内皮PAS结构域蛋白1（EPAS1）是一种在血管内皮细胞中大量表达的低氧诱导转录因子(Ema等人1997;Flamme等人，1997年;Tian等人，1997年). EPAS1的一级氨基酸序列与缺氧诱导因子1α（HIF1α）的一级氨基酸序列相似（48%同一性），HIF1α是一种已知的转录因子，可诱导培养细胞对缺氧的红细胞生成素基因表达(Semenza和Wang 1992年;Wang等人，1995年). EPAS1和HIF1α都是转录因子bHLH–PAS结构域家族的成员，其中包括有助于外源性物质解毒的蛋白质(汉金森1995;Schmidt和Bradfield，1996年)昼夜节律的控制(凯和米勒1995;Antoch等人1997年;King等人，1997年)以及胚胎发育期间组织模式的规范(Nambu等人，1991年;Isaac和Andrew 1996;Wilk等人，1996年).
尽管EPAS1和HIF1α具有大量的一级氨基酸序列相似性，并且迄今为止研究的功能性质基本上无法区分，但这两种蛋白质在非常不同的细胞和组织类型中表达。例如，在脐带中，EPAS1在血管壁的内皮细胞中表达。相反，HIF1α在血管周围的平滑肌细胞中表达(Tian等人，1997年). 因此，虽然这两种蛋白质可能利用相似的生化机制，但它们被认为控制着由其不同表达位点所指示的明显不同的生理途径。例如，HIF1α基因激活的最重要靶点之一是肾脏中的促红细胞生成素基因。因为EPAS1不存在于表达促红细胞生成素的肾小管周细胞中（Eckardt等人，1993；Tian等人，1997年)，它在该基因对缺氧反应的转录诱导中没有直接作用。为了阐明EPAS1的生理作用，我们在小鼠中破坏了其编码基因。这里我们显示，纯合、EPAS1缺陷的胚胎在妊娠中期胚胎发育期间死于循环衰竭。我们的结果与EPAS1在心输出量控制中的基本作用一致。
小鼠的破坏EPAS1系统该基因是通过使用靶向质粒在胚胎干细胞中进行同源重组来实现的，在靶向质粒中大肠杆菌β-半乳糖苷酶（β-gal）被取代EPAS1系统基因（图。A） ●●●●。从总共768个转染体中分离出两个同源重组干细胞系，其中一个成功通过了破坏EPAS1系统通过生殖系的基因（图。B、 C）。引入的突变被消除EPAS1系统mRNA，由纯合胚胎第13.5天（E13.5）动物制备的RNA的Northern blot分析推断（图。D） ●●●●。
小鼠突变EPAS1系统基因。(A类)野生型（WT）示意图EPAS1系统显示外显子2和3的位置以及生态RI（E）和巴姆HI（B）限制性内切酶，所述靶向载体含有病毒胸苷激酶（TK）基因和大肠杆菌lacZ基因替换的第2外显子EPAS1系统基因，以及野生型等位基因和载体之间同源重组的产物（靶向等位基因）。(B类)ES细胞基因组DNA的Southern blot分析EPAS1系统基因探针和alacZ公司探查。(C类)继承EPAS1系统杂合子杂交胚胎的空等位基因通过尾部基因组DNA的PCR分析判断。(D类)E13.5胚胎总RNA（20μg）的Blot分析EPAS1系统β-肌动蛋白cDNA探针。
小鼠杂合子EPAS1系统在10个月的时间里，这种突变与它们的野生型幼崽没有明显区别。然而，没有从杂合子杂交中恢复到活的纯合子突变动物，这表明EPAS1系统突变可能导致胚胎死亡。为了确定死亡时间，在不同发育阶段对胚胎进行基因分型（表). 在E11.5，以预期的孟德尔比率（25%）发现了外观正常的纯合胚胎。从E12.5开始，纯合、EPAS1缺陷胚胎的百分比下降，到E16.5，没有观察到具有该基因型的活胚胎。当受到干扰时，也得到了类似的结果EPAS1系统该基因维持在同源的129背景中（数据未显示）。在E12.5和E15.5之间存活的EPAS1缺陷胚胎基本正常，没有明显的形态缺陷。
表1
年龄
| +/+
| +/−
| −/−
| −/−(%)
|
|---|
| 图11.5 | 9 | 18 | 9 | 25 |
| 图12.5 | 15 | 25 | 10 | 20 |
| 图13.5 | 20 | 40 | 6 | 9 |
| 图14.5 | 16 | 29 | 三 | 6 |
| 图15.5 | 21 | 41 | 2 | 三 |
| 图16.5 | 11 | 25 | 0 | 0 |
| 图18.5 | 16 | 36 | 0 | 0 |
| 第1页 | 72 | 149 | 0 | 0 |
EPAS1能够激活第2级基因(Tian等人，1997年)编码胚胎血管生成所需的内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶(Dumont等人，1994年;Sato等人，1995年). 缺乏Tie2的小鼠血管畸形，在E9.5和E10.5之间死亡(Dumont等人，1994年;Sato等人，1995年). 为了确定突变胚胎是否存在血管缺陷EPAS1系统-在血管生成的关键阶段跟踪驱动的β-Gal活性。如图所示A、 在背主动脉和在E9.0-9.5左右开始形成的节段间动脉中检测到替代EPAS1的表达。类似地，在E10.5上染色的纯合胚胎包含正常模式的动脉系统（图。B） ●●●●。如图所示C、 纯合子和杂合子动物的血管发育模式无法区分。这些观察结果表明，EPAS1在血管生成或血管生成中均不起重要作用。
EPAS1缺陷小鼠的血管系统和表型。(A–C)替代EPAS1在E9.0-9.5和E10.5胚胎中的表达EPAS1系统β-半乳糖苷酶活性的基因型监测采用整体染色法。(D类)活胚胎杂合子（+/-）EPAS1系统E13.5上解剖了突变的空等位基因和死胚纯合子（−/−）并拍照。−/−胚胎肝脏内的血细胞明显淤积。棒材，100μm(A–D).
