GETPrime：用于定量实时PCR的基因或转录特异性引物数据库

摘要

背景

大规模基因组方法在人类和其他模式生物中证明了广泛的选择性剪接(1,2)，当前的基因模型不断更新，以包括额外的剪接事件(三). 然而，替代剪接的调控机制，以及单个基因剪接变异体的生物学意义和功能，仍知之甚少(4). 这在很大程度上是因为缺乏简单的工具来分析和量化具有高灵敏度的单个剪接变异体。高通量实时定量聚合酶链反应（qPCR）是准确定量核酸序列（包括剪接变体）的理想技术。此外，它补充了通过微阵列或深度测序进行的基因表达分析，因为后者的分析方法在总成本和所需的计算专业知识方面仍不如定量检测基因转录物的qPCR有效，尤其是那些低表达的基因，如许多转录因子（TF）基因(5,6). 因此，选择合适的引物对获得最佳qPCR结果至关重要。一个理想的qPCR引物设计程序应该至少包括以下特征：首先，鉴于上述对理解单个基因剪接变异体的作用越来越感兴趣(1,7,8)程序需要考虑每个基因的所有带注释的剪接变体，以便能够进行基因（涵盖大多数剪接变体）或转录特异性（涵盖一个剪接变异体）表达谱分析；其次，至少有一个引物需要跨越外显子，以避免扩增污染基因组DNA；第三，需要通过相似性搜索自动评估每个引物的特异性；第四，检索最佳引物组合不需要繁琐的后处理，第五，引物对在其基因组上下文中的位置应该可视化，以便最终用户进行简单的最终评估。

在为大规模TF基因表达谱实验寻找qPCR引物设计软件时，我们考虑了几个软件包，但没有一个满足规定的要求，因为这些程序在质量、功能或吞吐量模式上都有所不同(表1). 基于Primer3的最流行界面(9)，名为Primer3Plus(10)，允许用户定义设计寡核苷酸引物的各种可能参数和选项。然而，该程序的使用非常耗时，因为用户必须手动处理大量建议的引物，例如，当通过BLAST验证引物特异性时(11). 另一个程序RASE(12)生成用于检测和定量特定剪接亚型的qPCR引物，但无法设计基因特异性引物。此外，其关联的web界面仅支持低吞吐量实验。其他程序，如PerlPrimer(13)，数量素数(14)和BatchPrimer3(15)允许批量引物输入，以及qPCR引物的一些数据库，包括定量PCR引物数据库(16)、RTPrimerDB(17)，PrimerBank(18)和qPrimerDepot(19)开发用于高通量引物设计或检索。但是，这些软件包中没有一个能够组合和自动化所有重要功能，以满足高通量qPCR实验中qPCR引物设计日益增长的需求，特别是无需后处理以基因或转录特异方式靶向基因的需求(表1).

为了填补这一空白，我们开发了自己的qPCR引物设计软件GETPrime。该程序旨在生成针对最新Ensembl版本中可用的每个基因的引物，作为参考资源(20). 然而，为了实现快速引物检索，我们将我们的程序与GETPrimedb链接，GETPrimerdb是一个数据库，可以通过用户友好的基因或转录特异性引物界面进行快速检索智人,小家鼠,秀丽隐杆线虫,黑腹果蝇和达尼奥雷里奥在Ensembl数据库中注释的组装染色体中的基因。

数据库建设与开发

底漆生成

GETPrime结合了几个现有工具：PerlPrimer程序(13)，爆炸(11)通过自定义perl包装器和Ensembl数据库，实现工作流和决策过程的自动化，以选择最佳引物对（参见工作流，图1).

