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基因发育。1998年12月1日；12(23): 3675–3685.
数字对象标识：10.1101/gad.12.23.3675
预防性维修识别码：PMC317252型
PMID：9851974

构成性活性表皮生长因子受体与G1细胞周期阻滞途径诱导小鼠胶质瘤样病变

埃里克·C·霍兰德，1,三 温迪·希夫利，1 罗纳德·德皮尼奥，2和哈罗德·瓦尔姆斯1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

表皮生长因子受体(表皮生长因子受体)该基因在30%–50%的人类多形性胶质瘤（GBM）中扩增或突变。这些突变通常与INK4a–ARF公司基因座，编码两种基因产物（p16INK4a公司和p19农业研究基金)参与细胞周期阻滞和凋亡。我们已经调查了表皮生长因子受体利用禽逆转录病毒载体转移突变体在胶质瘤发生中的突变表皮生长因子受体表达胶质前体和星形胶质细胞基因的转基因小鼠电视-a，一种编码逆转录病毒受体的基因。TVA，在脑细胞类型特异性启动子的控制下。我们证明，胶质细胞谱系细胞中组成活性、突变形式的EGFR的表达可以诱导与人类胶质瘤有许多相似之处的损伤。将基因转移到表达电视-a从祖细胞特异性nestin启动子到表达电视-a来自星形胶质细胞特异性胶质纤维酸性蛋白(GFAP公司)启动子，提示胶质细胞谱系中的未成熟细胞更容易发生肿瘤。此外，表皮生长因子受体-诱导的胶质瘤发生似乎需要编码参与细胞周期阻滞途径的蛋白质的基因发生额外突变。我们通过同时感染电视-a携带载体的转基因小鼠cdk4型和表皮生长因子受体或者通过感染电视-a转基因小鼠携带一种被破坏的INK4a–ARF公司轨迹与表皮生长因子受体-只携带矢量。此外，表皮生长因子受体-诱导胶质瘤发生并不与第53页缺乏，除非小鼠也感染了携带cdk4型小鼠所需的遗传损伤的胶质瘤基因组合与人类胶质瘤相似。

关键词：表皮生长因子受体、胶质瘤生成、细胞周期阻滞

胶质瘤是原发性脑肿瘤中最常见的形式，分为四个临床等级(Kleihues等人，1993年). 最具侵袭性的肿瘤是4级，也称为多形性胶质母细胞瘤（GBM(von Deimling等人，1993年). 某些突变和其他特性与这两种致病途径中的一种或另一种高度相关。首次被检测为4级肿瘤的胶质瘤通常缺乏完整的INK4a–ARF公司抑癌基因座(Schmidt等人，1994年;He等人，1995年;Ichimura等人，1996年); 因此，他们无法实现这两个目标INK4a–ARF基因产物，p16INK4a公司和第19页农业研究基金通过G中不同的途径阻止细胞周期1在两个G中1和G2，分别（图。​（图1；1;Serrano等人，1993年;Quelle等人，1995年). 此外，这些肿瘤经常发生在老年患者身上，包括基因突变或扩增表皮生长因子受体基因，倾向于更具攻击性，通常是二倍体(Louis等人，1993年;He等人，1994年;Schlegel等人，1994年;Ono等人，1996年;Hayashi等人，1997年). 相反，从低度病变向高级病变进展的胶质瘤通常为野生型INK4a–ARF公司，但有一个放大的川东北4轨迹或已丢失卢比基因，并经常显示p53功能丧失或p53基因扩增平方米因此，在这两种类型的肿瘤中，相同的两个细胞周期阻滞途径被不同的突变破坏（图。​（图1）。1). 此外，保留野生型的肿瘤INK4a–ARF公司基因出现较早，攻击性较小，通常是非整倍体(Lang等人，1994年;Rasheed等人，1994年;van Meyel等人，1994年;Watanabe等人，1996).

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建议的角色INK4a–ARF公司细胞周期阻滞和人类胶质瘤发生。(一个)细胞周期阻滞途径涉及INK4a–ARF公司基因产物p16墨水4a和第19页农业研究基金. (B类)将人脑胶质瘤细分为INK4a–ARF公司和野生型INK4a–ARF公司基因座。提示与这两个肿瘤群体密切相关的其他基因突变。有突变的胶质瘤INK4a–ARF公司更常见，并与表皮生长因子受体基因，而INK4a–ARF公司野生型胶质瘤破坏G1下游的拦截路径INK4a–ARF公司基因产品。

我们之前设计了一个体内胶质特异性基因转移系统，该系统允许我们研究单个突变和突变组合对小鼠胶质瘤发生的影响(Holland and Varmus 1998年). 该系统利用了来自禽逆转录病毒、ALV亚群A和转基因小鼠系的具有复制能力的ALV剪接受体（RCAS）病毒载体(Gtv-a型)从编码胶质纤维酸性蛋白基因的星形胶质细胞特异性启动子中产生ALV-A受体TVA(GFAP公司). 星形胶质细胞来自Gtv-a型无论在体内还是体外，小鼠都容易受到RCAS载体的感染和基因转移。我们以前使用过这个系统来证明GFAP感染+携带碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）编码序列的RCAS细胞会导致胶质细胞增殖，长距离迁移，并在不形成肿瘤的情况下同化到正常的大脑结构中(Holland and Varmus 1998年). 在本研究中，我们描述了第二个转基因小鼠系(Ntv-a型)，表示电视-a来自巢穴启动子，在胶质细胞谱系的早期细胞中活跃。我们还描述了RCAS载体的构建和使用，该载体可转移编码组成活性形式EGFR（RCAS–表皮生长因子受体*)至电视-a+细胞。利用这些和其他工具，我们将基因转移的效果与Ntv-a型小鼠（可能是胶质祖细胞）和Gtv-a型小鼠（可能是终末分化的星形胶质细胞），并询问EGFR*是否单独或与人类胶质瘤中观察到的其他遗传损伤结合，可以启动胶质瘤发生。