先前的研究表明，心血管发育、肝脏造血和胎盘形成的异常可导致中期妊娠致死(Copp 1995年;Uehara等人，1995年). 在死亡中EPAS1系统纯合子胚胎，在肝脏和心脏流出道都观察到血液充血（图。D） 。然而，对从E11.5和E15.5上分离的EPAS1缺陷活胚胎中提取的石蜡包埋切片进行检查，并未发现心脏、肝脏或胎盘中存在任何形态缺陷。综上所述，这些组织学分析表明EPAS1突变胚胎可能死于生理原因而非发育原因。
接下来，我们更详细地检查了胚胎死亡时或临近死亡时EPAS1的表达。杂合动物用X-gal染色并切片以显示表达细胞和组织。除内皮细胞外，在交感神经肾细胞系中还观察到EPAS1的表达。在E11.5，在交感链中观察到EPAS1阳性细胞（图。A） ●●●●。一天后，EPAS1在这些细胞中表达下调，但在形成的副神经节中强烈表达，称为扎克坎德尔器官（OZ）（图。B） ●●●●。从E13.5到E15.5，EPAS1在OZ的嗜铬细胞中保持高水平表达，在肾上腺中也存在低水平表达（图。C、 D）。EPAS1在这些细胞中的时间表达与EPAS1缺陷胚胎的死亡时间相关（表).
EPAS1在交感链和OZ中的表达(A–D)通过β-半乳糖染色监测组织切片和全山胚胎中EPAS1的表达。源自E11.5的截面(A类)，E12.5(B类)和E13.5(C类)纯合子胚胎lacZ公司-已标记EPAS1系统等位基因在交感链细胞（SC）、背主动脉内皮细胞（DA）和肾动脉内皮细胞（RA）、OZ和肾上腺嗜铬细胞（A）中表达。在主静脉（CV）或神经管（NT）的细胞中未检测到表达。棒材，10μm。(D类)E15.5上杂合子胚胎的整体染色显示，OZ中β-半乳糖苷酶表达强烈，肾上腺（a）表达较低，这两个部位都位于肾脏（K）和睾丸（T）附近。棒材，50μm。
OZ是胎儿儿茶酚胺的主要来源，尤其是在早期胚胎发育期间，交感神经系统和肾上腺髓质都没有功能(Lagercrantz和Marcus 1992年). 儿茶酚胺是胚胎和新生儿发育期间正常心血管功能所必需的。缺乏编码基本儿茶酚胺生物合成酶（包括酪氨酸羟化酶和多巴胺β-羟化酶）的基因的小鼠在妊娠中期死亡，可能是因为心动过缓(Kobayashi等人，1995年;Thomas等人，1995年;Zhou等人，1995年).
已知胚胎中儿茶酚胺的释放可以通过增加心率来调节心输出量(Landsberg and Young 1994年). 野生型E12.5胚胎(n个 = 33）的平均心率为36.0±6.6（平均值±标准差。)每分钟心跳次数，而EPAS1缺陷胚胎的心脏(n个 = 24）心跳更慢（26.9±8.0）。根据两位学生的t吨-测试(P（P） < 0.001）和Wilcoxon秩和检验(P（P） < 0.001). 因此，在死亡之前，EPAS1缺陷的胚胎表现出可测量的心率减慢（心动过缓）。
然后用高压液相色谱法测定胎儿儿茶酚胺水平(Thomas等人，1995年). 哺乳动物胎儿中主要儿茶酚胺，即去甲肾上腺素的含量明显较高（5.42±2.15 ng/mg蛋白质(菲利普1983),n个 = 16,P（P） < 与EPAS1缺陷胚胎（3.21±0.76 ng/mg蛋白质，n个 = 15).
