Janus激酶级联反应是一种普遍存在的细胞内信号通路,是对许多细胞外配体作出反应所必需的。该途径包括受体相关酪氨酸激酶(JAK)及其底物转录因子、信号转导子和转录激活子(STAT)。JAK/STAT级联已经成为脊椎动物通过大量细胞因子和生长因子进行信号传导的一个重要的再利用方面。这些信号可诱导增殖或分化,对哺乳动物组织尤其是血细胞系的正常生长和发育至关重要。这种信号通路活性的减少和增加都会产生严重后果。特定JAK功能的丧失会使细胞无法对干扰素、白细胞介素、生长激素或其他信号分子做出反应。在人类中,JAK3缺陷与常染色体严重联合免疫缺陷(SCID)有关(Macchi等人,1995年)导致淋巴细胞发育显著减少。同样,JAK或STAT基因敲除产生免疫缺陷或有其他造血缺陷的小鼠(Nosaka等人,1995年;Durbin等人,1996年;Meraz等人,1996年;Neubauer等人,1998年;Parganas等人,1998年;Rodig等人,1998年). 另一方面,JAK和/或STAT的组成性激活与几种致癌途径相关。最直接的是,JAK2与TEL转录因子的寡聚结构域融合会导致急性淋巴细胞白血病(Lacronique等人,1997年;Peeters等人,1997年). 这些数据表明JAK/STAT级联在正常发育和肿瘤发生中都有重要作用。
JAK是一类新的非受体酪氨酸激酶,其中四个哺乳动物成员已被鉴定(有关综述,请参阅Ihle等人,1997年). 这些分子的独特特征是存在两个串联激酶同源结构域。这些蛋白质的羧基末端结构域被证明可以催化酪氨酸磷酸化,而氨基末端结构域则明显不催化。JAK酪氨酸磷酸化的主要底物是STAT。这种分子家族在哺乳动物中有七个成员,能够与特定的DNA序列结合并激活转录(1996年1月;Darnell 1997年). JAK和STAT共同构成一个简单的细胞内信号中继,可以被多种细胞外因子激活。在脊椎动物中,细胞因子是利用级联反应的最大类分子。虽然细胞因子具有明显不同的氨基酸序列,但根据其结构将其分为两类。较大类别的I型细胞因子具有特征性的上-上-下-下螺旋结构,指的是蛋白质中α螺旋的排列(斯普朗和巴赞1993). 这些分子的受体是异多聚亚基,许多细胞因子使用受体复合体中的一个共同亚基。虽然II型细胞因子的结构与I型细胞因子不同,但它们也与异多聚体受体复合物结合。
从机械上讲,JAK/STAT通路提供了对细胞外信号作出反应的直接手段(有关综述,请参阅Darnell 1997年;Ihle等人1997). 激活的第一步是将细胞外配体与适当的跨膜受体结合。配体结合通常会诱导受体二聚或多重聚合。目前的模型认为,受体二聚化使其相关的JAK分子接近,可能有助于反式-JAK的磷酸化。然后通过激活适当的STAT将信号直接传输到细胞核。在细胞质中发现了不活跃的STAT,在JAK激活后,这些STAT被募集到细胞膜的内表面。在这里,它们是被JAK磷酸化的酪氨酸,然后转移到细胞核并结合特定的DNA序列来调节转录。通过这种方式,激活的STAT通过下游靶基因的转录激活实现对信号的直接响应。
我们目前对JAK/STAT信号通路的理解主要来自于对哺乳动物的研究。最近,a果蝇属出现了一种范式,其中只有一个JAK(跳房子,跳)和STAT(统计92E; 也称为马雷尔)已确定(有关审查,请参见Hou和Perrimon 1997)。果蝇跳跃最初被鉴定为与胚胎模式形成有关的基因(佩里蒙和马霍瓦尔德1986). 来自雌性的胚胎不表达单足蹦跳它们生殖系中的基因产物显示出新的胚胎缺陷,其特征是特定的身体片段子集的丢失和/或融合。这种表型是不寻常的,因为它与任何典型的分段基因类别(间隙、配对规则或分段极性基因,参见Nüsslein-Volhard和Weischaus 1980年). 同样的胚胎表型也见于缺乏统计92E基因活性。
这里我们描述了第三个基因的特征,未成对的(更新),具有独特的胚胎突变表型单足蹦跳和统计92E.我们提供的遗传和生物化学证据表明更新编码一种可激活JAK级联的分泌分子,表明它在果蝇属细分。
结果
upd表型与hop和stat92E相似
