脂肪组织中表达核SREBP-1c转基因小鼠的胰岛素抵抗和糖尿病：先天性全身性脂肪营养不良模型

aP2–SREBP-1c转基因小鼠脂肪和肝脏的大体变化

图​图1A1A显示了一只aP2–SREBP-1c转基因小鼠（A系）和一只7天大的野生型同卵鼠的照片。除了轻微的突起外，转基因小鼠肩胛间区还出现了大量的肿块。在所有转基因小鼠中都存在类似的质量。解剖发现，肿块由一个扩大的双叶脂肪垫组成，脂肪垫呈苍白，位于棕色脂肪通常存在的位置（图。​（图1B）。1B） ●●●●。转基因小鼠的颌下腺下棕色脂肪库也增大，颜色苍白。无论是野生型还是转基因小鼠，其幼年期的网膜或皮下白色脂肪都很少。7天龄转基因小鼠的肝脏大而苍白，表明脂肪沉积（图。​（图1C）。1C） ●●●●。在哺乳期存活下来的转基因小鼠体重逐渐增加，除腹部外，其余均正常，腹部因肝脏显著增大而仍然肿胀。这些动物在任何时候都没有出现肥胖现象，它们的体重与非转基因同窝动物没有显著差异（见表​表1）。1). 肩胛间脂肪库仍在扩大，但并没有随着年龄的增长而变大。

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图1

7日龄野生雄性小鼠照片(左边)和一只转基因aP2–SREBP-1c436（a系）雄性同窝小鼠(正确的). (A类)小鼠背视图，显示转基因小鼠肩胛间棕色脂肪垫增大。(B类)肩胛间棕色脂肪垫的背视图。(C类)暴露的小鼠腹部视图，说明转基因小鼠中肥大的脂肪肝。

在7-12周龄时，转基因小鼠的肝脏、脾脏、胰腺和腹部淋巴结显著增大。未发现肾脏、心脏或骨骼肌肿大。网膜脂肪在野生型窝友中很容易看到，而在转基因小鼠中要小得多。图​图22显示了一只典型的转基因小鼠（a系）在12周龄时的肝脏肿大。肝脏的重量是野生型的两倍；它的外表仍然苍白。在野生型小鼠中，帽间脂肪垫具有典型的BAT琥珀色。在转基因小鼠中，双叶帽间脂肪垫明显增大，非常结实，呈白色。另一方面，以附睾脂肪垫为例，转基因小鼠的WAT萎缩，重量仅为野生型脂肪垫的～35%。转基因小鼠（A系）的脾脏、胰腺和腹部淋巴结的重量是同窝对照小鼠相应器官重量的1.5到2倍。

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图2

3个月大的野生型雄性小鼠的肝脏、帽间棕色脂肪、附睾白色脂肪/睾丸(左边)和一只转基因aP2–SREBP-1c436（a系）雄性同窝小鼠(正确的). 野生型和转基因肝脏的重量分别为1.5克和3.9克。野生型和转基因肩胛间脂肪分别重58 mg和110 mg。野生型和转基因附睾脂肪分别重510 mg和160 mg。

8日龄转基因小鼠脂肪和肝脏的组织学变化

对8日龄小鼠器官的组织学分析显示出以下变化（图。​（图3）。三). 在转基因小鼠（a系）的肝脏中，肝细胞肿胀（图。​（图3B）。三B） ●●●●。细胞核仍位于细胞中心，但细胞质呈淡嗜酸性染色，并含有许多微泡空泡，在罕见的肝细胞中，这些空泡结合形成一个独特的单室空泡，取代细胞核的外围位置。整个肝小叶的空泡变化均匀。从B系转基因小鼠中可以看到类似的组织学图像（数据未显示）。一只8日龄野生型小鼠的附睾脂肪垫含有由小而不成熟的脂肪细胞组成的异质细胞群（图。​（图3C，三C、 左）和成熟脂肪细胞，每一个都含有一个大的单细胞液泡（图。​（图3C，三C、 右侧）。相比之下，转基因小鼠的白色附睾脂肪几乎完全由小的未成熟脂肪细胞组成，具有明亮的嗜酸性细胞质和明显的单室空泡（图。​（图3D）。三D） 。转基因小鼠棕色脂肪细胞的细胞质中含有大的单室空泡，类似于未成熟白色脂肪细胞的空泡（图。​（图3F）三F） 与野生型同卵双胞胎棕色脂肪特有的多房小液泡形成对比（图。​（图3E）。三E） ●●●●。

