酸和脂质相关核受体。
| AFFY ID | 基因名称 | 基因ID | 常设费用 | p值 |
| 1454773_吨 | 视黄醇X受体α |
Rxra公司
|
0.5
| 0.005977 |
| 1450180_a_阿特 | 视黄酸受体，α |
拉拉
|
0.4
| 0.002350 |
| 1419416_阿特 | 视黄酸受体，γ |
拉格
|
0.4
| 0.003971 |
| 1425762_阿特 | 视黄醇X受体α |
Rxra公司
|
0.4
| 0.000323 |
| 1439675_吨 | 过氧化物酶体增殖物激活受体α |
Ppara公司
|
0.3
| 0.004452 |
表5
视黄醇和脂肪酸结合蛋白质类。
| AFFY ID | 基因名称 | 基因ID | 常设费用 | p值 |
| 1451263_a_at（阿特） | 脂肪酸结合蛋白4 |
工厂4
|
10.9
| 0.001481 |
| 1417023_安特 | 脂肪酸结合蛋白4 |
工厂4
|
4.9
| 0.003252 |
| 1416022_at | 脂肪酸结合蛋白5 |
工厂5
|
3.4
| 0.002208 |
| 1426225_吨 | 视黄醇结合蛋白4 |
4卢比
|
3
| 0.022103 |
| 1416021_a_安 | 脂肪酸结合蛋白5 |
工厂5
|
2.8
| 0.000799 |
| 1450779_吨 | 脂肪酸结合蛋白7 |
工厂7
|
2.1
| 0.014394 |
| 1425105_吨 | 视黄醇结合蛋白3，间质 |
Rbp3基因
|
0.5
| 0.024528 |
| 1448754_安特 | 视黄醇结合蛋白1，细胞 |
卢比1
|
0.5
| 0.010727 |
表6
脂肪酶。
| AFFY ID | 基因名称 | 基因ID | 常设费用 | p值 |
| 1430550_吨 | 脂肪酶，家族成员M |
利普
|
6.1
| 0.047718 |
| 1452398_吨 | 磷脂酶C，ε1 |
插图1
|
3.9
| 0.000029 |
| 1417785_安 | 磷脂酶A1成员A |
广场1a
|
3.5
| 0.001223 |
| 1430700_阿特 | 磷脂酶A2，VII组（血小板活化因子乙酰水解酶，血浆） |
广场7
|
3.5
| 0.002280 |
| 1457157_吨 | 磷脂酶C-eta1a |
第1页
|
2.6
| 0.007681 |
| 1425338_吨 | 磷脂酶Cβ4 |
Plcb4公司
|
2.5
| 0.007491 |
| 1436821_阿特 | 磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，X结构域含3 |
Plcxd3
|
2.4
| 0.031885 |
| 1437872_吨 | N-酰基磷脂酰乙醇胺水解磷脂酶D的NAPE-PLD mRNA |
纳佩尔德
|
2.3
| 0.017539 |
| 1451970_吨 | β二酰甘油脂肪酶 |
达格尔布
|
2.3
| 0.011264 |
| 1435771_阿特 | 磷脂酶Cβ4 |
Plcb4公司
|
2.1
| 0.002450 |
| 1448558_a_阿特 | 磷脂酶A2，IVA组 |
广场4a
|
2
| 0.001474 |
| 1424259 _吨 | 脂肪酶成熟因子1 |
Lmf1型
|
0.5
| 0.042273 |
| 1454619_吨 | 脂肪酶成熟因子2 |
液化天然气2
|
0.5
| 0.000238 |
| 1416013_安 | 磷脂酶D家族，成员3 |
第3层
|
0.4
| 0.000290 |