在单独的窗口中打开

图1。

总体底漆设计管道。描述了整个工作流程。绿色方框的解释见图2。粉色和紫色方框的详细说明见图3和​和4，4分别为。有关更多详细信息，请参阅正文。

GETPrime管道的第一步是从Ensembl数据库中为每个感兴趣的靶基因选择转录本作为输入。为了全面起见，我们将所有具有“已知”或“新”状态的基因纳入GETPrime数据库中的Biomart门户网站(21). 然后根据两个独立的标准选择每个基因特定的转录本：（i）其状态必须标注为“已知”，因为我们选择不将“新”转录本包括在我们的数据库中，因为这些转录本尚未通过物种特定的测序数据验证（来自合集项目的Bert Overduin，个人通信）和（ii）最高连接分数(图2). 在第一轮中，该分数允许选择包含备选剪接变异体中保守外显子连接的转录本。如果多份成绩单获得相同的最高分数，则选择序列最短的成绩单。接下来，这第一个选定的转录本将作为输入提供给我们修改后的PerlPrimer程序。该程序支持外显子连接处一种特定转录物的引物设计，以避免由于DNA污染而导致的非特异性扩增。PerlPrimer使用图形用户界面运行Spidey(22)检测内含子/外显子边界，并搜索输入转录本上所有可能的引物对。为了能够为大量基因生成引物，我们修改了PerlPrimer以使用Ensembl提供的外显子连接坐标。此外，与PerlPrimer经常生成数十个候选引物对而没有质量分数的情况相比，GETPrime运行了一个广泛的工作流，根据严格的参数选择三个最佳的引物对候选(表2)以及允许引物对排序的明确标准(图1和​和3三).

在单独的窗口中打开

图2。

基因或转录特异性引物设计的连接得分算法概念的可视化。图中描绘了一个带有三个替代转录本的基因的示意图。蓝色方框代表外显子，线条代表内含子。每个转录本包含外显子a–D和a′的子集。交叉点得分(N个)构成包含相应剪接连接的转录本数量。为了设计基因特异性引物，连接得分的总和，表示为S公司，为每个成绩单和最高成绩单计算S公司-值，该值包含最高N个-选择了分数（此处吨₁). 然后，优先设计基因特异性引物，使其中一个引物跨越最高的外显子连接N个-所选成绩单中的分数(吨₁)，如深蓝色箭头所示。

在单独的窗口中打开

图3。

选择最佳底漆对的工作流。根据这些层次标准，自动选择最佳引物对。首先，按照图和正文中的描述，对每个引物对进行喷砂处理并可能丢弃。然后，对于剩余的引物对，如果至少有一个引物跨越5′-或3′-UTR，则丢弃对。经过这两个严格的筛选步骤后，剩下的引物根据（i）最高的转录覆盖率，（ii）引物是否位于同一外显子（不理想）内（理想），以及（iii）对于qPCR效率和实验变异更为理想的最小扩增子大小进行排序(35).

表2。

默认和宽松底漆设计参数的比较

qPCR引物质量标准	默认参数	松弛参数
底漆长度	19–25个基点	19–25个基点
振幅长度	80–200个基点	60–300个基点
熔化温度(吨米)	57–60摄氏度	57–60摄氏度
	Δ吨米 = 1摄氏度	Δ吨米 = 2摄氏度
不包括%GC	仅考虑40-60%	仅考虑40-60%
GC夹具	每个底漆的三个3′-碱基中的两个必须是G或C	每个底漆的三个3′-碱基中的两个必须是G或C
外显子/外显子连接引物	5′端至少7 bp，3′端至少3 bp	5′端至少7 bp，3′端至少3 bp

在单独的窗口中打开

熔化温度(吨_米)在PerlPrimer程序中计算(13)它使用了J.SantaLucia广泛的近邻热力学参数(38,39)和默认盐条件（1.5 mM Mg²⁺、200 mM寡聚物、0.2 mM dNTP和50 mM单价阳离子）。粗体文本突出显示了默认底漆设计参数和宽松底漆设计参数之间的差异。G=鸟嘌呤；C=胞嘧啶。

第一个重要标准(图3)是指引物特异性，使用BLASTN对所有预测转录物的整个基因组DNA和cDNA进行评估。为了确保BLAST中的引物特异性，我们取消了默认过滤器，因为这允许检测虚假比对，甚至在生物相关基因组区域之外。这也是我们实施低严格性的原因E类-值100，确保检测到与引物序列的所有可能对齐。如果两个引物都与至少60%的序列一致性相匹配，一个DNA或cDNA区域跨越最多5000 bp，并且该区域与目标转录物本身的位置不对应，则会丢弃该引物对，因为它可能错误地指向另一个基因或假基因。与刚刚丢弃的引物相似的引物对（两个引物至少50%重叠），通常移位1到2个碱基，也会被丢弃，以避免运行过多的BLAST搜索。BLAST标准对于专门监测来自同一家族的蛋白编码基因的表达尤其重要，例如同源域TF。第二个标准是丢弃跨越5′-或3′-非翻译区（UTR）的引物对。基于靶向这些区域的引物的转录定量可能是有偏差的，因为3′-UTR包含多个聚腺苷酸化区域，并且如果用寡聚（dT）引物合成cDNA，则5′-UTR经常缺失或截短。其他排名标准是涵盖的基因特异性转录本的数量（如N个如所示图2)扩增子的大小以及引物对是否位于同一外显子内。