我们在这里显示表皮生长因子受体*将基因导入其中之一Gtv-a型或Ntv-a型转基因动物在缺乏INK4a–ARF公司，但在野生型转基因小鼠中没有INK4a–ARF公司轨迹。感染后胶质瘤发生的频率较高Ntv-a型老鼠比Gtv-a型小鼠，这与胶质细胞谱系早期的细胞可能比最终分化的星形胶质细胞更容易发生转化的可能性一致。之间的合作表皮生长因子受体*和INK4a–ARF公司缺陷似乎是特定的，因为表皮生长因子受体*至第53页+/−小鼠不会导致胶质瘤改变。与RCAS共同感染–cdk4型和RCAS-表皮生长因子受体*诱导野生型小鼠损伤INK4a–ARF公司和第53页频率较低的位点。然而，这种联合作用在第53页-杂合子小鼠比野生型小鼠，这意味着cdk4型过度表达和第53页该模型系统中的缺陷也与人类肿瘤中的缺陷相似。

结果

Ntv-a转基因小鼠的构建

中间丝蛋白nestin在胚胎发育期间在中枢神经系统（CNS）祖细胞和出生后在胶质祖细胞中表达(Tohyama等人，1992年). A转基因（NES 1689/lacZ公司)，其中lacZ公司表达式受巢蛋白启动子，在整个发育中的中枢神经系统的神经胶质和神经元祖细胞中产生β-半乳糖苷酶(Lothian和Lendhal 1997年). 我们已经构建了一个巢穴–tv-a转基因(Ntv-a型)通过替换lacZ公司NES 1689中的基因/lacZ公司800-bp鹌鹑cDNA编码TVA的糖基磷脂酰肌醇连接形式（图。​（图2A；2A；Bates等人，1993年;亨特1997).Ntv-a型设计用于在胶质祖细胞中表达，并允许使用RCAS载体将基因转移到该细胞群。相比之下，原始Gtv-a型转基因系允许基因主要转移到末端和近末端分化的星形胶质细胞(Holland and Varmus 1998年).

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电视-a转基因和RCAS载体。(一个)表达ALV A亚群受体TVA的转基因。星形细胞特异性Gtv-a型转基因已在前面描述过(Holland and Varmus 1998年). 这个Ntv-a型转基因利用了一种改良的巢穴启动子包括其第二内含子的一部分和胸苷激酶启动子序列，这些序列已被证明直接表达到中枢神经系统祖细胞(洛锡安和伦达尔1997). 转录起始位点用箭头表示。(B类)携带外源基因3′的RCAS载体环境价值RCAS–表皮生长因子受体*表达一种组成性活跃的突变型人类表皮生长因子受体(顶部)如图所示，细胞内外序列缺失(TM（TM）). 跨膜结构域的区域编码；（δ） EGFR胞外结构域编码区中缺失形成的新连接的位置。RCAS–AP公司、RCAS–碱性成纤维细胞生长因子和加拿大皇家骑警协会cdk4型携带人胎盘碱性磷酸酶cDNA，小鼠碱性成纤维细胞生长因子cDNA和人类cdk4型cDNA。尽管这些载体仅在鸟类细胞中复制，但如图所示，外源基因通过剪接信息在鸟类和哺乳动物细胞中表达。

三条独立线路Ntv-a型老鼠传播Ntv-a型以简单孟德尔遗传模式转基因，可感染RCAS载体。为了证明适当的基因转移，我们同时感染了Gtv-a型和Ntv-a型出生时患有RCAS的小鼠AP公司它携带一个编码组织学标志物碱性磷酸酶（AP）的基因（图。​（图2B）。2B） ●●●●。新生儿感染后三周Ntv-a型小鼠，AP+针孔周围有细胞。AP的形态+细胞与RCAS的细胞相似–AP公司感染Gtv-a型老鼠(Holland and Varmus 1998年; 图。​图4，4，如下所示；数据未显示）。这是意料之中的，因为有丝分裂活跃的巢蛋白+出生时的细胞群主要产生星形胶质细胞和少突胶质细胞。尽管nestin在神经前体细胞中以胚胎形式表达，但其中大多数是出生后有丝分裂的(雅各布森1991)当发生RCAS载体感染和禽逆转录病毒感染时，需要进行一轮细胞分裂。与这些特征一致，我们没有检测到AP+神经元Ntv-a型感染RCAS的小鼠AP公司出生时。

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脑内感染Ntv-a型RCAS小鼠AP公司和RCAS–表皮生长因子受体*. (一个)同时转移AP公司和表皮生长因子受体*基因到Ntv-a型体内星形胶质细胞。新生儿Ntv-a型将DF-1细胞产生RCAS的混合物注射到小鼠右额叶AP公司或RCAS–表皮生长因子受体*8周龄时处死。对连续的脑切片（冷冻，40μm）进行AP活性染色，并用抗巢蛋白(A、 C类)或抗EGFR*抗体(B、 天).一个和B类包括用于引入产生细胞的注射轨迹（箭头）；C类和D类表示侧脑室（LV）的边缘。AP附近具有巢蛋白和EGFR*星形细胞形态染色的细胞+细胞。