| 1421261_在 | 脂肪酶，内皮 |
利普
|
0.4
| 0.008316 |
| 1432928_天 | 磷脂酶C，δ4 |
血小板4
|
0.4
| 0.039780 |
| 1450188_秒_秒 | 脂肪酶，内皮 |
利普
|
0.4
| 0.002089 |
| 1455448_吨 | 二酰甘油脂肪酶，α |
达格拉
|
0.4
| 0.000027 |
| 1417433_安 | 溶血磷脂酶2 |
Lypla2型
|
0.2
| 0.003292 |
| 1433949_x_at | 可溶性PLA2-Ib前体 |
血小板1b
|
0.2
| 0.018829 |
| 1450128_吨 | 磷脂酶A2，IIA组 |
-
|
0.1
| 0.038422 |
表7
酯酶。
| AFFY ID | 基因名称 | 基因ID | 常设费用 | p值 |
| 1449081_安 | 羧酸酯酶3 |
塞斯3
|
82.2
| 0.000234 |
| 1421218_吨 | 丁酰胆碱酯酶 |
Bche公司
|
45.9
| 0.001056 |
| 1436090_吨 | 核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶6 |
英语6
|
13.7
| 0.014343 |
| 1448813_在 | 芳基乙酰胺脱乙酰酶（酯酶） |
阿达克
|
10.9
| 0.003532 |
| 1417300_吨 | 鞘氨醇磷酸二酯酶，酸性3B |
Smpdl3b公司
|
5.3
| 0.000398 |
| 1438665_吨 | 鞘氨醇磷酸二酯酶3，中性 |
Smpd3公司
|
5.1
| 0.002101 |
| 1438785_安 | 核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶6 |
英语6
|
4.8
| 0.004224 |
| 1452202_at | 磷酸二酯酶2A，cGMP刺激 |
钯2a
|
4.5
| 0.006551 |
| 1422779_安 | 鞘氨醇磷酸二酯酶3，中性 |
Smpd3公司
|
4.3
| 0.041569 |
| 1447707秒 | 磷酸二酯酶2A，cGMP刺激 |
-
|
3.6
| 0.026599 |
| 1416913_安 | 酯酶1 |
紧急情况1
|
3.4
| 0.044153 |
| 1417626_吨 | 磷酸二酯酶4D相互作用蛋白 |
-
|
2.8
| 0.001982 |
| 1448136_安特 | 核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2 |
Enpp2公司
|
2.8
| 0.004744 |
| 1424150_at处 | 含有5的甘油磷酸二酯磷酸二酯酶结构域 |
Gdpd5公司
|
2.6
| 0.030611 |
| 1451857_a_阿特 | 果胶乙酰酯酶同源物 |
诺特姆
|
2.5
| 0.015403 |
| 1417667_安特 | 磷酸三酯酶相关 |
普特
|
2.4
| 0.000644 |
| 1427302_at | 核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3 |
Enpp3公司
|
2.3
| 0.000140 |
| 1415894_安特 | 核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2 |
Enpp2公司
|
2.2
| 0.001248 |
| 1437341_x_at | 2′，3′-环核苷酸3′磷酸二酯酶 |
-
|
0.5
| 0.000609 |