如果在排序管道的末尾，没有任何引物对通过选择，则放宽某些参数，直到获得满意的引物对。参数松弛在修改的PerlPrimer脚本和最佳引物对选择工作流程中执行(图4). 在修改后的PerlPrimer脚本中，放松的第一个参数是放大子长度和熔化温度差(表2)其次是外显子/外显子连接标准（允许5′端<7bp和/或3′端<3bp）以及跨越不同外显子的要求。在最佳引物对选择工作流程中，可以放宽的参数是引物特异性的范围和引物在UTR区域的位置，有时这是唯一能够区分两个或多个转录物的位点。在这些宽松条件下生成的引物会被标记，并告知用户哪些参数被更改以获得引物。即使在参数松弛后，也无法找到引物的基因被标记为“无引物”。

在单独的窗口中打开

图4。

通过放宽引物设计参数来找到至少一对合适的引物的工作流程。圆圈示意了修改后的PerlPrimer脚本的运行以及图1。圆圈的中心和右侧分别描述了修改后的PerlPrimer脚本中参数的松弛以及在选择最佳引物对时允许的选项。蓝色和绿色圆圈分别表示默认参数和放松的设计参数(表2). 箭头表示逻辑流程。如果任何一组参数都没有找到引物，程序将报告“无引物”。

三对顶级引物与引物对覆盖的转录本列表、正向和反向引物序列、引物熔化温度、起始和终止引物位置、基因的集合状态（“已知”或“新”）一起保存在输出文件中，指示是否放松参数以获得引物对，以及到图形视图的链接。最后，重新分析排名靠前的引物对未涵盖的潜在转录物，以设计涵盖其余组转录物的额外引物对。重复这个过程，直到所有预测的转录本被至少一对引物覆盖。这个针对选定基因组的所有带注释基因的计算练习的结果存储在通用特征格式（GFF）文件中，并保存在MySQL数据库中。

此外，我们的流水线已经通过更改工作流来选择最佳引物对，从而扩展用于转录特定的表达谱分析。不是根据最高转录覆盖率对引物对进行排序，而是根据最小转录覆盖率进行排序。Ensembl第61版中每个模型生物体的最佳排序基因或转录特异性引物对所涵盖的平均基因数列于表3例如，98%的已知小鼠集合基因由基因和转录特异性引物对覆盖。其中，50%没有相关警告，2%是通过放宽引物参数[扩增子长度和熔化温度偏差]获得的(表2)]没有任何其他类型的警告。总计算时间取决于每个模型生物体处理和变化的基因数量，需要两天左右(D.黑腹果蝇)和两周(智人)在我们的服务器上[Linux系统（内核2.6.18），48 x Intel Xeon 2.67 GHz四CPU，74GB RAM内存]。

表3。

每个物种的最佳引物对覆盖的基因的平均数量

物种	已知蛋白质编码基因的数量（Ensembl v61）	由一对引物覆盖的基因，n个(%)	没有警告的底漆对	底漆对设计放松，没有其他警告	无其他警告的UTR引物对	具有跨越标准的引物对放松了，没有其他警告	两个引物在不同外显子上的引物对没有其他警告	引物对非特异性，无其他警告	带有其他警告的底漆对
智人	34 960	34 093 (97.5)	14 521	643	967	2695	8997	3119	3151
小家鼠	29 445	28 840 (97.9)	14 425	600	967	1832	6052	2207	2757
秀丽隐杆线虫	38 237	21 964 (57.4)	17 510	403	161	1528	833	736	793
黑腹果蝇	14 869	14 368 (96.6)	8493	301	427	1241	2359	376	1171
达尼奥雷里奥	24 370	24 203 (99.3)	18 091	487	499	899	1261	2174	792