用于表达组成活性EGF受体突变体的载体RCAS–EGFR*的开发和表征

胶质瘤中EGFR激酶活性的增加与表皮生长因子受体基因和导致构成活性基因产物的三类一般突变。最常见的突变（vIII）删除了EGFR的部分胞外结构域，导致受体在缺乏配体的情况下通过其蛋白酪氨酸激酶活性发出信号(Wong等人，1992年;Ekstrand等人，1994年). 第二次缺失移除细胞内激酶调节域。第三组等位基因有两种缺失(Ekstrand等人，1992年). 由于将病毒RNA基因组有效包装到RCAS载体需要2.6 kb或更少的插入物，我们构建了一个携带最短（双删除，表皮生长因子受体*)的形式表皮生长因子受体cDNA（图。​（图2B）。2B） ●●●●。使用细胞外缺失产生的连接肽特异性单克隆抗体，我们用Western blot方法证明鸡成纤维细胞系DF-1感染RCAS–表皮生长因子受体*生成了EGFR的缩写形式（图。​（图3A），三A） 重复传代后，感染细胞出现形态改变（数据未显示）。感染RCAS的DF-1细胞的抗-EGFR*免疫染色表皮生长因子受体*证明了表皮生长因子受体*可以在与质膜位置一致的分布中特异地检测到（图。​（图3B）。三B） ●●●●。我们还确认表皮生长因子受体*由Gtv-a型感染RCAS的转基因星形胶质细胞表皮生长因子受体*体外可通过免疫组织化学进行特异性检测（图。​（图3C）。三C） ●●●●。

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携带激活EGFR基因的RCAS载体（RCAS–表皮生长因子受体*)。(一个)感染并产生RCAS的鸡细胞系DF-1提取物的免疫沉淀和蛋白质印迹分析表皮生长因子受体* (重新)或RCAS–AP公司(无线电高度表). 检测到一条带在糖基化蛋白的预期位置迁移，其序列由EGRF公司*cDNA（分子量～90 kD）。(HC公司)免疫球蛋白重链的位置。DF-1细胞中EGFR*特异性抗体的免疫化学染色(B类)或Gtv-a型星形胶质细胞(C类)感染RCAS–AP公司(无线电高度表)或RCAS–表皮生长因子受体* (重新).

EGFR*体内基因转移

为了演示转移表皮生长因子受体*在体内，我们将DF-1细胞的混合物注入胶质细胞，产生RCAS–AP公司和RCAS–表皮生长因子受体*进入新生儿额叶Ntv-a型老鼠。八周后，针孔附近的细胞AP活性染色阳性，并带有EGFR*和巢蛋白抗体（图。​（图4A、B）。4A、 B）。nestin和EGFR*阳性细胞类似于成熟的星形胶质细胞，细胞核小，突起长。偶尔在心室附近检测到此类细胞（图。​（图4C、D），4C、 D），可能是脑脊液感染所致。这些巢穴-和表皮生长因子受体*-表达细胞Ntv-a型;INK4a–ARF公司+/+苏木精-伊红（H&E）染色显示，五只小鼠的组织学表现正常。如表所示​表1，121例H&E染色未见结构异常Gtv-a型和24Ntv-a型感染RCAS混合物的小鼠AP公司和RCAS–表皮生长因子受体*. 感染这些载体的非转基因同卵双胞胎针孔或心室附近的细胞没有AP、nestin或表皮生长因子受体*（数据未显示）如早期调查结果所预期(Holland and Varmus 1998年).

表1

RCAS载体诱导胶质瘤电视-a转基因小鼠

电视-a转基因
RCAS载体导入的基因一
遗传背景b
表皮生长因子受体*
cdk4型
碱性成纤维细胞生长因子
野生型
INK4a公司+/−
INK4a公司−/−
第53页+/负极
Gtv-a型+−−0/211/172/6
Ntv-a型+−−0/2413/258/190/16
Ntv-a型++−1/85/194/103/8
Ntv-a型+++3/294/76/1617/39

通过冰冻脑切片的组织学检查或脑积水的临床表现来测量胶质瘤的形成，将其制成表格Gtv-a型和Ntv-a型四种不同基因背景的转基因小鼠与抑癌基因的关系INK4a–ARF公司和p53，携带指示基因的RCAS载体感染新生儿后。 

一表皮生长因子受体*（RCAS–表皮生长因子受体*);cdk4型（RCAS–cdk4型);碱性成纤维细胞生长因子（RCAS–碱性成纤维细胞生长因子). RCAS感染诱发的肿瘤表皮生长因子受体*通过固定冰冻切片的组织学分析，仅在8-10周时进行评分。感染RCAS组合的小鼠表皮生长因子受体*和RCAS–cdk4型在>15只小鼠中确定早期脑积水与胶质瘤的组织学特征高度相关后，对3至8周龄的脑积水进行评分。 
b墨水4a+/−和INK4a公司−/−是杂合子和纯合子的INK4a–ARF公司抑癌基因座；和第53页+/−对于靶向缺失第53页抑癌基因。 

EGFR*基因转移诱导INK4a–ARF缺陷小鼠出现胶质瘤特征

否则正常电视-a感染RCAS的转基因小鼠表皮生长因子受体*没有出现胶质瘤特有的组织学改变。相反，电视-a携带靶向缺失的转基因小鼠INK4a–ARF公司RCAS感染后经常出现的位点胶质瘤样病变表皮生长因子受体*. 这些病变的性质各不相同，但在人脑胶质瘤中也观察到一些特征：（1）H&E染色后组织学上观察到的结构异常（正常结构因细胞团或脑积水而变形）；（2） 细胞密度增加；（3） EGFR突变型表达的免疫阳性；（4）GFAP（识别星形细胞特征）和nestin（指示更原始的表达模式）的免疫阳性。在本研究中，如果病变显示所有四个特征，则将其定义为胶质瘤。