合子缺失更新活动导致果蝇属与单足蹦跳和统计92E突变胚胎(Wieschaus等人,1984年)(图。). 这些缺陷通常包括第五个腹齿带和第四个带的后中腹部分的缺失。其他节段的缺陷是可变的,但通常包括第二胸骨和第八腹骨牙本质带的缩小以及第六和第七带的融合。与…对比单足蹦跳或定子92E(佩里蒙和马霍瓦尔德1986;Hou等人,1996年),合子更新活动是必要的,但母体活动不是,因为缺乏母体效应表型更新突变体(Eberl等人,1992年). 缺乏合子的胚胎之间的相似性更新还有那些缺乏母性的人单足蹦跳或统计92E表明更新是JAK信号通路的一个组成部分。这些基因之间的遗传相互作用进一步支持了这一假设。以前已经观察到单足蹦跳是可行的,但有成人缺陷(佩里蒙和马霍瓦尔德1986). 部分损失单足蹦跳这类动物的活动会导致生存能力降低、翅膀下垂、成熟卵子产量减少和/或卵子缺陷。每个异等位基因组合都会导致与这些表型相关的一致且可预测的严重程度。测试单足蹦跳和更新基因在遗传上相互作用更新从携带等位基因组合的动物身上移除单足蹦跳.改变的剂量更新活动加剧了这些缺陷单足蹦跳突变组合(见表). 如果这两种基因产物在同一途径中激活,则可能发生这种增强。
JAK途径突变的胚胎效应。(A类)代表性的胚胎角质层表型来自野生型,单足蹦跳c111号生殖系突变克隆衍生胚胎,统计92E第1681页GLC胚胎,以及Df(1)os1安培(更新突变体)胚胎。所有三种突变的缺陷都相似,并在正文中进行了描述。(B类)损失的影响更新显示了三对规则基因的表达。野生型胚胎(左边)和Df(1)操作系统1安培/Y胚胎(正确的)比较细胞胚层是否存在Even-skipped(Eve)蛋白,福西塔拉祖(自由贸易区)RNA,和矮子RNA。每个显示中第五条条纹的简化表达更新突变胚胎(中间的). 文本中描述了其他表达式条带中的变量缩减(未显示)。在所有图片中,前面是左边。角质层显示在腹视图中,而染色显示在侧视图中。
表1
| 单足蹦跳M4毫米
| 单足蹦跳VA275型
| 单足蹦跳GA32公司
| 单足蹦跳VA85型
| 单足蹦跳M75型
| 单足蹦跳立方米38
| 单足蹦跳百万标准体积
| 单足蹦跳M637型
| 单足蹦跳13米
|
---|
可行性 |
单足蹦跳百万标准体积 | 100% | 100% | 100% | 100% | 70% | 50% | 25% | 5% | 2% |
单足蹦跳百万标准体积更新YM55年 | 95% | 90% | 55% | 20% | 43% | 16% | 12% | 0% | 0% |
固定的机翼 |
单足蹦跳百万标准体积 | 不 | 不 | 不 | 不 | 不 | 对 | 对 | 对 | 对 |
单足蹦跳百万标准体积更新YM55年 | 不 | 不 | 对 | 对 | 对 | 对 | 对 | 不适用。 | 不适用。 |
鸡蛋生产 |
单足蹦跳百万标准体积 | +++ | +++ | + | + | + | − | − | − | − |
单足蹦跳msvl公司更新YM55年 | + | − | − | − | − | − | − | 不适用。 | 不适用。 |
upd是成对规则基因条带特异性表达所必需的
The similarity of the更新突变表型与单足蹦跳和统计92E以及上述的遗传相互作用,表明这三个基因都参与了相同的发育过程。这个假设的预测是更新将以相同的方式影响分割基因的表达单足蹦跳和统计92E.成对规则基因的表达分析更新突变胚胎证实了这一预测。移除更新导致一些成对规则基因的条带特异性表达缺失(图。). 具体来说,在更新突变体,基因表达的第五条条纹均匀滑动(前夕),福西塔拉祖(自由贸易区)、和矮子减少或不存在。此外前夕和自由贸易区和第二条条纹矮子可变地减小。这些条带特异性影响与母体丧失单足蹦跳和统计92E活动(比纳里和佩里蒙1994;Hou等人,1996年)。
增强子元件负责控制前夕表达式已映射到前夕转录起始位点(Small等人,1996年). 一个携带5.2 kb前夕上游序列,包括该增强子区域,融合到lacZ公司基因驱动表达lacZ公司在第二、第三和第七条条纹中前夕(Goto等人,1989年). 先前的工作表明,该片段包含体外结合Stat92E蛋白的序列(Yan等人,1996b). 去除任何一种母体活动单足蹦跳或统计92E导致报告构造的第三条条纹丢失(Hou等人,1996年;Yan等人,1996b). 类似地更新也会导致第三条条纹的特定损耗,而不会影响第二条或第七条条纹(未显示)。
upd基因编码一个2.2 kb的转录物
由于它可能参与JAK信号转导更新基因被携带。以前的基因图谱更新在~59,在聚乙烯带17A中(Eberl等人,1992年). 这靠近Shaker复合体,但远及近CREB公司和豪猪(门廊)(Kadowaki等人,1996年). 强等位基因更新胚胎致死,但较弱的等位基因显示伸出的(操作系统)表型,导致成年苍蝇的翅膀远离身体。等位基因更新和操作系统基于合子致死的失败更新补充翅膀表型的等位基因操作系统等位基因(本研究和Eberl等人,1992年). 例如,胚胎致死等位基因的组合更新YC43型带有活性等位基因操作系统o(o)结果发现成虫翅膀伸展,可以存活。为了为位点的分子定位提供额外的断点操作系统等位基因是通过X射线产生的(见材料和方法)。