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图3

肝脏组织切片(A、 B类)，白色脂肪(C、 D类)和棕色脂肪(E、 F类)来自一只8日龄野生型雄性小鼠和一只转基因aP2–SREBP-1c436雄性同窝小鼠（苏木精和伊红染色；放大112倍）。(A、 B类)转基因小鼠整个肝脏的肝细胞明显肿胀。细胞质呈淡嗜酸性，含有许多微泡空泡。整个小叶的变化是一致的。野生型和转基因肝脏中均存在散在的造血灶。(C类)野生型小鼠的白色脂肪垫含有由两个小的未成熟脂肪细胞组成的异质性细胞群(左边)和成熟脂肪细胞，每个脂肪细胞都含有一个大的单室空泡(正确的). (D类)转基因小鼠的白色脂肪含有大量未成熟的小脂肪细胞，具有明亮的嗜酸性细胞质和明显的单室空泡。(E、 F类)转基因小鼠棕色脂肪的脂肪细胞显著增大，着色苍白。细胞质被许多小液泡取代，这些小液泡经常合并形成大的单室液泡，类似于未成熟的白色脂肪细胞的液泡。

40日龄转基因小鼠脂肪和肝脏的组织学变化

图​图44显示了一只40天大的转基因小鼠及其野生型同胎鼠肝脏和脂肪的组织切片。在40天龄转基因小鼠中，肝细胞肿胀没有8天龄小鼠明显，并且局限于小叶中心区（图。​（图4B）。4B） ●●●●。没有肝炎或纤维化的证据。40天龄野生型小鼠的附睾脂肪垫含有大小均匀的成熟脂肪细胞，每个脂肪细胞都含有一个特征性的单室脂肪滴（图。​（图4C）。4C） ●●●●。相反，转基因小鼠的附睾白色脂肪包含成熟和不成熟脂肪细胞的混合物，其大小差异很大（图。​（图4D）。4D） 。未成熟脂肪细胞含有丰富的嗜酸性细胞质、圆形细胞核和小而明显的脂肪滴。在一些细胞中，液滴结合形成典型的印戒形态。转基因小鼠的成熟脂肪细胞每个都含有一个独特的单室空泡，但这些细胞在大小上比野生型小鼠的成熟脂细胞表现出更多的异质性。转基因小鼠的一些附睾脂肪垫显示出轻度炎症和纤维化的组织学证据（数据未显示）。野生型小鼠40天时的棕色脂肪由小的多角形多房脂肪细胞组成，这些脂肪细胞被结缔组织基质分隔成小叶（图。​（图4E）。4E） ●●●●。相反，转基因小鼠棕色脂肪中的大多数脂肪细胞明显增大，并含有一个突出的单室脂肪滴（图。​（图4F）。4F） ●●●●。切片中散布着少量未成熟脂肪细胞。棕色脂肪垫显示细胞周围和间隔内的细胞周和小叶间结缔组织增生，有轻微炎症的迹象（图。​（图4F）。4F） ●●●●。

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图4

肝脏组织切片(A、 B类)，白色脂肪(C、 D类)和棕色脂肪(E、 F类)来自一只6周龄野生型小鼠和一只转基因aP2–SREBP-1c436窝鼠（苏木精和伊红染色；放大112倍）。(A、 B类)转基因小鼠的肝细胞肿胀并含有微泡空泡。(C、 D类)转基因小鼠白色脂肪中的脂肪细胞表现出明显的大小异质性。与成熟脂肪细胞混合的是较小的未成熟脂肪细胞，具有明亮的嗜酸性细胞质、圆形细胞核和明显的单细胞液泡。这与野生型小鼠的WAT形成对比，野生型小鼠由大小均匀的脂肪细胞组成，脂肪细胞中充满了巨大的单室空泡。(E、 F类)转基因小鼠的肩胛间棕色脂肪由明显增大的脂肪细胞组成，脂肪细胞中含有较大的单室脂肪滴。间质有轻度慢性炎症的迹象。