| 1431913_日期 | 磷酸二酯酶3A，cGMP被抑制 |
-
|
0.5
| 0.000050 |
| 1435096_吨 | 对胆碱酯酶8同系物B抑制剂的耐药性 |
里氏8b
|
0.5
| 0.001273 |
| 1422635_安 | 乙酰胆碱酯酶 |
疼痛
|
0.5
| 0.004425 |
| 1437989_吨 | 磷酸二酯酶8B |
-
|
0.5
| 0.000826 |
| 1421353_吨 | CAMP特异性磷酸二酯酶7B |
预期收益7b
|
0.4
| 0.015231 |
| 1423810_吨 | 蛋白磷酸酶甲基酯酶1 |
第1页
|
0.4
| 0.000273 |
| 1418302_at | 棕榈酰蛋白硫酯酶2 |
第2页
|
0.4
| 0.000061 |
| 1452897_吨 | 细胞分裂周期2-like 5（胆碱酯酶相关细胞分裂控制器） |
Cdc2l5公司
|
0.4
| 0.000532 |
| 1421535_阿特 | 磷酸二酯酶4A，cAMP特异性 |
钯4a
|
0.4
| 0.002163 |
| 1432490_a_阿特 | 磷酸二酯酶10A |
-
|
0.4
| 0.046869 |
| 1450453_a_阿特 | CGMP-磷酸二酯酶6γ亚单位 |
Pde6克
|
0.4
| 0.035910 |
| 1442700_吨 | 磷酸二酯酶4B，cAMP特异性 |
钯4b
|
0.4
| 0.000132 |
| 1451615_吨 | 羧酸酯酶8 |
切斯8
|
0.3
| 0.012629 |
细胞色素介导的维甲酸分解代谢
由于已经明确HSC类视黄醇在细胞激活时丢失，我们假设GFP-HSC中的低水平视黄醇酯是HSC中视黄醇动员增加或HSC内视黄醇分解代谢增加的结果。我们的数据表明，第一种假设不太可能，因为我们观察到GFP-HSC中维甲酸结合蛋白的差异表达()，负责体内类视黄醇的细胞间和细胞内运输。为了研究第二个假设，我们考虑了细胞色素P450酶基因表达的变化。众所周知，细胞色素（CYPs）能代谢外源化合物，包括环境中的化学物质、致癌物和药物，也能代谢内源性化合物，包括维甲酸[27]阵列显示GFP-HSC中有许多CYP差异表达(). 然而，我们对已知可代谢维甲酸和/或拟在HSC激活中发挥作用的CYP特别感兴趣。在阵列上差异表达的25个CYP中，有两个符合这些标准：Cyp2s1其在GFP-HSC中的表达高达32倍，并且周期2e1在GFP-HSC中的表达约为3倍(). 我们确认了更高水平的Cyp2s1和周期2e1信使核糖核酸()和CYP2S1蛋白()GFP-HSC与AF-HSC相比。CYP2E1蛋白无变化().
维甲酸代谢细胞色素P450酶的mRNA和蛋白表达。（A） 相对mRNA表达水平Cyp2s1和周期2e1图中显示了AF-HSC（实心钢筋）和GFP-HSC（剥离钢筋）。将数值标准化为18S，并给出5次AF和5次GFP HSC隔离的平均值±1 S.D。重要性由学生的t吨-测试，**p值<0.01。（B） AF HSC和GFP HSC中CYP2S1和CYP2E1的蛋白质水平。实验重复进行，结果相似。
表8
细胞色素P450酶。
| AFFY ID | 基因名称 | 基因ID | 常设费用 | p值 |
| 1416612_在 | 细胞色素P450，家族1，亚家族b，多肽1 |
Cyp1b1周期
|
100.9
| 0.000175 |
| 1428283_吨 | 细胞色素P450，家族2，亚家族s，多肽1 |
Cyp2s1
|
32
| 0.004925 |
| 1460604_安 | 细胞色素b还原酶1 |
Cybrd1号机组
|
23.6
| 0.000016 |