大脑海马区的一个损伤Ntv-a型感染RCAS的小鼠AP公司和RCAS–表皮生长因子受体*如图所示​图55（A–C）。该病变显示细胞密度增加，EGFR*和GFAP免疫组化染色，血管和肿瘤细胞增加，血管周围距离肿瘤块较远表皮生长因子受体*基因转移到Gtv-a型突变的小鼠纯合子INK4a–ARF公司等位基因（图。​（图5D–I）5D–I）显示有既往出血、血管和细胞密度增加以及邻近正常组织浸润的迹象。这个病变足够大，可以获得许多切片，用于其他基因产物的免疫组织化学染色。类似于高级人脑胶质瘤的报道(Takahashi等人，1990年;Plate等人，1994年)，受累区域的细胞过度表达内源性bFGF和血管内皮生长因子（VEGF）。包括该病变的细胞也用GFAP和巢蛋白抗体染色，表明是未成熟的星形细胞类型。

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表皮生长因子受体*-诱发损伤INK4a–ARF公司+/−和INK4a–ARF公司−/−老鼠。(A–C)注射RCAS八周后——AP公司和RCAS–表皮生长因子受体*，来自Ntv-a型;墨水4+/−小鼠切片（冷冻，40μm），AP活性染色，然后用H&E染色(一个)或识别EGFR*的单克隆抗体(B类)或GFAP(C类)，如图所示。(A–C)放大倍率，40×。这个位于海马体的肿瘤是AP的混合物+和AP−表达EGFR*和GFAP的细胞，表明其来源于星形细胞。(D–I型)10周龄婴儿的脑部切片Gtv-a型;INK4a–ARF公司−/−感染RCAS的小鼠表皮生长因子受体*. 大脑被固定，冰冻切片（40μm）用H&E染色，显示高细胞密度和先前出血(G公司)或用EGFR*多克隆抗体染色(D类)、GFAP(电子)，嵌套(F类)，碱性成纤维细胞生长因子(H（H）)或VEGF(我). 放大倍数，40倍(A–C); 100× (D–I型).

另一个组织病理学特征在Gtv-a；INK4a–ARF公司+/−感染RCAS的小鼠AP公司和加拿大皇家骑警——表皮生长因子受体*（图。​（图6）。6). 这只小鼠在6周龄时出现脑积水（临床上可识别为巨头、嗜睡和脱水），并被处死。病变由EGFR*和GFAP阳性细胞组成，扩散到脑干和丘脑，导致这些区域的细胞密度增加。具有类似病变的脑实质内出血区域邻近EGFR*和巢蛋白染色的星形细胞，但通常没有明显的肿瘤肿块（数据未显示）。

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弥漫性丘脑胶质瘤伴脑积水。冷冻脑切片（40μm）Gtv-a型;INK4a–ARF公司+/−出生时感染两种RCAS的小鼠AP公司和RCAS–表皮生长因子受体*6周龄脑积水发生后进行分析。大脑切片进行碱性磷酸酶活性染色，然后用H&E染色(一个)或EGFR*单克隆抗体(B类). (C类)H&E部分放大倍数更高一个并将其与未发生脑积水的受感染室友的同一解剖区域进行比较(D类). 放大倍数，40倍(A、 B类); 100× (C、 D类).

EGFR*诱导的胶质瘤发生需要破坏细胞周期阻滞通路，并且在感染Ntv-a后发生的频率高于Gtv-a小鼠

如前所述，我们在RCAS后未发现任何胶质瘤–表皮生长因子受体*感染Gtv-a型或Ntv-a型野生型转基因小鼠INK4a–ARF公司轨迹。17岁感染后仅观察到一个胶质瘤Gtv-a型转基因；INK4a–ARF公司+/−RCAS小鼠表皮生长因子受体*在感染6只小鼠后，2只小鼠发生了胶质瘤Gtv-a；INK4a–ARF公司−/−鼠标（见表​表1）。1). 胶质瘤在Ntv-a；INK4a–ARF-杂合子和未合子动物（分别为25只中的13只和19只中的8只）。此外，感染Ntv-a型和Gtv-a型RCAS–AP小鼠表明，这两种小鼠系的病毒摄取和表达效率相似（数据未显示）。这些结果表明了两个重要结论：（1）产生胶质瘤的细胞诱导胶质瘤发生表皮生长因子受体*需要额外的基因损伤，例如p16缺乏INK4a公司，第19页农业研究基金或两者兼而有之；（2）当表皮生长因子受体*被引入Ntv-a型小鼠，可能在胶质细胞谱系的相对早期进入细胞。第二个结论可能意味着胶质前体细胞通常更容易发生恶性转化，或者两者之间的特定相互作用表皮生长因子受体信号和G1细胞周期阻滞在胶质细胞谱系早期的细胞中更有效。

表中总结的数据​表11建议INK4a–ARF公司+/−小鼠对RCAS同样敏感–表皮生长因子受体*-诱导胶质瘤INK4a–ARF公司−/−老鼠。对此最明显的解释是INK4a–ARF公司肿瘤中的等位基因INK4a–ARF公司+/ −小鼠被高频率灭活或单倍体不足INK4a–ARF公司该位点足以形成胶质瘤。我们试图证明p16的丢失INK4a公司抗p16单克隆抗体在组织化学分析中的表达；不幸的是，我们发现p16的水平INK4a公司在正常成年小鼠大脑检测水平以下。因此，我们无法衡量表达的缺失。胶质瘤的小体积和弥漫性使大多数杂合子小鼠的肿瘤无法从正常组织中剥离INK4a–ARF在一个大到可以解剖的样本中，PCR分析显示杂合子保持不变INK4a–ARF公司肿瘤组织中的基因型（数据未显示）。这个单一的发现很难解释，但可能表明肿瘤组织受到正常细胞的污染，或者剩余的野生型等位基因以其他方式失活，例如甲基化。