野生型和转基因小鼠代谢参数的比较

表​表11比较转基因品系A和B的野生型小鼠和同窝小鼠的相关定量参数。一般来说，B系小鼠的变化与A系动物的变化方向相同，但变化不太深刻。转基因小鼠体重正常，但肝脏明显增大。附睾脂肪垫小，头间褐色脂肪大，肝脏甘油三酯含量明显升高。肝脏胆固醇含量轻度增加，但数值没有达到统计意义。尽管7周龄A系小鼠的脂肪肝明显，但血浆白蛋白、天冬氨酸转氨酶和胆红素水平正常（数据未显示）。喂食状态下的游离脂肪酸水平正常（表​（表1）。1). A系小鼠（7周龄）的血浆胆固醇和甘油三酯水平轻度升高，但显著升高，B系小鼠（11周龄）也有类似的趋势。表中未显示的数据​表1，1，我们研究了四只9-11个月大的A系小鼠。血浆甘油三酯水平显著升高（平均450 mg/dl；范围367-565），与五个同窝对照组相比（平均97 mg/dl，范围75-147）。

靶基因mRNA在脂肪和肝脏中的表达

对A系小鼠mRNA的斑点杂交分析证实，转基因在白色和棕色脂肪中表达，但在肝脏中不表达（图。​（图5A）。5A） ●●●●。我们也没有发现转基因在其他组织中表达的证据，包括脾、胰腺和骨骼肌（数据未显示）。在野生型小鼠中，核提取物的免疫印迹显示白色和棕色脂肪中都含有微量nSREBP-1a或nSREBP-1c。相反，从A系转基因小鼠的白色和棕色脂肪中提取的核提取物显示出丰富的nSREBP-1c，这些组织的nSREBP-1c似乎比正常组织高出许多倍。为了进行比较，我们估计转基因小鼠脂肪组织细胞核中nSREBP-1c的含量大约是野生型小鼠肝脏细胞核中nFREBP-1c含量的两倍。B系小鼠白色和棕色脂肪中nSREBP-1c的表达水平约为A系小鼠的一半（数据未显示）。

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图5

通过斑点杂交测定野生型小鼠（WT）和转基因aP2-SREBP-1c436（A系）小鼠（Tg）肝脏、白脂肪（WF）和棕色脂肪（BF）中各种mRNA的数量。按照材料和方法中的描述，对每个波段的放射性进行量化。在通过测量18S rRNA的量校正负载差异后，计算转基因小鼠的每种mRNA相对于野生型小鼠的倍数变化(A类)从表中描述的七只野生型小鼠中的两只和七只转基因小鼠中的两只（A系）中分离出总RNA​表1。1将RNA混合，并对10μg等分样品进行电泳和杂交³²P标记探针。硬脂酰辅酶a去饱和酶（SCD）探针是一个能同时检测SCD1和SCD2 mRNA的小鼠SCD1 cDNA片段(Shimomura等人，1998年). (B类)从表中描述的其余五只野生型和五只同窝转基因小鼠（A系）中分离出总RNA​表1。1将RNA混合，并对10μg等分样品进行电泳和杂交³²P标记探针。

A系转基因小鼠的白色和棕色脂肪显示，编码LDL受体的mRNA显著增加（分别为11倍和12倍）（图。​（图5A）。5A） ●●●●。编码HMG-CoA还原酶的mRNA也出现类似升高。HMG-CoA合成酶（SREBPs的另一个靶点）的mRNA仅在白色脂肪中升高，仅为2.9倍。在野生型小鼠中，棕色脂肪中脂肪酸生物合成途径（脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶和硬脂酰辅酶A去饱和酶）的mRNA远低于白色脂肪。aP2–SREBP-1c436转基因消除了这种差异，在棕色脂肪中选择性地提高这些mRNA，使其与白色脂肪中的mRNA水平相等。