染色体行走振动筛该地区由O.Pongs慷慨提供给我们(Krah-Jentgens 1989年). 各种蛋白质的Southern blot分析更新/os该区域的突变和重排被用来界定更新基因(图。). 这些突变的位置表明更新必须位于染色体行走的370–415kb区域内。通过使用从野生型苍蝇阶段胚胎收集物中分离的RNA,通过Northern blot分析鉴定候选转录单位,并用该45-kb区域的DNA进行探测。识别出三个非重叠RNA(图。). 只有2.2kb的转录本在符合更新功能。这种RNA在合子早期发育期间表达,即需要早期分割基因的阶段。的排序更新YM55和更新YC43型突变等位基因分别在2.2-kb转录物的ORF中发现了无义突变和移码突变(图。,如下所示;首先由L.Sefton和T.Cline注意到,pers.comm.)。这些数据以及下面描述的实验提供了大量证据,证明2.2-kb的转录本代表了更新。
分子图更新区域。该地图显示了染色体行走中噬菌体的位置,单位为千碱基。等位基因的位置界定了更新基因座显示在染色体下方,粗体线表示DNA缺失。虚线表示断点准确位置的不确定性。转录单位的位置显示在底部1-kb转录物尚未被精确地映射并且落在所指示的区域内。2.5-kb RNA仅在胚胎发育晚期(13小时后)表达,1-kb RNA在母体中表达,在胚胎发育后期再次表达。这个更新候选转录本,2.2kb,在早期合子阶段表达(也参见图。). CREB仅供参考(保时捷中心在以下位置离开地图正确的). 邻近的是正确的.识别两个患者的单部位病变更新等位基因,更新YM55年和更新YC43型,证实这些突变属于同一互补组。因为这些突变不能互补操作系统等位基因,只影响2.2-kb转录物编码的蛋白质(图。),我们得出结论操作系统和更新是同一轨迹的可分离函数。的断点操作系统4-51-1,操作系统c18号、和操作系统109(全部操作系统−,更新+)从2.2kb的转录本中绘制至少13kb的图谱,表明操作系统表型可能来源于远离3′末端的增强子的破坏更新成绩单。
的顺序更新. (A类)的顺序更新cDNA(λKZ-GR)如图所示。概念ORF显示在DNA序列下面。假定的信号序列用开盒表示,假定的氨基连接糖基化信号用阴影框表示,与mRNA稳定性相关的AU-丰富序列用下划线和粗体表示。内含子位置由倒三角形表示。(B类)预测的蛋白质序列D.黑腹果蝇(Dm)Upd与预测的D.阿纳萨斯(Da)奥姆(1E)。氨基酸身份显示在黑箱中。
upd胚胎表达受空间限制
2.2-kb转录本的空间分布也与胚胎分割的作用一致。对整座胚胎中RNA的原位杂交揭示了一种动态和分段重复的表达模式(图。). 在合胞体胚细胞阶段,2.2 kb转录物的表达水平不高于背景水平。在细胞化前不久,RNA变得丰富,但末端不存在,仅限于胚胎的躯干和一条不完整的头部条纹。在细胞化时,树干表达分解为~7条条纹,然后分解为14条条纹,这是一些成对规则分割基因中的现象(Kilcherr等人,1986年;Macdonald等人,1986年)。
胚胎表达更新成绩单。胚胎表达更新RNA是高度动态的。背景以上检测不到母体产品(A类)但在细胞化之前,RNA广泛表达于胚胎的整个躯干和头部的月牙形背侧(B类). 随着细胞化的进行,表情瞬间分解成七条条纹(C、 天). 在原肠胚形成早期,出现14条表达条纹(E类). 后来的表达主要局限于气管窝(F、 G公司). 前部是指左边观点主要是横向的。
从模式来看,Upd to Hop和Stat92E的功能关系不明显更新表达式。Hop和Stat92E均为母体所需,并在整个胚层胚中表达。相反,更新需要合子,与其片段表达和缺乏母体效应表型一致。一个可能的模型是单足蹦跳和统计92E母体基因产物调节合子的表达更新。这是通过分析更新在来源于单足蹦跳或统计92E生殖系克隆。胚层的表达模式更新在这些胚胎中未发生变化(数据未显示),表明Upd作用于JAK/STAT通路上游或平行。
upd基因编码一种预测的细胞外蛋白