bFGF基因转移不会增强EGFR*诱导的胶质瘤形成

bFGF在大多数高级胶质瘤中过度表达(Takahashi等人1990)，我们之前已经展示了RCAS–碱性成纤维细胞生长因子诱导星形胶质细胞增殖和迁移Gtv-a型老鼠(Holland and Varmus 1998年). 增加RCAS–碱性成纤维细胞生长因子RCAS组合–表皮生长因子受体*和RCAS–cdk4型感染Ntv-a型在所测试的任何遗传背景中，小鼠都没有明显改变病变类型或症状出现的年龄（表​（表1；1; 数据未显示）。这一发现的一个解释是碱性成纤维细胞生长因子可能在继发于表皮生长因子受体*基因表达，如图。​图4。4.如果碱性成纤维细胞生长因子表达对小鼠的胶质瘤生成至关重要，其诱导似乎不是速率限制，因为添加了病毒转导的碱性成纤维细胞生长因子似乎不影响胶质瘤的形成。

CDK4过度表达可以与EGFR*协同作用，并且是EGFR*诱导的p53胶质瘤发生所必需的+/− 老鼠

在人类胶质瘤中表皮生长因子受体基因在缺乏INK4a–ARF公司（因此无法生成p16INK4a公司或p19农业研究基金)而非肿瘤异常cdk4型或卢比(Hayashi等人1997). 此外，表皮生长因子受体和第53页这些肿瘤中的突变似乎是相互排斥的(Watanabe等人，1996年). 这些观察结果与最近的数据一致，表明第19页农业研究基金和第53页突变在小鼠成纤维细胞培养中似乎是互斥的(Kamijo等人，1997年)以及RAS诱导的INK4a–ARF-缺陷型黑色素瘤持续野生型第53页(Chin等人，1997年). 脑胶质瘤川东北4基因最常见的港湾第53页突变，意味着这两种基因改变对胶质瘤发生的影响之间的协同作用。对这些发现的一种解释可能是川东北4放大和第53页损失（或平方米扩增）使Rb和p53细胞周期阻滞途径失活，类似于INK4a–ARF公司损失（见图。​图1），1)这两条通路的失活强烈促进了胶质瘤的发生（见讨论）。

在人类胶质瘤中，表皮生长因子受体和第53页很少在同一肿瘤中发现突变，这意味着这两种异常的影响之间缺乏合作。为了研究表皮生长因子受体突变和第53页失去了我们的模型，我们感染了Ntv-a；第53页+/−RCAS小鼠表皮生长因子受体*. 16例患者未出现胶质瘤样病变或其他颅内结构异常第53页+/−;Ntv-a型感染RCAS的小鼠-表皮生长因子受体*.

多个基因可以转移到特定的细胞类型电视-a转基因小鼠。因此，我们使用了RCAS向量的混合物（RCAS–cdk4型和RCAS–表皮生长因子受体*或RCAS–cdk4型，RCAS–表皮生长因子受体*和RCAS–碱性成纤维细胞生长因子)感染电视-a转基因小鼠，包括携带肿瘤抑制基因突变的小鼠。如上所述，RCAS–表皮生长因子受体*单独使用不能在野生型小鼠中生成胶质瘤；然而，RCAS的加入——cdk4型至RCAS–表皮生长因子受体*约10%的患者出现脑积水Ntv-a型具有野生型遗传背景的小鼠。我们检查了两个来自Ntv-a型感染RCAS的小鼠cdk4型和RCAS–表皮生长因子受体*发现弥漫性胶质瘤的组织学特征。这些胶质瘤可能依赖于过度刺激的协同效应表皮生长因子受体G的信号和中断1过表达川东北4然而，我们没有确定p53、Mdm2和p16的状态农业研究基金在这些肿瘤中。

引人注目的是，尽管RCAS–表皮生长因子受体*单独导致Ntv-a；第53页+/−小鼠，添加RCAS–cdk4型至RCAS–表皮生长因子受体*40%的婴儿在出生后3-5周内死于脑积水第53页杂合小鼠。在脑积水小鼠的大脑中，脑脊液（CSF）经常是带血的，并与硬膜下血肿、实质内出血、血管增殖、细胞密度增加和胶质细胞改变有关（图。​（图7）。7). 还观察到脑室周围胶质细胞增生，星形细胞表达GFAP公司，巢穴、和表皮生长因子受体*弥漫性浸润丘脑和纹状体。因此，在我们的小鼠模型中川东北4似乎需要通过以下途径有效诱导或进展胶质瘤表皮生长因子受体*在第53页-缺陷小鼠。虽然胶质瘤很可能发生在第53页+/−老鼠失去了剩下的野生型第53页等位基因，类似于其他肿瘤模型的报道第53页+/−老鼠(Donehower 1995年)，由于肿瘤的弥漫性和正常细胞的严重污染，我们无法确定第53页通过PCR或Southern blot分析发现这些病变的位点。

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多基因突变引起的脑损伤特征。(A–D)RCAS后的显微镜检查结果表皮生长因子受体*和RCAS–cdk4型感染Ntv-a；INK4a–ARF公司−/−老鼠。(一个)相对于邻近脑实质，细胞密度和血管增加（40×）。(B类)血管内皮过度增殖（100×）。(C类)整个皮层的实质内出血（40×）。(D类)多核细胞（箭头）和核多形性（200×）。(A–D)石蜡嵌入部分用H&E染色(A、 D类)同一只小鼠在5周龄时处死；(B、 C类)分别在第4周和第5周处死另外两只小鼠。(电子)两例脑积水的临床表现Ntv-a型出生时感染RCAS载体的小鼠。白老鼠是Ntv-a；第53页+/−，感染RCAS–cdk4型、RCAS–碱性成纤维细胞生长因子和RCAS–表皮生长因子受体*4周龄时拍摄；棕色的老鼠Ntv-a型;INK4a–ARF−/−，感染RCAS–碱性成纤维细胞生长因子和RCAS–表皮生长因子受体*10周大时拍摄。