在单独的窗口中打开

我们计算了基因或转录特异性引物对的平均数量及其主要严格性。

数据库访问

Google Web Toolkit用于生成Web界面并在浏览器中直接显示MySQL查询结果。检索引物对的界面接受基因符号，也被BioMart门户定义为“相关基因名称”(21)和集合基因或转录ID。可以选择找到覆盖一个基因大多数转录本的引物（用最少数量的特异引物实现最大覆盖），或者如果可能的话，为每个单个转录本提供特定的单个引物对，以详细量化剪接变异体。该接口包含不同的过滤可能性，以获得所需的引物输出。例如，可以只选择没有警告的引物，或者决定包括带有个人用户可以接受的特定警告的引文（例如“inUTR”）。界面中添加了一个典型的查询示例，该示例在每个处理步骤中都具有视觉提示，以帮助用户。GETPrime界面的最终输出是一个Excel文件，其中包含引物序列和参数属性，以及基于JBrowse的指向用户内部浏览器的超链接(23)，显示了备选转录本和引物位置(图5). 当前的GETPrime数据库基于Ensembl 61版。基于Ensembl 50版的GETPrime早期版本仍然可以通过相同的web界面访问。这两个版本之间的唯一区别是，在当前版本中，包含了新基因，并且每个引物对的超链接都由不同的浏览器类型支持。

在单独的窗口中打开

图5。

基于JBrowse的GETPrime引物对图形视图9卢比小鼠基因。左边的蓝色方框是可以在JBrowse基因组视图中拖动的可用轨迹(23). 在本例中，已将转录本、基因特异性引物（如果可能，覆盖大多数剪接变体）和转录特异性引子（如果可能的话，覆盖单个剪接变异体）拖到浏览器中。图的上部显示了缩放、向上或向下移动基因组位置以及输入另一条染色体、染色体上的另一个位置或集合ID的工具。每个引物都由其集合ID、其在GETPrime中的迭代（例如−1）、其排名（例如_3）进行注释及其引物类型（正向引物和反向引物分别缩写为Fwd和Rv）。每个引物的蓝色框表示与转录本的对应，有时两个蓝色框之间的细线用于桥接跨越两个外显子的引物的内含子区域。基因特异性轨道中的引物对覆盖两个转录本。转录物特异性轨道中第一次迭代（“−1”）和第二次迭代（”−2“）的引物对特定于最大的转录物Rbbp9-001和最短的成绩单Rbbp9-002分别是。

数据库验证和应用

实验验证了GETPrime产生的引物的敏感性和特异性。首先，作为对照实验，我们选择了三个常用的引物对，因此，这些引物对已经发表，每个引物对针对以下控制基因之一：Hprt1（小时）,免疫球蛋白4,管2c（请参见补充表S1用于序列）。只选择了与GETPrime生成的转录本完全相同的引物对。与成熟的引物对类似，所有三对GETPrime引物对都具有高质量，根据熔化曲线和凝胶分离分析显示出高特异性，并且对qPCR小鼠参考总RNA合成的cDNA具有良好的扩增效率（平均效率为103%R（右）²-值0.997，参见“材料和方法”一节）。此外，每对引物在前脂肪细胞3T3-L1细胞分化前和分化后诱导（“材料和方法”部分，D0、D2和D4）中产生的PCR产物数量是可比较的（ΔC类_问 < 1).

接下来，我们通过靶向同一小鼠参考总RNA合成的cDNA样品中的60个TF来评估GETPrime引物的质量（“材料和方法”部分）。我们选择TF是因为它们的表达水平通常低于非TF编码基因，因此通常更难检测(24,25)因此，与针对多个基因编码一组不同的蛋白质相比，这种验证分析更加严格。总共，在60对被测引物中，有45对引物具有较高的扩增效率（平均效率为98.94%R（右）²-值为0.994），并根据其相应的解离曲线确定其高度特异性。在剩下的15对引物中，发现其中一对形成了引物二聚体，这表明no模板和no逆转录酶阴性对照中存在明显的熔化曲线峰，和14只产生了一个低信号，可能是因为相应的靶基因在参考RNA和3T3-L1 RNA样品中的含量都很低(26)（“材料和方法”部分）。然而，我们能够为14对引物中的5对生成标准曲线，因为在我们的实验室中可以获得相应的TF开放阅读框（ORF）克隆。这些引物对的平均扩增效率为98.4%R（右）²-值为0.995。因此，我们能够测试的51对引物中，有50对符合qPCR可靠性标准，这表明GETPrime数据库中的绝大多数引物都是高质量的。