最大回收量的排序更新cDNA已经鉴定出一个ORF,它可以编码46.8 kD的肽(图。). 概念翻译产物仅与另一种已确定的蛋白质相似,即奥姆(1E)蛋白质ananassae果蝇,一个关系非常密切的物种(Juni等人,1996年). 这两个物种的蛋白质在其长度的三分之二以上(图。B) 但在终点处分叉。对其发育功能知之甚少Ω(1E)基因,但该基因的过度表达会导致成虫的缺陷。在发育中的眼影像盘中Ω(1E)导致细胞过度增殖。此外,发育中的翼想象盘过度表达会导致异位鬃毛、伸展的翅膀和凹槽变形。有趣的是,这些表型与由过度表达单足蹦跳中的基因黑腹果蝇(Harrison等人,1995年)从而进一步支持了以下假设:更新是果蝇JAK信号的一个组成部分。Om(1E)蛋白唯一引人注目的结构特征是氨基末端的一个潜在信号序列和几个可能的氨基连接糖基化位点,这两者都表明该蛋白是细胞外的。这些功能也存在于D.黑腹果蝇Upd(图。). 这种蛋白质在JAK信号传导中作用的一个简单模型是,它编码激活JAK通路的配体。
除了ORF外,cDNA还包含226-bp 5′和734-bp 3′[不包括poly(A)]UTR。有趣的是,这些UTR包含两个序列元素的多个拷贝,这些序列元素已被证明降低了mRNA的稳定性。在3′UTR中有四个分散的ATTTA基序,它们存在于许多细胞因子、淋巴因子和原癌基因中(Shaw和Kamen 1986年). 此外,在配对规则基因中鉴定出的a/TTTGTA基序自由贸易区(Riedl和Jacobs-Lorena,1996年)在3′UTR中有两份副本,在5′UTR上有一份副本更新这些因素可能有助于更新mRNA在早期胚胎中积累。
Upd是一种糖蛋白
检查更新转录本显示存在三个假定的翻译起始密码子。第一个(核苷酸219)不太可能被使用,因为它只能编码38个氨基酸的肽。另外两个是核苷酸227和668,导致蛋白质共享相同的阅读框架,但其氨基末端不同。为了确定体内首选哪个翻译起始位点,果蝇属施耐德2(S2)细胞转染了一个代表整个更新转录后进行免疫沉淀,并使用针对两种假定Upd蛋白产物共同部分的抗体检测Upd蛋白。检测到的仅有45kD及更大的谱带(如图所示。B、 通道2),这表明使用了核苷酸227处的翻译起始密码子,从而产生具有假定信号序列的蛋白质。
Upd的修改和本地化。(A类)Upd蛋白的大小是在衣霉素存在和不存在的情况下测定的。转染结构为空向量(车道1,2),更新cDNA(车道3,4),以及氨基末端截断更新删除预测的信号序列(车道5,6). (B类)使用氨基末端HA表位标签研究Upd在信号序列上可能的裂解。用空载体(lane)转染细胞1),更新cDNA(车道2),氨基末端截断更新删除信号序列(车道三)、和更新在氨基末端(通道)标记HA表位的cDNA4,5). 用兔α-upd免疫沉淀蛋白质,电泳,印迹,并用大鼠α-upp(lanes)检测1–4)或带α-HA(车道5). 对照组显示检测到HA标记的Stat92E蛋白的HA抗体(lane6)HA表达载体背景(车道7). (C类)细胞仅转染载体(lanes1,2,7,8),更新cDNA(车道3,4,9,10),或更新缺少信号序列(Δss)(车道5,6,11, 12). 从ECM(通道)中回收Upd蛋白1–6)或中等(车道7–12)在有无肝素的情况下,用兔α-upd免疫沉淀法和大鼠α-upp检测法。
推测信号序列和五个氨基糖基化位点的存在更新这表明它在分泌途径中被翻译后修饰。为了检测氨基连接糖基化的可能性,哺乳动物表达质粒含有更新转染人293T细胞。细胞代谢标记为[35S] 甲硫氨酸在膜霉素存在或不存在的情况下,膜霉素是氨基连接糖基化的有效抑制剂。通过免疫沉淀法回收Upd蛋白,并比较合成的Upd蛋白的大小。未经处理的细胞中出现了数条45-65kD的带,而用衣霉素处理细胞时,只观察到最小的45kD带(图。A) ●●●●。处理过的细胞中没有较大的产物,这表明较大的蛋白质是糖基化形式。未经处理的细胞中存在多种形式的Upd很可能反映了部分糖基化中间体。这些结果表明,Upd含有一个功能信号序列,该序列将Upd靶向内质网进行糖基化和分泌。因此,去除假定的信号序列应消除Upd蛋白对内质网的靶向性,并防止糖基化。正如预测的那样,当从Upd中删除信号序列时,只观察到45-kD带(图。A、 车道5)。
Upd定位于细胞外基质
最小Upd蛋白物种与更新缺乏信号序列表明信号序列通常在成熟蛋白中被裂解。为了检测信号序列的裂解,构建了一个质粒,其中血凝素(HA)表位标签融合到Upd的氨基末端。以前的工作表明,信号序列上的氨基末端延伸并不能消除体内功能(Rottier等人,1987年). 编码标记Upd的质粒被转染到S2细胞中,所得蛋白用抗Upd抗血清沉淀。然后使用抗Upd或抗HA抗血清通过Western blotting检测沉淀蛋白。如图所示B、 抗Upd血清(第4道)可检测到该蛋白,而抗HA抗血清(第5道)则无法检测到该蛋白质。抗HA抗体的活性显示在通道6中,它能够检测表位标记的Stat92E蛋白。这些结果表明,Upd的氨基末端,包括HA标签,被蛋白质水解去除。