讨论

我们已经建立了一个胶质瘤发生的动物模型，该模型概括了在人类胶质瘤中发现的遗传异常。该模型产生的病变具有许多与人脑胶质瘤相似的特征，包括胶质标记物的表达和血管生成生长因子（如bFGF和VEGF）的诱导。人类胶质瘤具有许多组织学特征；我们在我们的小鼠模型中发现了许多这些组织学特征。

到目前为止，我们产生的所有肿瘤都需要EGFR激活形式（EGFR*）的表达，以及影响细胞周期调节的病变组合。EGFR*诱导胶质瘤与川东北4只是偶尔，然而INK4a–ARF公司缺失消除了Rb和p53介导的细胞周期阻滞途径，与EGFR*在胶质瘤发生中有效合作。此外，EGFR*似乎不能在第53页-背景不足，除非CDK4也生产过剩。这些突变模式，特别是EGFR*和INK4a–ARF公司缺乏和EGFR*单独刺激胶质瘤发生的明显无能第53页-人脑胶质瘤中的缺陷胶束重组。

用RCAS载体感染tv-a转基因小鼠作为人类肿瘤模型的建立方法

有多种方法可以模拟突变组合对肿瘤发生的贡献。与先前报道的策略相比，使用RCAS载体的细胞型特异性基因转移具有许多优势。首先，利用转基因小鼠系表达电视-a在特定的细胞类型中，可以通过使用易于构建或先前存在的病毒载体来测试基因组合。因此，测试复杂的遗传损伤组合所需的成本和时间明显少于每一个遗传改变都需要一个单独的小鼠系的策略，并且需要多次交配来观察突变之间的相互作用（例如。，Kwan等人，1992年;Donehower 1995年). 这个电视-a该系统还可以结合获得功能（通过感染携带致癌基因的RCAS载体）和失去抑癌基因功能，或者如本文所示，通过培育目标生殖系缺失的小鼠，或者在未来通过删除包含以下基因的等位基因液氧感染携带RCAS载体的重组位点cre公司，编码液氧-特异性重组酶。其次，经典的转基因策略利用转基因启动子在所有细胞中表达癌基因。从这样的人群中产生肿瘤的细胞获得了进一步的（通常未知的）突变，从而导致肿瘤的形成。相反，当注射到大脑中时，RCAS载体只感染注射轨迹附近的几百个细胞(Holland和Varmus 1998年). 因此，任何观察到的表型都更有可能是转移基因的直接影响，因为相对较少的细胞最初会面临二次突变的风险。最后，逆转录病毒插入突变已被用于识别与致癌转基因（例如。，van Lohuizen等人，1991年;Shackleford等人，1993年). 这种策略可以检测到新的基因，但它很可能识别出导致细胞种群增长最快的组合。相反，由于最初被RCAS载体感染的细胞数量有限电视-a该系统将主要提供关于RCAS载体携带的已知基因的信息，但它可以用于评估弱致癌组合。

胶质瘤发生需要多种突变

突变组合似乎对小鼠胶质瘤的诱导至关重要，因为在我们的研究中，单个突变无法产生任何可测量频率的胶质瘤。我们之前已经表明碱性成纤维细胞生长因子(Holland and Varmus 1998年)也不是川东北4仅基因转移(Holland等人，1998年)导致小鼠脑胶质瘤形成，以及第53页-缺乏基因的小鼠还没有发生胶质瘤的报道(Donehower等人，1992年). 在本报告中，我们表明表皮生长因子受体*单靠基因转移也不能诱导胶质瘤发生。此外，INK4a–ARF公司-缺陷小鼠发育正常，无胶质瘤形成(Serrano等人，1996年); 因此，两个p16都丢失了INK4a公司和第19页农业研究基金似乎也不足以诱导胶质瘤发生。

与其他人的经验类似INK4a–ARF公司-人类胶质瘤缺陷(Louis等人，1993年;Lang等人，1994年;Rasheed等人，1994年;Schlegel等人，1994年;He等人，1995年;Hayashi等人，1997年)，我们发现INK4a–ARF和突变体的表达表皮生长因子受体在胶质瘤发生过程中。在我们的研究中，发生EGFR*诱导的胶质瘤的小鼠百分比与INK4a–ARF公司+/−和INK4a–ARF公司−/−遗传背景。我们无法确定肿瘤是否发生在INK4a–ARF公司+/−小鼠保持了功能性INK4a–ARF公司等位基因。也有可能是INK4a–ARF公司该基因允许EGFR*在这些小鼠中诱导胶质瘤，或者致瘤细胞在生理或功能上是无合子的。在一个已发表的120例人脑胶质母细胞瘤系列中，38%的肿瘤表现为两个拷贝的缺失INK4a–ARF公司而33%的人保持了一个野生型等位基因INK4a–ARF公司此外，本系列中大多数胶质瘤的半合子缺失INK4a–ARF公司其余没有突变INK4a–ARF公司等位基因(Ichimura等人，1996年). 甲基化INK4a–ARF公司人脑胶质瘤中的基因座是p16缺失的一种可能机制INK4a公司脑胶质瘤中半合子缺失的蛋白质生成INK4a–ARF公司，尽管在这一系列的大多数肿瘤中，没有证据表明其余肿瘤的甲基化或突变INK4a–ARF公司轨迹(Schmidt等人，1994年).