| 1421075秒 | 细胞色素P450，家族7，亚家族b，多肽1 |
Cyp7b1细胞
|
17.1
| 0.000044 |
| 1417507_吨 | 细胞色素b-561 |
Cyb561号
|
13.2
| 0.000421 |
| 1421074_吨 | 细胞色素P450，家族7，亚家族b，多肽1 |
Cyp7b1细胞
|
10.2
| 0.000009 |
| 1425040_吨 | 细胞色素b还原酶1 |
Cybrd1号机组
|
9.2
| 0.000095 |
| 1416613_安 | 细胞色素P450，家族1，b亚家族，多肽1 |
Cyp1b1周期
|
8.9
| 0.000029 |
| 1419559_吨 | 细胞色素P450，家族4，亚家族f，多肽14 |
第4f14周期
|
8.4
| 0.000002 |
| 1422533_吨 | 细胞色素P450，家族51 |
Cyp51型
|
4.7
| 0.000374 |
| 1436778_吨 | 细胞色素b-245，β多肽 |
Cybb公司
|
4.4
| 0.000743 |
| 1422978_吨 | 细胞色素b-245，β多肽 |
Cybb公司
|
4
| 0.001173 |
| 1444138_安 | 细胞色素P450，家族2，亚家族r，多肽1 |
周期2r1
|
3.9
| 0.016331 |
| 1436779_吨 | 细胞色素b-245，β多肽 |
Cybb公司
|
3.8
| 0.003131 |
| 1450646_安 | 细胞色素P450，家族51 |
Cyp51型
|
3.4
| 0.001651 |
| 1415994_安特 | 细胞色素P450，家族2，亚家族e，多肽1 |
周期2e1
|
2.9
| 0.006021 |
| 1422534_吨 | 细胞色素P450，家族51 |
Cyp51型
|
2.8
| 0.010709 |
| 1418780_吨 | 细胞色素P450，39家族，a亚家族，多肽1 |
Cyp39a1细胞
|
2.2
| 0.038740 |
| 1418709_安 | 细胞色素c氧化酶，亚基VIIa 1 |
考克斯7a1
|
2.1
| 0.017825 |
| 1440211_吨 | 细胞色素P450，家族2，亚家族j，多肽11 |
Cyp2j11号机组
|
0.5
| 0.026833 |
| 1416933_安 | P450（细胞色素）氧化还原酶 |
波尔
|
0.5
| 0.002868 |
| 1430452_时间 | 细胞色素P450，家族20，亚家族A，多肽1 |
Cyp20a1细胞
|
0.5
| 0.000408 |
| 1416112_at | 细胞色素c氧化酶，亚基VIIIa |
考克斯8a
|
0.4
| 0.000037 |
| 1450752_吨 | 细胞色素c，睾丸 |
色素蛋白
|
0.3
| 0.011154 |
| 1425645秒 | 类Cyp2b10假基因 |
Cyp2b10
|
0.3
| 0.040338 |
CYP2S1是一种最近发现的细胞色素酶，在肺、小肠和脾脏中高度表达，可由二恶英诱导，二恶英通过芳香烃受体发挥作用[28],[29]。据报道，它可以代谢并被所有人诱导-反式-维甲酸[30]文献并未明确确定CYP2S1在肝脏中的表达；在肝脏中检测到CYP2S1的表达，尽管表达水平很低[31],[32]最近，CYP2S1在人类HSC中表达[33]为了进一步阐明CYP2S1在小鼠肝脏中的表达，我们分离了肝细胞和HSC，并测量了6个CYP的mRNA水平，这些CYP是根据其已知的肝脏表达、在维甲酸代谢中的作用和/或在肝脏疾病中的拟议作用选择的。我们发现了周期2e1在肝细胞中表达更高，Cyp2s1在HSC中高度富集().