在分泌途径中发生的Upd修饰与Upd正常分泌的假设一致。然而,在最初的实验中,尽管Upd的表达水平很高,但在转染细胞的培养基中无法检测到它。因此,为了确定Upd的定位,分别从更新-转染S2细胞并检测Upd的存在。为了避免ECM组分受到细胞和细胞碎片的污染,在收获前对培养皿进行了广泛清洗。大多数Upd蛋白被发现与ECM特异相关,只有少量在培养基中游离(图。C) ●●●●。
蛋白质与ECM的结合通常由糖胺聚糖介导,例如硫酸乙酰肝素。因此,将游离肝素从更新-转染细胞以确定其是否可以阻止Upd与ECM的关联。图中的车道4和车道10C表明,添加肝素后,几乎所有Upd蛋白都会释放到培养基中。肝素与ECM竞争的能力表明,Upd通常通过与糖胺聚糖结合而与ECM结合。正如预期的那样,缺乏信号序列的Upd不会被分泌,也无法在培养基或ECM中检测到(图。C、 车道5、6、11、12)。
Upd可以激活果蝇细胞中的跳跃
关于更新其与Hop和Stat92E的关系都与Upd作为激活JAK信号级联的配体的预测作用一致。为了直接研究这个假设,更新表示为果蝇属细胞,然后检测Hop的酪氨酸磷酸化。本实验选择的细胞系是克隆8(Cl.8)系,来源于发育中的翼想象盘(Peel and Milner 1992年). 对于通过磷酸化Hop对Upd作出反应的细胞,我们假设需要一些跨膜受体通过细胞外结构域结合Upd,并与细胞内结构域上的Hop相关。由于尚未在苍蝇中发现这种受体,我们选择了来源于已知对这种信号有反应的组织的细胞。已经证明Ω(1E)翼盘过度表达导致缺陷(Juni等人,1996年),表明Upd同源物的受体必须存在于D.阿纳萨斯因此D.黑腹果蝇翼盘衍生的Cl.8细胞系似乎是表达Upd受体的可能候选细胞。
为了显示Hop的Upd依赖性酪氨酸磷酸化,来自更新-制备转染细胞并测试其与抗磷酸酪氨酸抗体4G10的反应性。如图所示,虽然在所有样品中都可以检测到霍普蛋白(中间),但霍普仅在制备的免疫沉淀物中被酪氨酸磷酸化更新-转染细胞(顶部,通道2)。细胞转染更新缺乏信号序列并不会导致Hop磷酸化(第3通道),这与Upd是细胞外信号发生所必需的概念一致。转染基因的表达更新以及缺乏内源性更新表达式显示在底部。
Upd激活Hop。转染了更新或与转染有更新.车道1显示了啤酒花蛋白的内源性水平(中间的),酪氨酸磷酸化啤酒花(顶部),和Upd蛋白(底部)在仅用载体转染的Cl.8细胞中。当转染全长Upd时,Hop磷酸化被刺激(lane2),而删除Upd信号序列可消除跳跃激活(车道三). 同样,仅用载体转染S2细胞(lane4)未能激活Hop,而Cl.8细胞与转染全长Upd(lane)的S2细胞共培养5)显示Hop的激活。
为了进一步证明细胞外提供的Upd对于观察Hop磷酸化是必要的和充分的,将Cl.8细胞与瞬时转染的S2细胞共培养更新彻底去除非粘附S2细胞后,从Cl.8细胞裂解液中制备啤酒花免疫沉淀并进行分析。仅当Cl.8细胞在存在更新-转染S2细胞(图。,车道5)。转染S2细胞产生的Upd蛋白如第4栏底部所示。当Cl.8细胞在条件培养基存在下生长时,获得了相同的结果,条件培养基取自更新-转染293T细胞(未显示)。这些数据与我们的假设一致,即Upd是一种细胞外配体,结合膜结合受体激活JAK信号通路。
讨论
在本报告中,我们描述了果蝇属Upd作为胚胎发生期间JAK/STAT信号通路的配体。我们证明了这一点更新突变与与单足蹦跳和stat92E,果蝇JAK和STAT。更新编码一个糖化并分泌的47-kD核心蛋白。分泌型Upd与ECM紧密相关,可由肝素释放。分泌型Upd蛋白能够刺激JAK通路,通过培养细胞中Hop酪氨酸磷酸化的激活来测量。这使我们提出Upd是JAK途径的胚胎配体(图。)。
胚胎发生中JAK途径活性的模型。我们认为Upd是在早期胚胎发育中刺激JAK通路的配体。Upd蛋白是在一组有限的胚胎细胞中产生的,在胚胎细胞中它被糖基化和分泌,并且扩散受到与ECM结合的限制。通过Upd与一个尚未识别的受体结合,刺激了啤酒花JAK,导致Stat92E磷酸化。最终,特定成对规则基因的转录,如前夕,已激活(有关详细信息,请参阅文本)。
Upd是一种分泌蛋白