INK4a–ARF公司成人中约30%–50%的胶质瘤似乎正常。这些胶质瘤通常含有第53页突变和显示表皮生长因子受体很少发生突变；当他们达到4年级时，他们经常过度表达cdk4型否则就会失败卢比(von Deimling等人，1993年). 在Holland等人（1998），我们展示了川东北4-永生化星形胶质细胞培养有时获得第53页突变。虽然第53页突变不是逃避衰老或破坏基因组稳定性所必需的，我们将这种现象归因于高水平表达CDK4的各种后果，它们可能会增强生长潜力。细胞培养中的这些观察进一步证明川东北4和损失第53页在体内或体外，可能以某种方式协同实现星形胶质细胞的更快增殖。

我们的数据表明，RCAS–表皮生长因子受体*可以有效诱导胶质瘤样改变INK4a–ARF公司−/−动物或携带不活跃物的动物第53页基因并与RCAS复合感染cdk4型这些结果与以下观点一致：INK4a–ARF公司控制RB和p53通路，这两条通路的失活对于有效的EGFR*诱导的胶质瘤发生至关重要。从这个意义上讲，EGFR*促进胶质瘤生成的突变类似于SV40 T抗原的作用，已知SV40 T通过破坏p53和RB功能来实现其致癌作用(范宁1992).

在随附的论文中，我们表明INK4a–ARF公司或过度表达川东北4可导致培养的星形胶质细胞永生化(Holland等人，1998年). 显然，必须对体内增殖有额外的限制，以防止G细胞失活1阻止异常增殖的途径，如RCAS感染cdk4型n或INK4a–ARF公司−/−基因型足以诱发胶质瘤。在这项研究中，我们发现如果细胞具有异常G1阻滞通路也表达一种组成性活性EGFR，它们能够逃避这些明显的限制。许多信号通路在EGFR下游发挥作用，其中一些涉及通过G1细胞周期的阶段。然而，目前尚不清楚哪些途径参与胶质瘤发生，以及它们如何与G的失活协同作用1逮捕机制。

以前的工作表明，尽管碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子在大多数高级人脑胶质瘤中过度表达，这些基因没有突变或扩增。这些发现被解释为表明这些基因的活性增强是继发于肿瘤的发生和发展。小鼠胶质瘤如图所示​图55由RCAS感染引发–表皮生长因子受体*同时也产生高水平的内源性bFGF和VEGF。这些发现表明，bFGF和VEGF的过度表达可以被诱导为二级表达，并支持了这样一种观点，即人脑胶质瘤中生长因子的调节可以根据其他基因改变进行调节。例如，Ras的一种活性形式，一种也被EGFR激活的信号蛋白，已被证明可以增强胶质细胞培养中VEGF的表达(Okata等人，1998年).

到目前为止，我们的胶质瘤发生基因转移模型反映了人类胶质瘤中的突变模式，因此，它为理解胶质瘤发生的分子基础提供了一个有用的工具。利用胶质瘤形成作为一种检测手段，可以确定EGFR下游信号通路或与G相关的致瘤成分1逮捕。这些成分可能被证明是适合针对人类胶质瘤进行干预的靶点。

材料和方法

构造

这个Gtv-a型转基因（GFAP启动子2.2kb片段驱动鹌鹑的表达电视-a小鼠鱼精蛋白基因cDNA及其片段(MP-1型)为聚腺苷化提供内含子和信号），RCAS–AP公司、RCAS–碱性成纤维细胞生长因子和RCAS–cdk4型已被描述(Holland and Varmus 1998年;Holland等人，1998年). RCAS–[希神]普洛由Steve Hughes（国家癌症研究所）提供。这个Ntv-a型转基因利用了一种改良的巢穴启动子，包括其第二内含子和胸苷激酶启动子序列的部分，这些序列已被证明直接表达到中枢神经系统祖细胞；多聚腺苷化序列由SV40 DNA提供。该转基因由不是NES 1689/lacZ的I消化(Lothian和Lendhal 1997年)以释放lacZ公司基因，然后用DNA聚合酶的Klenow片段孵育并连接到电视-apSPKE 0.8的cDNA(Bates等人，1993年)，已被消化生态RV和Sma公司我要实现直截了当、兼容的目标。RCAS–表皮生长因子受体*由建造克拉我消化RCAS–[希神]普洛去除嘌呤霉素抗性基因并用pIND5′3′的片段替换表皮生长因子受体(Ekstrand等人，1992年; 大卫·詹姆斯（David James）、梅奥诊所罗切斯特（Mayo Clinic Rochester）和克里斯·托马斯（Chris Thomas）（梅奥诊所杰克逊维尔（Jacksonville））的礼物。这个碎片里有一个人表皮生长因子受体cDNA缺失与外显子2–7（碱基275–1075）和碱基3133的序列3′相对应的序列。

老鼠

生产Gtv-a型鼠标线已描述(Holland and Varmus 1998年). 这个Gtv-a型鼠标线最初由FVB/N与C57B6 X BALB/C F交叉生成1. TheGtv-a型然后，创始人被培育成FVB/N，以产生F1随后进行杂交以保持转基因系的后代。FVB/N的生产Ntv-a型小鼠系通过原核注射Ntv-a型通过消化从质粒中释放的转基因Hin公司DIII.（二）。C57BL/6和129混合遗传背景的小鼠，以及INK4a–ARF公司和第53页已在前面描述过(Donehower等人，1992年;Serrano等人，1993年). 基因背景电视-a因此，用于感染的转基因小鼠是FVB/N、129和C57BL6的混合物。