为了进一步评估引物特异性，我们设计了一个严格的GETPrime引物检测方法，该引物针对产生同源蛋白的TF ORF克隆库中的一个TF ORFs，这里是同源域或ZF-C2H2 TF（“材料和方法”部分和补充表S2). 对于每个选定的TF靶点，我们获得了清晰的qPCR扩增信号，与使用相同的TF ORF库作为qPCR模板，但不包含各自的靶点TF ORF时相比(补充图S1)，表明各自的引物对具有高度的靶向特异性。最后，为了评估GETPrime区分基因特异性转录物的能力，我们使用3T3-L1细胞分化前和分化后诱导，并选择了一个相对直接的剪接场景，其中包含一个基因，Ubtf公司根据Ensembl第50版，它有两种不同的转录形式Ubtf_a型和优步（_b），分别代表五种和两种不同的拼接形式(图6A） ●●●●。GETPrime引物能够在两个选定的分化时间点区分两种Ubtf剪接形式，并以定量方式进行区分，因为单个转录物总量与总基因表达量相匹配(图6B） ●●●●。

在单独的窗口中打开

图6。

要验证的图形视图和qPCR结果Ubtf公司-靶向引物覆盖Ubtf转录物的全部或子集。(A类)蓝色的“Ubtf”引物对覆盖所有七个转录物（基因特异性引物），红色的“Ubtf_a”和“Ubtf_b”引物对分别覆盖五个和两个转录物（转录物特异性引物）。在本例中，GETPrime无法找到区分每个转录本的引物。(B)分化前（D0）和分化后4天（D4）的相对基因表达水平标准化为Hprt1（小时）和管2c表达式级别。'Ubtf’代表涵盖所有七个转录物的引物对，而‘Ubtf_a’和‘Ubtf _b’分别是特定于五个和两个转录物子集的引物。’Ubtf_a+Ubtf_b'代表“Ubtf_a”和“Ubtf _b”的相对基因表达之和。数据表明，GETPrime能够有效区分不同的转录物，因为单个转录物数量的总和与总基因表达量相匹配。

讨论

实验结果证明了GETPrime产生基因或转录特异性qPCR引物的能力。结果还表明，所生成的引物质量较高，并且这些引物能够检测到低丰度转录物，例如TF编码的转录物。此外，它们还证明了其在编码高度同源蛋白质的模板池中特异识别目标的能力，以及高扩增效率。因此，据我们所知，没有其他软件和网络工具提供与GETPrime平台相同的属性集(表1)我们认为，GETPrime是qPCR引物设计领域的一个重要进展。另一个最近开发的qPCR引物设计软件QuantPrime(14)还具有基因特异性引物设计（即覆盖大多数剪接变体）作为选项。然而，该软件并没有提供直接的方法来确定哪些转录本被基因特异性引物覆盖。因此，用户有义务对Ensembl数据库中的每一个引物进行筛选，以找到这些信息，这非常耗时，尤其是在需要针对大量基因的情况下。此外，通常不可能产生涵盖所有基因转录本的引物。对于这些基因，需要使用多个引物对来产生基因特异性读数。与QuantTime相比，GETPrime数据库以易于检索和图形化的方式提供了所有这些信息。因此，虽然很明显QuantPrime是一个功能强大的引物设计程序，但由于它对于大规模qPCR引物设计具有很大的参数灵活性和用户友好的界面，它似乎没有使用先验的产生基因或转录特异性引物的目的。此外，我们发现QuantPrime处理时间随着基因长度和数量的增加而显著增加。GETPrime没有这个缺点，因为它的数据库接口允许直接检索引物。这与其他Primer数据库类似，如qPrimerDepot(19)，PrimerBank(27)和RTPrimerDB(17)，它还提供预先计算的qPCR引物。然而，这些数据库的局限性在于，它们不能批量检索引物，并且每个基因都会列出多个引物对。然后由个人用户来评估每个引物对的实验适用性，这与GETPrime不同，GETPrime根据定义明确的标准对所有引物进行排序，是很麻烦的。GETPrize的一个重要缺点是，到目前为止，它仅适用于包括人类在内的五种常用模型生物。然而，最终用户可以通过调整GETPrime Perl脚本来满足或甚至可以执行为其他感兴趣的生物体设计引物的需求，GETPrime Perl脚本可应要求提供。因此，GETPrime数据库目前包括以下引物智人,小M,秀丽线虫,D.黑腹果蝇和斑马鱼Ensembl数据库第50版和第61版中注释的组装染色体中的基因。因此，我们计划在主要的新Ensembl发布后立即更新GETPrime。

材料和方法

补充数据

补充数据可在数据库在线。

基金

瑞士国家科学基金会；SystemsX.ch；NCCR计划遗传学前沿；第七研究框架计划玛丽·居里国际重返社会补助金（至B.D.）；洛桑理工学院（EPFL）的机构支持。开放获取费用的资金来源：洛桑理工学院（EPFL）。

利益冲突。未声明。

致谢

工具书类