Upd的分泌性质及其刺激JAK磷酸化的能力强烈表明Upd编码JAK/STAT通路配体的模型。此外,Upd与ECM相关,从而限制扩散并为通路活动提供空间限制。尽管Upd作为JAK途径配体的作用是对这些数据的最简单解释,但不能排除其他模型。例如,可能需要Upd来激活通路的真正配体。然而,Upd与可能参与这种激活的蛋白酶或其他分子没有同源性。或者,Upd可以激活另一条信号通路,最终导致Hop的激活。后一种模型似乎不太可能,因为更新表达和发病前夕第三条和第五条条纹在胚胎中表达。只需几分钟更新和前夕从而几乎没有时间激活中间通路。出于这些原因,我们倾向于最简单的模型,其中Upd是JAK途径的配体,如图所示Upd可能与一个未知的与Hop相关的受体结合。受体聚集会刺激Hop反式-磷酸化,从而激活啤酒花。Stat92E潜在转录因子随后被募集到活化的受体复合物中,被活化的Hop磷酸化,二聚化,并转移到细胞核。Stat92E的活性二聚体随后可能直接刺激一组下游基因的转录,包括前夕以空间受限的方式。以前前夕控制第三条条纹表达的基因被确定为JAK/STAT通路的靶点。该片段携带与哺乳动物STAT结合位点类似的序列,STAT在体外结合Stat92E蛋白(Yan等人,1996b). 如前所述(Hou等人,1996年;Yan等人,1996b),我们假设该途径对前夕表达式由Stat92E直接绑定到前夕增强子,导致基因转录激活。尽管已知Eve蛋白也调节其他配对规则基因的转录,但对其他配对规则的基因的调节也可能同样直接。因此,JAK通路突变对某些配对规则基因的影响可能是夏娃活动减少的次要因素。
Upd的分子性质与先前报道的与更新突变(Gergen和Wieschaus 1986年). Gergen和Wieschaus生成了更新,其中补丁更新突变细胞靠近野生型区域。他们从分析中得出结论:更新基本上是细胞自主的,但他们注意到更新紧邻野生型细胞的突变细胞可以产生正常模式。救援电池的近距离要求表明,Upd产品的扩散活性范围有限。这与Upd蛋白与ECM的紧密结合一致,将配体束缚在其来源附近。将Upd锚定到ECM将提供一种简单的机制,以在空间上限制蛋白质的活性并随后激活JAK/STAT通路。这种情况与其他分泌配体形成对比,这些分泌配体可能在同一发育阶段的卵黄周隙中发现。例如,Toll和Torso受体的配体具有远距离自由扩散的能力(Stein和Nüsslein-Volhard 1992;卡萨诺娃和斯特鲁尔1993)。
Upd在胚胎分割中的作用
对细分机制的广泛研究果蝇属胚胎已经形成了一个完整的人体计划制定顺序步骤模型(英格姆1988;圣约翰斯顿和纽斯莱恩·沃尔哈德1992). 研究表明,母亲的活动可以提供线索,引导特定因子沿前后(A/P)和背腹轴的表达。沿着A/P轴,这些由间隙基因编码的转录因子调节由成对规则基因编码的其他转录因子的空间和时间表达,这些转录因子随后参与调控定义每个片段内细胞状态的片段极性基因。JAK/STAT通路中的Upd是已知最早沿A/P轴作用的分泌型合子因子。除了作为第二对-规则基因的tenascin样分子外(Baumgartner等人,1994年),下一个与A/P模式有关的已知分泌因子由片段极性基因编码没有翅膀的(重量(wg))和刺猬(小时). Wg和Hh编码信号分子,参与建立和维持发育中胚胎的副节段边界(有关综述,请参阅Ingham 1988年). 它们的表达是在细胞化后开始的,在整个胚胎发生过程中,它们是维持边界所必需的。
我们的发现是,一种分泌因子Upd激活JAK/STAT信号通路来调节配对规则基因的表达,例如伊夫,自由贸易区、和矮子,必须集成到此模型中。为了了解JAK/STAT通路的功能,我们使用了前夕作为范例的stripe 3表达(有关审查,请参阅Hou和Perrimon 1997). 前缘和后缘前夕条带3分别通过Hb和Kni蛋白的阻遏而设置。由于Hb和Kni-binding位点参与定义基因表达的清晰开/关边界,而STAT-binding位点参与激活转录,因此我们提出JAK/STAT信号通路不需要在这个域中被空间激活(Hou等人,1996年; 有关查看信息,请参阅Hou和Perrimon 1997). 因此,JAK/STAT途径本身可能没有指导意义,而只是在特定基因的上调中发挥作用,例如前夕,在其调节区域中包含STAT结合位点。根据该模型,与JAK/STAT活性丧失相关的异常突变表型将代表各种分段基因表达的累积缺陷。
我们对早期胚胎的分析表明更新在细胞化之前,最初在广泛的中心结构域中表达,此时前夕受JAK/STAT通路调节。这与之前提出的模型一致,即该途径没有指导意义,但提供了普遍存在的激活系统。后来的限制更新表情有些神秘。的条纹表达模式更新结合Upd活性主要是细胞自主的以及Upd与ECM结合的观察结果,表明JAK/STAT通路在胚层胚胎中局部激活。这表明,与之前的模型相比,此路径的局部激活可能有助于正确分割。Upd蛋白分布分析和早期胚胎中Upd的错误表达研究应提供关键测试来区分这些替代假设。