细胞培养

通过机械分离全脑，然后在37°C下用0.25%胰蛋白酶消化15分钟，获得新生转基因小鼠的原代脑细胞培养物。允许大的碎片沉淀，并将单细胞接种在含有10%胎牛血清（GIBCO–BRL）的DMEM中生长。DF-1细胞是明尼苏达大学Doug Foster赠送的一种永生化鸡细胞系，在含有5%胎牛血清、5%小牛血清、1%鸡血清和10%胰蛋白酶磷酸盐肉汤（GIBCO–BRL）的DMEM中生长。

细胞培养中的感染

感染并产生RCAS载体的DF-1细胞的上清液通过0.45-μm过滤器过滤，并直接涂布在来自Gtv-a型老鼠。这些原代脑培养物感染了来自RCAS的过滤培养基-[希神]普洛-产生细胞，然后在4μg/ml嘌呤霉素中筛选。

培养细胞的免疫沉淀、Western blot分析和免疫过氧化物酶染色

使用含1.0%吐温（TBST）的Tris缓冲盐水（pH 8.0）从培养的细胞中分离蛋白质，并在4°C下用0.4μg小鼠单克隆抗突变EGFR沉淀过夜（Darrel Bigner，Duke University，Durham，NC赠送；Wikstrand等人，1995年)使用抗鼠免疫球蛋白–Sepharose（Sigma）。产物通过凝胶电泳分离并转移到尼克松。用相同的抗突变EGFR抗体在TBST中孵育印迹，在TBST内广泛洗涤，用过氧化物酶结合的山羊抗鼠抗体（Boehringer）孵育，然后用ECL（Amersham）检测。

为了进行免疫过氧化物酶分析，将培养的细胞固定在100%甲醇中，并用1%山羊血清在TBST中封闭。然后在添加0.5μg抗突变EGFR抗体后在室温下培养1小时，用TBST广泛洗涤，并用过氧化物酶结合的抗鼠抗体（ABC，Vector）检测。

转基因小鼠感染

通过胰蛋白酶消化法收集感染并产生RCAS载体的DF-1细胞，并通过离心法造粒，将细胞颗粒重新悬浮在～50μl培养基中并置于冰上。使用10-μl气密Hamilton注射器，一次颅内注射1μl含104细胞是在新生小鼠的右侧额叶区域制造的，就在纹状体的前面，针尖刚好接触颅底。

脑切片及免疫组织化学染色

在4–10周龄时处死动物，将大脑固定在4%甲醛、0.4%戊二醛、1×PBS中36小时，然后在20%蔗糖、2%甘油、1×PBS中脱水。使用雪橇切片机（Zeiss）获得冰冻切片（40μm）。在65°C（pH 9.5）下处理3分钟后，使用5-溴-4-氯吲哚磷酸和4-硝基-蓝四氮唑氯化物（Boehringer）在溶液中对切片进行碱性磷酸酶活性染色，以去除内源性碱性磷酸酶的活性。然后将切片安装在玻璃载玻片上，并用苏木精和伊红进行复染。对于免疫染色，固定冰冻切片（40μm）在溶液中进行AP染色，如所述。然后用10%过氧化氢酶/70%甲醇处理切片15分钟，以灭活内源性过氧化物酶。然后用1%的山羊血清在Tris缓冲盐水（pH 8.0）中封闭切片，用0.1%吐温（TBST）溶液封闭20分钟，然后在添加鼠抗人GFAP（Boehringer）、鼠巢蛋白（Pharmingen）、牛bFGF（Calbiochem）、鼠VEGF（Upstate Biochemicals）、，或人类EGFR的vIII突变形式（Darell Bigner的礼物；Wiksrand等人，1995年)或兔抗人类vIII突变体EGFR的多克隆抗体（宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学Albert Wong赠送）。用TBST广泛清洗切片，然后用过氧化物酶结合的抗鼠抗体（ABC，Vector）观察抗体染色，然后将切片安装在玻片上。

致谢

我们感谢Doug Foster提供DF-1细胞，感谢Han-Woong Lee提供INK4–ARF无效小鼠，Chris Thomas建议并提供突变EGFR cDNA，Steve Hughes为RCAS提供-[希神]普洛矢量，城市伦达尔巢穴用于生成Ntv-a型小鼠系，Darell Bigner为小鼠单克隆抗突变EGFR抗体，Albert Wong为兔多克隆抗突变EGFR抗体，Ed Harlow为抗p16抗体，Rod Bronson为有益的讨论，Martin Raff为敦促我们感染早期胶质细胞谱系的细胞。Lisa Garrett和Amy Chen进行了受精卵注射，产生了Ntv-a型Gene Elliott和Theresa Hernandez提供了出色的畜牧业。R.A.D.得到了美国国立卫生研究院（EY11267）的资助，并获得了Irma T.Hirschl职业科学家奖。E.C.H.是霍华德·休斯（Howard Hughes）的医生博士后研究员。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。

在校样中添加注释

我们已经检测到编码p19氨基末端部分的异常转录物农业研究基金来自INK4a–ARF公司本研究中使用的小鼠星形胶质细胞外显子1β的靶向缺失INK4a–ARF公司基因座（W.P.Hively、E.C.Holland、R.A.DePinho、H.E.Varmus和M.Serrano，未定）。然而，来自这些小鼠和突变小鼠的细胞特异性地消除了外显子1β(Kamijo等人，1997年)与p19具有非常相似的表型特性农业研究基金细胞凋亡、转化和倍性的功能(Serrano等人，1996年;Zindy等人，1998年; W.P.Hively、E.C.Holland、R.A.DePinho、H.E.Varmus和M.Serrano，未提交）。因此，我们在本文和Holland等人（1998）相对于p19可能严重变形或为零农业研究基金功能。

脚注

电子邮件ude.cmt.ccadm.seton@dnallohe网站; 传真：（713）794-4950。

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社