尽管转基因基因在肝脏中没有表达，但转基因小鼠的肝脏中编码脂肪酸合成酶的mRNA显著增加（6.4倍），编码乙酰辅酶a羧化酶mRNA（2.4倍）和硬脂酰辅酶a去饱和酶的mRNAs显著增加（4.2倍）（图。​（图5A）。5A） ●●●●。其他mRNA的变化都不到两倍。下文讨论了脂肪酸生物合成酶mRNA增加的可能原因。

图​图5B5B显示了对野生型小鼠及其转基因aP2–SREBP-1c436窝鼠白色和棕色脂肪中mRNA表达的更广泛分析。转基因动物的两个脂肪库都显示出与完全分化脂肪细胞相关的三种mRNA的显著减少，即PPARγ、C/EBPα和己二醛。在野生型小鼠中，白色脂肪中的瘦素mRNA含量远高于棕色脂肪中的瘦素mRNA含量。转基因动物的白色脂肪中瘦素mRNA减少了90%，棕色脂肪中已经很低的水平减少了50%。aP2在两个脂肪库中的表达均减少了约50%。在野生型小鼠中，解偶联蛋白1的mRNA(UCP1型)仅在BAT中检测到。转基因小鼠棕色脂肪中该mRNA减少了>95%，达到检测不到的水平。白脂肪和棕色脂肪的四种mRNA显著减少70%-90%，这四种mRNAs编码在胰岛素作用中发挥作用的蛋白质，即胰岛素受体、IRS-1、IRS-2和葡萄糖转运蛋白-4（GLUT4）。转基因小鼠白脂肪和棕色脂肪中内源性SREBP-1的mRNA大约升高了两倍，但SREBP-2的mRNA没有变化。

转基因小鼠的白色和BAT中有两种明显的mRNA升高，即肿瘤坏死因子-α（TNFα）和Pref-1（图。​（图6）。6). Pref-1是一种具有表皮生长因子重复序列的细胞表面分子，其过度表达抑制组织培养中脂肪细胞的最终分化(Smas和Sul 1993年). 转基因小鼠的肌肉、肝脏或脾脏中TNFαmRNA未升高。

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图6

Pref-1 mRNA数量的变化(A类)和TNFα(B类)通过Rnase保护试验测定野生型小鼠和转基因aP2–SREBP-1c436（A系）小鼠。从所示基因型分离的混合样品（见下文）中提取的总RNA等分（20μg）在68°C的溶液中杂交10分钟至³²Pref-1和TNFα的P-标记cRNA探针，均存在β-肌动蛋白的cRNA探针（如材料和方法所述）。RNase消化后，通过凝胶电泳分离保护片段，并在−80°C下暴露于薄膜中16小时。凝胶中的放射性被量化，归一化为β-肌动蛋白信号，并表示为相对于野生型小鼠mRNA水平的折叠变化。(A类)从图中所示的五只野生型（WT）小鼠和五只同窝转基因（Tg）小鼠的白色脂肪（WF）和棕色脂肪（BF）中分离出总RNA。​图5B。5B(B类)从表中所述的七只野生型小鼠中的三只和七只同窝转基因小鼠中的四只的腓肠肌和脾脏中分离出总RNA​表1。1白脂肪和棕色脂肪的总RNA是从A类从图中描述的两个野生型和两个同窝转基因小鼠（A系）中分离出肝脏总RNA。​图55答：。

白脂肪分化障碍

在8天大的时候，即使在野生型小鼠中，白色脂肪也很少，看起来还不成熟。转基因的同窝仔的外观相似。到6周大时，野生型动物的白色脂肪已经形成了正常的成熟外观(斯拉文1979;豪斯曼和理查森1983). 相反，40天龄转基因小鼠的白色脂肪继续类似于第8天看到的未成熟组织。WAT分化阻滞不完全。在仔细的组织学检查中，大多数转基因动物的附睾脂肪垫含有正常的WAT岛。附睾脂肪垫的重量仅为正常体重的30%-40%，并且有视觉证据表明包括网膜和肾周脂肪在内的其他白色脂肪沉积减少。