JAK通路的特异性
在脊椎动物中,JAK/STAT通路可以被多种配体/受体组合激活。除了细胞因子受体外,受体酪氨酸激酶如PDGFR、EGFR和Eyk也被证明可以调节JAK和STAT分子的活性(Vignais等人,1996年;Zong等人,1996年;Yamauchi等人1997). 如果JAK/STAT通路被额外的信号通路激活,人们会认为单足蹦跳或统计92E胚胎将比更新突变胚胎。因为跃点,stat92E、和更新突变体具有相似的表型,我们得出结论,Upd可能是胚胎发生过程中JAK/STAT通路的主要或唯一激活物。
JAK途径果蝇属在合子发育过程中有额外的作用。该途径涉及血细胞发育、各种成体结构的分化、成体翅膀的姿势、精子发生和卵子发生(本研究,佩里蒙和马霍瓦尔德1986;Harrison等人,1995年;Luo等人,1995年;Yan等人,1996a). 这里描述的遗传相互作用研究表明Upd在成虫翅膀姿势和卵子发生中的作用,但在其他发育过程中的作用尚未被研究。需要进一步分析以确定Upd是否是所有这些组织中的唯一配体,或者其他激活剂是否也可以刺激JAK/STAT通路。
Upd和细胞因子信号
在过去几年中,激活哺乳动物JAK通路的分泌分子的列表一直在增长。特别是对于细胞因子,配体及其受体都已确定。情况并非如此果蝇属; 迄今为止,尚未发现与JAK信号激活有关的配体或受体。因此,我们对Upd的表征首次描述了无脊椎动物中利用JAK途径的分子。
Upd和任何已知脊椎动物激活物之间缺乏序列相似性令人感兴趣。但与细胞因子一样,预测的Upd二级结构包括几个α螺旋区延伸。尽管Upd与细胞因子没有序列同源性,但可能α-螺旋折叠成一种让人想起细胞因子的结构。哺乳动物配体中存在与I型细胞因子(例如。,Zhang等人,1997年). 这些分子还利用JAK进行信号转导。虽然特定序列可能没有很强的进化保守性,但配体的一般结构可能会保守性是因为与适当受体结合的功能要求。另一方面,Upd结构的某些方面与细胞因子型分子不太一致。首先,Upd蛋白是非常基本的,预测的pI接近12。其次,与许多细胞因子相比,Upd与ECM相关,这可能限制配体的活性范围。这些特征表明Upd可能是刺激JAK通路的一个新配体家族的代表。Upd和其他JAK激活配体之间关系的确定必须等待其他物种中Upd同源物的鉴定。最后,Upd受体的特性将揭示Upd信号是通过传统受体分子发出的,还是定义了JAK/STAT通路被激活的新机制。
材料和方法
飞行股票
这个更新用于检测胚胎致死性的等位基因有Df(1)os1安培,更新YM55、和更新YC43型(Wieschaus等人,1984年;Eberl等人,1992年)。操作系统1,操作系统o(o)、和操作系统秒如前所述(Lindsley和Zimm 1992年). 附加操作系统等位基因(操作系统4-51-1,操作系统c18号,操作系统N1型、和操作系统109)在F中生成1使用X射线进行筛选(N.Perrimon,unpubl.)。我们用这个名字更新而不是操作系统因为它更准确地描述了我们表征的基因的空表型。
upd的分子鉴定
限制更新基因座由Southern分析确定更新和os等位基因。的远端极限更新基于中断点的位置Df(1)os4-51-1Shaker复合体染色体走行中约370–380 kb处(见图。). 通过节段非整倍体T(1;Y)v29中断点的位置绘制近端界限图Df(1)os欧洲69(Ferrus等人,1990年;Eberl等人,1992年)约410–415 kb。重组子的限制性片段长度多态性(RFLP)分析Df(1)os欧洲69和保时捷中心PB16型与该映射一致(N.Perrimon、D.A.Harrison和E.Wilder,未解释)。
来自λ噬菌体M1I1、M33、E721和EA1的DNA用于探测胚胎期(0-1、1-5、5-9和9-13小时)RNA的Northern印迹。一个4 kb巴姆从M33噬菌体(pUpd9-4)中亚克隆HI片段,并通过随机引物标记以探针cDNA文库。使用的文库是克隆到质粒中的4-8小时胚胎cDNA文库(布朗和卡法托斯1988)以及在λ噬菌体中克隆的8至12小时胚胎cDNA文库(Zinn等人,1988年). 从噬菌体文库中回收了一个克隆,而从质粒文库中又回收了三个克隆。所有三个质粒克隆都是相同的,而噬菌体克隆的5′端稍长。使用Sequenase和Thermo-Sequencease试剂盒(Amersham/U.S.Biochemical)对克隆进行测序。将cDNA的序列与λM33基因组克隆的序列进行比较。EMS诱导的苍蝇DNA更新YM55年和更新YC43型携带的等位基因格式7进行PCR扩增并测序,以鉴定与这些突变相关的特异性病变。