塞浦路斯2 s1是一种维甲酸化CYP，在HSC中高表达，在肝纤维化中诱导。（A） 从3个月龄的雄性WT C57小鼠中分离出HSC和肝细胞。相对mRNA表达水平Cyp26a1细胞,周期2e1,Cyp2c37、和Cyp2c39（左侧面板）和细胞周期26b1和Cyp2s1（右侧面板）如图所示。（B） 每周给WT C57雄性小鼠注射玉米油或0.5 ul CCl4/g B.W.在玉米油中给药4周，然后处死。相对塞浦路斯测定全肝匀浆mRNA水平。将数值标准化为18S，并作为平均值±1 S.D.。显著性由学生的t吨-经检验，*p值<0.05，**p值<0.01，**p-值<0.001。
已显示Cyp2s1与非胶原蛋白表达人群相比，HSC高表达胶原蛋白，HSC表达胶原蛋白升高，我们开始关注当HSC激活并失去其脂滴含量时，这种细胞色素是否在肝纤维化的早期事件中发挥作用。为了解决这个问题，我们给大约3个月大的WT C57小鼠注射CCl4（0.5µl/g体重）或玉米油载体对照组每周一次，持续4周，并评估上述6个CYP mRNA表达的变化。接受CCl的小鼠肝总视黄醇（视黄醇+视黄醇酯）水平显著降低4注射(图S2)，证实这些小鼠成功激活HSC。我们发现肝脏中Cyp26a1细胞和Cyp2s1当小鼠接受CCl治疗时，两者均升高4每种情况下大约增加4倍(). 因此，我们确定Cyp2s1作为唯一在HSC中高表达并在CCl中诱导的维甲酸化CYP4-介导HSC激活。我们认为CYP2S1在HSC视黄醇含量的分解代谢中起作用，导致胶原蛋白表达的HSC和活化的HSC中的视黄醇酯和脂滴含量降低体内由CCl提供4暴露。
讨论
肝脏中HSC群体存在异质性和可塑性的观点并不新鲜，但之前还没有得到很好的研究。20世纪90年代初的研究引入了这一观点，利用HSC标志物结蛋白表明，肝脏中存在大量结蛋白阴性的脂肪细胞样细胞[34]这些HSC缺乏维生素A[35]我们的研究扩展了这些早期的报告，并提出了一个观点，即通过使用不同的方法从肝脏中分离出两个不同的HSC群体，并表征其形态和生化特性，肝脏中并非所有HSC都是等效的。我们使用的不同细胞分离方法利用了这些细胞的不同特性：第一种方法依赖于HSC脂滴维生素A的含量，第二种方法依赖HSC I型胶原基因的表达。
HSC分离的标准方法采用Nycodenz密度梯度从肝消化物中分离非实质性细胞，肝消化物的肝细胞因暴露于蛋白酶而被破坏[9],[21],[22]HSC中大量脂滴的低浮力密度（参见)使这些细胞漂浮到梯度的顶部，从而与肝脏中其他脂质含量较低的细胞类型分离。为了获得富含维生素a的HSC群体，我们还对nycodenz纯化的细胞进行了FACS。维生素A在350nm激发时会发出自荧光，因此暴露在这种波长的光下，我们可以收集富含维生素A的细胞群。我们还采用了第二种基于FACS的方法来分离HSC。这涉及使用胶原蛋白-GFP小鼠，其中GFP的表达受第1a1列发起人[16]我们的数据证实，肝脏中I型胶原的表达仅限于HSC，GFP的表达仅与结蛋白阳性细胞共同定位。我们的数据还表明，基于GFP的HSC分离方法产生的细胞群体具有与传统Nycodenz方法等效的结蛋白表达。因此，我们首次证明了一种新的HSC分离方法，该方法可以产生与传统Nycodenz方法分离的细胞纯度相同的细胞。