在转基因小鼠中，Pref-1 mRNA的表达增加反映了WAT的未成熟状态。该mRNA最初是从培养的3T3-L1小鼠前脂肪细胞中克隆的，基于其在未成熟但未成熟细胞中的差异表达(Smas和Sul 1993年). 目前的数据表明，7周龄C57BL/6J×SJL系小鼠附睾脂肪垫中存在低水平但可检测到的Pref-1，在转基因小鼠中其水平提高了四倍。伴随着成熟脂肪组织中许多mRNA的下降。这种下降最显著的是腺苷，而腺苷无法检测到（图。​（图5B）。5B） ●●●●。编码PPARγ、C/EBPα和瘦素的mRNAs也显著下降，但aP2的mRNA却有点令人惊讶的持续性，仅下降了50%。这是偶然的，因为转基因的表达是由aP2启动子驱动的，如果该基因的转录被关闭，转基因就会被熄灭。

nSREBP-1c在阻止小鼠脂肪细胞分化中的作用似乎不同于其在培养的小鼠3T3-L1前脂肪细胞中的作用，后者增加了脂肪细胞的分化。此操作负责其替代名称ADD1(Tontonoz等人，1993年;Kim和Spiegelman 1996). 组织培养中分化的增加被认为在一定程度上是由于SREBP诱导PPARγ活化配体的产生增加，PPARγ很可能是脂类(Kim等人，1998年b). 已知PPARγ的其他激活物，如噻唑烷二酮类，可促进脂肪细胞分化(Spiegelman和Flier 1996). 在转基因小鼠的脂肪组织中，nSREBP-1c的过度表达反常地降低了编码PPARγ的mRNA数量，以及脂肪细胞分化的其他标志物。体内和体外反应之间的差异可能与细胞核SREBP-1c表达的分化阶段有关。

棕色脂肪分化障碍

BAT发生的代谢事件在体内或体外尚未阐明。目前的数据表明，通过nSREBP-1c的强制过表达，有可能将BAT转化为类似于未成熟WAT的东西。

在正常小鼠中，棕色脂肪在胚胎发育过程中分化，而白色脂肪在出生后完成分化(斯拉文1979). 在出生时，nSREBP-1c的过度表达已经导致棕色脂肪库的大规模扩大。到8天大的时候，组织学研究表明棕色脂肪库中含有明显增大的脂肪细胞。mRNA完全消失UCP1（UCP1）BAT的主要分化标记（图。​（图5B）。5B） ●●●●。通常在成熟的棕色和白色脂肪中发现的组织蛋白酶的mRNA在转基因小鼠的两种脂肪组织中都检测不到（图。​（图5B）。5B） ●●●●。在转基因小鼠的棕色脂肪中，编码脂肪酸合成酶的mRNAs升高，因此其轮廓与相同动物的WAT相似（图。​（图5A）。5A） ●●●●。在转基因小鼠的BAT仓库中，未成熟WAT标记Pref-1的mRNA增加了四倍（图。​（图66).

脂肪肝

早在8天大的时候，转基因小鼠的肝脏就被脂肪超载了。脂肪肝的发病机制几乎可以肯定是间接的。aP2增强子/启动子不支持肝脏中的表达(Ross等人，1990年)我们没有发现转基因在这个器官中表达的证据。然而，尽管甘油三酯大量积累，但肝脏中编码乙酰辅酶a羧化酶、脂肪酸合成酶和硬脂酰辅酶a去饱和酶的mRNA水平均升高。转基因小鼠的血浆游离脂肪酸水平没有升高，这支持了肝脏甘油三酯是由内源性合成脂肪酸生成的观点。最有可能的解释是转基因小鼠体内胰岛素水平大幅升高。如果肝脏不具有外周组织的胰岛素抵抗，则可以通过增加脂肪酸的合成来作出反应。