糖基化检测
761个基点囊I–生态的RI片段更新cDNA克隆pBS-GR51被克隆到囊I–生态pRSETB(Invitrogen)的RI位点编码His标记蛋白与Upd羧基末端的融合。融合蛋白的生产和制备如前所述(Harrison等人,1995年)将其注射到大鼠和兔子体内以刺激免疫反应。
60-mm板中的293T细胞转染空白或更新-载体pCG中含有CMV启动子控制的质粒(Natesan等人,1997年)根据制造商的说明使用脂质体(生命科技)。第二天,通过添加70μCi/平板的快速标记混合物(杜邦-NEN)对细胞进行代谢标记6.5小时。加上衣霉素样品,用3μg/ml衣霉素处理相同的时间段。细胞在RIPA缓冲液中溶解[150 m米氯化钠,50米米Tris(pH 8.0),1%NP-40,0.5%脱氧胆酸钠,0.1%十二烷基硫酸钠,1 m米EGTA]加0.5米米PMSF、20μg/ml抑肽酶溶液(Sigma)、3μg/ml亮氨酸蛋白酶、3μg/ml胃蛋白酶抑制素并纺丝。用兔抗Upd抗体免疫沉淀Upd蛋白,并在添加Gammabind G–Sepharose(Pharmacia)后收集和清洗。洗脱的免疫沉淀物在4%–20%SDS–聚丙烯酰胺Novex凝胶上运行,这些凝胶固定,用Amplify(Amersham)处理,并在放射自显影前干燥。
蛋白质定位
Schneider细胞用pD载体中含有upd的构建体转染在60mm平板中(Natesan和Gilman 1995年)或通过磷酸钙共沉淀清空pD载体(Di Nocera和Dawid 1983年). HA标记的结构体在ORF的氨基末端(HA–upd)或羧基末端(Stat92E-HA)包含序列YPYDVPDYA。在检测培养基中是否存在upd蛋白的情况下,转染后第二天用Sf-900 II无血清培养基(Life Technologies)对细胞进行参考,并添加或不添加50μg/ml肝素(Sigma H-9399)。一天后,通过旋转细胞收集培养基,并将其浓缩在Centriprep 10000 MWCO超滤装置(Amicon)中。转染后2天,通过在冰镇PBS中洗涤两次,然后在RIPA缓冲液和如上制备的蛋白酶抑制剂中溶解,获得转染细胞。为了准备ECM,用2米尿素,然后用PBS洗涤几次,然后用90°C莱姆利样品缓冲液收获(Bradley and Brown 1990年)。
为了从细胞裂解物中免疫沉淀Upd,对所有样品使用等量的蛋白质。培养基和ECM中的蛋白质浓度低于检测限,对于这些样品,使用等效体积的培养基或板数进行比较。用兔抗Upd或鼠抗HA单克隆抗体(BabCO)进行上述免疫沉淀。在4%-20%Novex凝胶上进行洗脱的免疫沉淀物,并将其吸附到PVDF膜上(Bio-Rad)。用大鼠抗Upd抗体检测未标记的Upd蛋白,用小鼠抗HA单克隆抗体(BABCO)检测HA标记的蛋白,稀释1/1000,然后用HRP-结合二级抗体(Bio-Rad)稀释1/10000和ECL(Dupont–NEN)检测。
啤酒花磷酸化分析
克隆8细胞在60 mm培养皿中生长至~80%的融合,要么与瞬时转染的施耐德细胞共培养,要么通过磷酸钙共沉淀转染pD-upd或空载体(Di Nocera和Dawid 1983年). 用于共培养的施耐德细胞在100 mm培养皿中转染pD-upd,然后用PBS洗涤,第二天转移到新鲜培养皿中。一天后,将转染的Schneider细胞旋转下来,重新悬浮在克隆8培养基中,并与克隆8细胞共培养3.5小时。轻轻清洗去除非粘附的Schneier细胞和培养基,并如上所述制备这些细胞的RIPA裂解物用于免疫沉淀。
克隆8细胞,无论是共同培养的还是2天前转染的,用含有2 m的冷冻PBS清洗三次米钒酸钠并刮入Triton X-100裂解缓冲液[150 m米氯化钠,10米米Tris(pH 8.0),10 m米EGTA、1%Triton X-100]或RIPA裂解缓冲液加蛋白酶抑制剂和2 m米钒酸钠。当进行涉及相同抗体的免疫沉淀时,使用等量的总蛋白。更新如上所述进行免疫沉淀和检测。用兔抗啤酒花抗血清免疫沉淀啤酒花蛋白(Harrison等人,1995年). 将等量产生的免疫沉淀物装入两条单独的8%SDS–聚丙烯酰胺Novex凝胶中,用于电泳和PVDF印迹,如上所述。用稀释1/1000的大鼠抗酒花抗血清检测酒花蛋白(Harrison等人,1995年)或单克隆抗磷酸酪氨酸抗体4G10(UBI)稀释1/10000,然后HRP-结合二级抗体稀释1/10000和ECL(杜邦–NEN)检测。