当肝脏面临急性损伤时，会启动创伤治疗反应，最终使肝脏恢复健康状态；然而，当肝脏面临慢性损伤时，结果往往是肝纤维化，即产生过多的纤维结缔组织作为修复过程来控制损伤部位[13],[14]在肝纤维化的早期阶段，HSC经历一个活化过程，从静止的类脂肪细胞状态转变为肌纤维增生性收缩表型。活化的HSC表达高水平的COL1a1和ACTA2，这是细胞外基质的关键成分。肝纤维化的其他关键增殖、纤维化和收缩刺激分别是PDGF-C、TGF-β和EDN1[36]ACTA2的诱导是HSC激活的唯一最可靠的标志，因为在正常或受损的肝脏中，其他常驻肝细胞中没有ACTA2；此外，它的表达意味着收缩表型[37]我们的数据显示，GFP-HSC的ACTA2 mRNA和蛋白质水平显著升高，表明这是早期激活的HSC群体。由于分离出这些细胞的肝脏没有实验性损伤或化学诱导，这些发现表明，在生理条件下，肝脏中存在大量预先激活的HSC。这个想法支持了早期在转基因小鼠中的研究，其中GFP由I型胶原启动子驱动，而红色荧光蛋白（RFP）由学报2发起人[38]结果表明，存在活化HSC的混合群体，一些群体仅表达GFP或RFP，而另一些群体同时表达两者。这种现象可能有两种解释。一种可能性是，这些细胞在局部肝脏损伤时会部分激活，这可能涉及机体的天然微生物群（可能是肠道菌群）和LPS反应的激发；另一种选择是，健康肝脏中的HSC群体可能处于不断的流动中，从而存在静止和激活HSC的周期性转换。我们认为第二种可能性更大，我们发现健康肝脏中存在预先激活的HSC群体，这反映了这些细胞的动态生理学，从而确保始终有一部分人群准备好应对肝损伤。
脂滴是不可或缺的代谢活性细胞器，广泛存在于物种（包括植物、动物和酵母）以及不同动物细胞类型（脂肪细胞、巨噬细胞、肝细胞、肝星状细胞等）中[39]因此，脂滴具有多样性。在不同细胞类型中发现的脂滴具有不同的脂质和蛋白质组成。细胞特异性定位和独特的成分决定了以细胞类型特异性的方式调节脂滴的形成和维持。液滴中主要的脂质种类与负责合成脂质的酶之间存在着强烈的相关性。例如，脂肪细胞脂滴主要由DGAT1（二酰甘油酰基转移酶1）和/或DGAT2合成的甘油三酯组成，当这两种酶不表达时，不会形成脂滴[40]类似地，HSC脂滴具有独特的维甲酸和脂质含量，在体内其他类型的细胞中没有发现[8],[9]视黄酯含量取决于LRAT的表达，LRAT是唯一能够合成视黄酯的肝酶体内
[10]我们发现，当LRAT表达减少时，这些脂滴的尺寸变小，表明降解。重要的是，还确定当HSC被激活时，它们会失去含有视黄酯的脂滴；尽管不知道这种损失是激活过程的原因还是结果。因此，我们的发现与HSC激活早期发生的事件密切相关。LRAT表达低，视黄酯水平降低，HSC脂滴有明显改变。
我们对GFP-HSC中不同脂滴含量的观察进一步使我们能够假设HSC激活早期发生的事件。需要强调的是，GFP-HSC尚未被实验诱导，因此我们将这些细胞区分为“预激活”HSC：它们没有完全激活，但它们显示了此类细胞的特征，包括视黄酯水平降低和ACTA2 mRNA和蛋白表达升高。我们预计HSC激活的早期事件会遵循以下三种情况之一：（i）脂滴数量逐渐减少，最终导致液滴完全消失；（ii）脂滴逐渐减小，最终导致液滴完全消失；或（iii）脂滴最初被分解成更多、更小的液滴——数量增加，尺寸减小——然后数量逐渐减少，直到细胞中没有残留。有趣的是，我们的数据为第三种更复杂的情况提供了有力的证据。我们表明，GFP-HSC是一组未诱导但表达胶原蛋白的细胞，与AF-HSC相比，它们有更多的脂滴，并且这些脂滴的尺寸较小，这是由平均直径的减小决定的。我们的数据与其他研究脂滴在其他细胞系统中溶解的研究结果一致。众所周知，在3T3-L1脂肪细胞中激素刺激的脂解的最初几个小时内，这些细胞中的脂滴破碎并分散成微脂滴，这显著增加了脂肪酶活性的表面积[41]–[43]大鼠脂肪细胞也有类似的脂滴溶解模式，其中通过电穿孔将组成活性β-1肾上腺素能受体注入动物的脂肪垫来刺激脂肪分解[44]未来的研究有必要通过实时跟踪HSC激活后脂滴重塑来直接确认HSC中的这一序列事件。还需要确定脂滴相关蛋白（如ADRP）对这些过程的贡献。我们的数据显示，ADRP蛋白在GFP-HSC中的表达没有差异，但其在细胞和脂滴上的分布可能会因脂肪分解的开始阶段而改变。