胰岛素抵抗与糖尿病

转基因小鼠中大量胰岛素抵抗的机制尚待阐明。骨骼肌通常被认为是胰岛素介导的葡萄糖处理的主要部位(De Fronzo等人，1981年;McGarry等人，1987年). 然而，我们无法在这些动物的骨骼肌中找到胰岛素抵抗的证据。转基因动物的比目鱼肌对胰岛素反应正常[^三H] 2-脱氧葡萄糖摄取（图。​（图9）。9). 已知胰岛素作用效应物，即胰岛素受体IRS-1、IRS-2和GLUT4的mRNA水平在aP2–SREBP-1c转基因小鼠的骨骼肌中正常（数据未显示）。因此，我们怀疑这些小鼠肌肉中的葡萄糖摄取可能相对正常，胰岛素抵抗可能是由于脂肪组织中葡萄糖摄取减少所致。这表明脂肪组织是胰岛素在小鼠中降糖作用的主要靶点。

aP2-SREBP-1c转基因小鼠的胰岛素抵抗程度与白喉毒素A链组织特异性表达消融BAT的转基因小鼠相同(Lowell等人，1993年;Hamann等人，1995年). 这增加了aP2–SREBP-1c转基因的胰岛素抵抗可能是棕色脂肪细胞功能障碍的结果，这反映在UCP1（UCP1）mRNA。然而，两个模型系统之间的一些差异表明，BAT功能的丧失不能完全解释aP2–SREBP-1c表型。首先，在BAT清除的动物中，胰岛素抵抗在一生中逐渐发展，与渐进性肥胖平行。在6周龄时，BAT清除小鼠的胰岛素水平没有显著升高，但在22至26周时，它们显著升高，当时这些动物肯定是肥胖的。未发现肝脏明显肿大或肥大。相反，在aP2–SREBP-1c转基因患者中，在没有肥胖的情况下，6周时胰岛素抵抗严重，早在8天时肝脏就出现脂肪。

人CGL与aP2–nSREBP-1c转基因小鼠脂肪营养不良的关系

在aP2–nSREBP转基因小鼠中观察到的综合征与人类CGL的某些特征相似，但不是全部(Seip和Trygstad，1996年). 常见的方面包括WAT分化紊乱、严重的胰岛素抵抗、高血糖、脂肪肝肿大、高甘油三酯血症以及某些器官（包括胰腺和脾脏）的体积增大。WAT的分化障碍在小鼠中并不像在人类疾病中那样严重，在人类的疾病中几乎检测不到WAT。在受影响的人类和小鼠中，游离脂肪酸的血浆水平趋于正常，尽管存在严重的胰岛素抵抗，但患者仍无法发展为酮症酸中毒。

CGL患者与aP2–nSREBP-1c转基因小鼠之间最显著的差异与人类疾病中肩胛间肥厚脂肪垫的缺失有关。这可能是因为人类似乎缺乏与小鼠肩胛间棕色脂肪垫类似的独特棕色脂肪库，至少在成年期是如此（有关综述，请参阅福斯特1992). 即使在患有CGL的人类中，也有一些脂肪库幸免于难。研究人员Garg等人（1992年）研究表明，CGL患者的某些脂肪库得以保存，包括手掌、脚掌、舌头、乳房和关节周围区域。这些可能与aP2–nSREBP-1c转基因动物中保存的肩胛间脂肪库类似。

aP2–nSREBP-1c转基因小鼠也没有表现出线性生长加速或某些CGL患者出现的肥厚性心肌病。后一种观察可能与小鼠相对较短的观察期有关。年龄最大的老鼠是9-11个月大。计划对老龄化aP2–nSREBP-1c转基因小鼠的心脏进行进一步研究。