在EPAS1缺乏的胚胎中观察到的去甲肾上腺素水平降低和心动过缓可能是胚胎致死的原因。为了验证这个假设，我们试图拯救EPAS1系统纯合子我-3,4-二羟基苯丙氨酸(我-DOPA），以及d、 我-苏氨酸-3,4-二羟基苯基丝氨酸（DOPS）。我-多巴可以通过下列连续作用转化为多巴胺和去甲肾上腺素我-芳香族氨基酸脱羧酶和多巴胺β-羟化酶，而DOPS可以通过脱羧酶直接转化为去甲肾上腺素。新鲜饮用水含有我-如前所述，每天给孕妇服用1 mg/ml的DOPA或DOPS(Thomas等人，1995年;Zhou等人，1995). DOPS可防止约40%突变胚胎的中期妊娠死亡，而我-DOPA未能做到这一点（表). 被救出的EPAS1缺陷幼崽被带到足月，此时它们出现断奶，无法哺乳，并在出生后24小时内死亡。
表2
| 总计
| +/+
| +/−
| −/−
|
|---|
| 没有药物 | 221 | 72 | 149 | 0 |
| 我-多巴 | 59 | 21 | 38 | 0 |
| DOPS公司 | 118 | 33 | 71 | 14 |
新生儿OZ退化，其作为缺氧传感器的功能主要由颈动脉体承担。这个感觉器官由含有儿茶酚胺的I型（血管球）细胞、胶质样II型（支持细胞）细胞和颈动脉窦神经的传入化学感觉纤维组成(Peers and Buckler 1995年). 作为对动脉氧减少的反应，I型细胞释放儿茶酚胺，刺激颈动脉窦神经的感觉放电增加，从而增加呼吸和心血管输出(Peers and Buckler 1995年). 如图所示，EPAS1在颈动脉体中高度表达（图。A） ●●●●。低水平组织学检查（图。B） 和高（图。C） 放大后发现，这一高度血管化器官的内皮细胞都有染色，重要的是，含有儿茶酚胺的富含细胞质的I型细胞也有染色。
EPAS1在成人颈动脉体中的表达。(A类)成人（年龄2.5个月）杂合子的整体染色显示颈动脉体（CB）中β-gal的强烈表达，颈动脉体位于颈总动脉（CC）与颈内动脉（IC）和颈外动脉（EC）的分叉处。(B、 C类)邻近组织切片显示颈动脉体内皮细胞和I型细胞的表达。棒材，100μm(B类); 50微米(C类).
本报告中的观察结果揭示了EPAS1在哺乳动物胚胎儿茶酚胺稳态中的重要作用。这种转录因子的缺乏会导致心动过缓、去甲肾上腺素显著减少和妊娠中期胎儿死亡。EPAS1在OZ的嗜铬细胞中高水平表达，OZ是一个被认为在缺氧时向胎儿循环释放去甲肾上腺素的器官(Lagercrantz和Marcus 1992年). 我们假设，EPAS1在OZ中的表达是缺氧诱导的，并且在妊娠中期发育时，充当胚胎中缺氧的传感器。作为对该信号的响应，EPAS1诱导儿茶酚胺合成或释放所需的基因表达。当EPAS1缺失时，儿茶酚胺稳态被破坏，导致进行性心动过缓和胎儿死亡。在成人中，EPAS1在颈动脉体I型细胞中可能具有类似的缺氧传感器和儿茶酚胺作用效应器的作用。
EPAS1通过哪些靶基因介导其对儿茶酚胺稳态的影响？如果EPAS1调节这类神经递质的合成，那么在OZ和颈动脉体中EPAS1介导诱导的一个有吸引力的候选基因是酪氨酸羟化酶基因。以前的研究表明，缺乏这种酶活性的小鼠在妊娠中期死亡，这与EPAS1缺乏的动物没有区别(Kobayashi等人，1995年;Zhou等人，1995). 此外，已知酪氨酸羟化酶基因是由颈动脉体中的缺氧诱导的(Czyzyk-Krzeska等人1992;Millhorn等人，1996年). 同样，DOPS的观察结果我-DOPA拯救EPAS1缺陷的胚胎（表)提示多巴胺β羟化酶基因可能受该转录因子调控。
对于参与儿茶酚胺释放的基因的EPAS1调节，也可以提出同样有力的论点。我们注意到，尽管去甲肾上腺素总水平仅降低40%，但杂合子雌性所怀的所有纯合EPAS1缺陷胚胎在E16.5之前死亡。相反，在去甲肾上腺素水平下降>95%的情况下，杂合子雌性生育的一些纯合多巴胺β-羟化酶缺陷胚胎存活至足月(Thomas等人，1995年). 后一种动物的完全致死性仅在纯合子缺陷母亲所怀纯合子胚胎中观察到。这些结果表明，EPAS1缺陷小鼠的胚胎致死率与儿茶酚胺生物合成缺陷没有直接关系，而是与激素作用的下游事件有关，例如低氧释放或随后突触摄取(Jones等人，1998年).
无论OZ和颈动脉体的儿茶酚胺分泌细胞中EPAS1调节哪些靶基因，本报告中的观察结果证明了EPAS1在儿茶酚酚胺稳态中的整体作用。如果这里的解释是正确的，那么EPAS1可能是发现儿茶酚胺稳态和心血管系统调节药物的一个诱人目标。