我们的数据还证实了GFP-HSC中甘油三酯水平降低，以及许多脂质代谢相关基因的差异表达。这并不奇怪，因为甘油三酯是HSC脂滴中第二大最主要的脂质种类（31.7%），仅略低于视黄酯（39.5%）[8],[9]。当视黄酯因活化而丢失时，HSC脂滴很可能成为靶点并发出分解信号，因此，非视黄醇脂质的合成受到下调。这类似于上面讨论的观点，即当在特定液滴中发现的主要脂质未合成时，液滴将不会形成。就我们正在研究的GFP-HSC而言，由于LRAT仍在表达，一些视黄酯仍在生成；因此，液滴是存在的，但它们的尺寸较小。HSC甘油三酯水平的降低可能是甘油三酸酯合成减少或甘油三脂分解代谢增加的结果。阵列数据表明GFP-HSC中的甘油三酯合成没有显著差异。GFP-HSC中没有参与甘油三酯生物合成的基因具有显著差异表达。DGAT1和DGAT2是肝脏中已知的甘油三酯合成酶[45],[46]，但两者在两个HSC群体中的表达水平相同（数据未显示）。然而，甘油三酯分解相关基因的表达存在许多差异，这些基因分为脂肪酶或酯酶。我们观察到两种甘油三酯脂肪酶和一些磷酸脂肪酶的表达增加。磷脂约占HSC脂滴中脂质的6%[8],[9]; 因此，磷脂分解代谢的增加支持了这样一种观点，即当视黄醇酯较低时，非视黄醇脂质也会被降解。我们还观察到切斯3这一点很有趣，因为其他羧酸酯酶最近被认为是HSC中潜在的视黄酯水解酶，包括ES-4和-10[47],[48]我们的研究结果表明，Ces3可能是活化HSC中的视黄酯水解酶，但还需要做更多的工作来确认其HSC的表达以及在视黄酯水解中的作用。同样，我们发现磅/升在GFP-HSC人群中。Mello等人已经证明，LpL在肝细胞和HSC中的表达水平很低，但在活化的HSC中其表达被诱导32倍[47]因此LpL公司进一步证明GFP人群是预先激活的HSC。总的来说，GFP-HSC中高度变化的脂质代谢非常有趣，因为我们仍然不太了解HSC脂滴中的特定脂质种类，尤其是这些细胞中脂质的确切脂肪酰基组成。我们目前对视黄酯、甘油三酯、胆固醇、磷脂和游离脂肪酸的分解有相当粗略的了解[8],[9]因此，这一领域的未来工作将被证明是非常令人兴奋的，因为有可能使用新的脂质组学领域，并使用LC/MS/MS进行这些表征。
细胞色素P450是一个超家族酶，已知其代谢外源化合物，包括环境中的化学物质、致癌物和药物，以及内源性化合物，包括维甲酸[27]我们有兴趣研究六种细胞色素，特别是基于它们在肝脏中的表达和/或在不同类型的肝脏疾病中的作用。CYP26（包括CYP26A1、B1和C1）被认为是体内主要的类视黄醇分解代谢CYP[49]–[52]。众所周知，它们能代谢所有-反式-此外，还可诱导维甲酸。CYP26A1和B1在小鼠肝脏中表达，但C1不表达。CYP2E1因其在酒精性肝病中的作用和释放活性氧物种而著名，已知活性氧物种可促进HSC的纤维化[53],[54]CYP2S1是一种相对较新识别的CYP，因此尚未得到充分研究；然而，据报道它能代谢维甲酸[28]–[30]最后两个CYP 2C37和2C39具有肝脏特异性表达[55]此外，据报道2C39可代谢维甲酸[56]在这六个CYP中，通过qRT-PCR和western blot，只有CYP2S1在GFP-HSC中升高。文献中的先前报告表明CYP2S1在肝脏中的表达很低[31],[32]我们的数据表明Cyp2s1在HSC中高度富集，HSC仅占肝细胞的6-8%，并含有1%的肝蛋白[6],[37]因此，肝细胞、枯否细胞和内皮细胞的存在将掩盖整个肝细胞中的表达。此外，我们还表明Cyp2s1表达式被提升体内通过四氯化碳介导的肝纤维化诱导。因此，我们认为CYP2S1介导的视黄醇分解代谢可能在肝纤维化早期激活的HSC中脂滴和视黄醇酯含量的丢失中发挥作用。
总之，使用基于FACS的HSC分离方法，我们表明在正常小鼠肝脏中存在不同数量的HSC。GFP分离的HSC改变了脂滴含量，并显示出不同的生化特性，这是由不同的基因和蛋白质表达谱以及脂滴中维生素A酯和甘油三酯的不同储存能力决定的。具体而言，我们发现GFP-HSC具有：（i）HSC激活的典型标记物的表达增加；（ii）视网膜基酯显著减少，伴随LRAT蛋白表达减少；（iii）显著减少甘油三酯；（iv）与脂质分解代谢相关的基因表达增加，即水解酶和酯酶；和（v）视黄醇化CYP，CYP2S1的表达增加。我们的数据表明，正常、未受损肝脏中的HSC人群存在异质性。HSC人群的一个子群可以作为激活的“引物”，因此他们是受伤肝脏的第一反应者。
支持信息
图S1
微阵列分析中使用的样品的质量评估。对6只小鼠分离的AF-HSCs和5只小鼠分离出的GFP-HSCs进行基因芯片分析。从这些群体纯化的cDNA在Affymetrix小鼠基因组430 2.0阵列上运行，并使用GeneSifter软件分析数据。（A） 结蛋白mRNA水平归一化为18S。学生的t吨-测试用于分析各组之间的统计显著性差异。当p<0.05时，组间差异显著。（B） 显示最大值和最小值的箱线图摘要，1标准和3第个AF和GFP组的四分位数和中位数。（C） 散点图摘要显示了数据点在标识线周围的分布。GFP组中所有过度表达的基因均显示为红色；AF组中过度表达的基因以绿色显示。
（畅通节能法）
图S2
CCl治疗小鼠肝脏中的总视黄醇水平4.每周给WT C57雄性小鼠注射玉米油或0.5 ul CCl4/g B.W.在玉米油中给药4周，然后处死。显示总视黄醇（视黄醇+视黄醇酯）水平，表示为每克肝脏的nmol总视黄醛。重要性由学生的t吨-试验，*p值<0.05。
（畅通节能法）
表S1
用于qRT-PCR分析的ABI引物。从Applied Biosystems（ABI）购买的商用引物显示了所有基因的ABI登录号，并对其进行了qRT-PCR分析。
（文件）
致谢
作者感谢哥伦比亚大学的Cathy Mendelsohn博士和Andrei Molotkov博士在共焦显微镜方面的有益讨论和帮助，感谢Jason Yuen先生帮助准备培养的HSC的相位对比和荧光图像。我们还感谢凯斯西大学的Krzysztof Palczewski博士慷慨捐赠LRAT抗体。作者感谢Vladan Miljkovic先生和哥伦比亚大学基因组技术微阵列设施进行微阵列芯片分析，以及哥伦比亚大学赫伯特·欧文综合癌症中心流式细胞术核心对孤立的HSC进行FACS。
脚注
竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。
基金：这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R01 DK068437、R01 DK079221和RC2 AA019413的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
工具书类
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