aP2–nSREBP-1c转基因小鼠的潜在机制

脂肪组织中nSREBP-1c过度表达干扰脂肪细胞分化并导致胰岛素抵抗的机制尚待阐明。最简单的假设是，nSREBP-1c增加抗分化因子（如Pref-1）的表达，减少前分化蛋白（如C/EBPα和PPARγ）的表达。这是否是nSREBP-1c对这些启动子的直接作用，或者是nSREBP-1c对其他启动子的次要作用，尚待确定。nSREB-1c似乎明显刺激了几个SREBP应答启动子。白脂肪和棕色脂肪中LDL受体mRNA的数量增加了10倍以上，HMG-CoA还原酶的mRNA也有类似的增加。然而，另一种SREBP-驱动的mRNA，HMG-CoA合成酶，仅略微升高。nSREBP-1c的转录活性必须高度依赖于其他因素，这些因素使其只能选择性地激活一部分含有SRE的启动子。

也可能是nSREBP-1c通过负面作用阻止一个或多个关键基因的转录而干扰脂肪细胞分化。这种可能性的出现是因为nSREBP-1c的转录激活物的活性比nSREBP-1a或nSREBP-2低得多(Shimano等人，1997年a;Pai等人，1998年). aP2–nSREBP-1c转基因编码SREBP-1c的截短版本，该版本直接进入细胞核，不需要蛋白水解。因此，它对限制正常细胞细胞核中nSREBP-1c数量的反馈调节过程具有免疫力。我们的免疫印迹显示，转基因小鼠脂肪组织细胞核中nSREBP-1c的数量比脂肪细胞核中正常的数量高出几个数量级。在如此高的水平下，nSREBP-1c可能与nSREB-1-a或nSREBP-2形成部分活性异二聚体，从而限制其活性。它也可能不加选择地与甾醇调节元件或E盒的子集结合，从而阻止更有效的转录因子的进入。

上述许多假设都容易在转基因小鼠或组织培养实验中进行测试。如果能够发现nSREBP-1c过度表达与脂肪组织分化紊乱之间的联系，这可能有助于我们不仅了解CGL，而且了解人类的其他胰岛素抵抗状态，例如非胰岛素依赖型糖尿病。这也可能增加我们对最近报道的脂肪营养不良、胰岛素抵抗和高脂血症综合征的了解，这些综合征发生在使用HIV蛋白酶抑制剂治疗的艾滋病患者身上(Carr等人，1998年;Viraben和Aquilina 1998).

质粒结构

含有小鼠aP2启动子/增强子的表达质粒(Ross等人，1990年)人类SREBP-1c氨基酸1-436编码序列的上游(Shimano等人，1997年a)按以下三个步骤构建。1.4千字节萨尔从pPEPCK–SREBP-1c中切除编码人类SREBP-1的1–436氨基酸的I片段(Shimano等人，1997年a)并结扎到萨尔pCMV7的I位点(Yokoyama等人，1993年)，包含来自人类生长激素cDNA的多聚腺苷化信号。1.7千字节萨尔I–速度从上述质粒中切下编码人类SREBP-1c的1–436个氨基酸的I片段，然后切下3′聚腺苷酸化信号，末端用DNA聚合酶I（Klenow片段）填充。结果片段被亚克隆到Sma公司包含小鼠aP2基因5.4-kb启动子/增强子的pBluescript II SK（+）载体的I位点（由Bruce M.Spiegelman博士善意提供；Ross等人，1990年). 最终质粒命名为paP2–SREBP-1c436。通过对连接点的DNA测序证实了质粒的完整性。

转基因小鼠

用于产生转基因小鼠的技术已在前面描述过(Yokode等人，1990年). 7.1千字节不是I–克拉paP2–SREBP-1c436的I片段在SeaKem GTG琼脂糖凝胶（FMC Bioproducts，Rockland，ME）上纯化，然后微量注射到C57BL/6J×SJL F2小鼠的受精卵中。共有452个受精卵被微注射不是I–克拉paP2–SREBP-1c436的I片段存活至双细胞期。在52个后代中，11个（19%）整合了来自尾部匀浆DNA的斑点杂交检测到的转基因。这11只创始小鼠接受了部分切除术，根据Northern印迹分析，82%的小鼠产生了人类SREBP-1c436转录本。将转基因表达水平高的小鼠培育成C57BL/6J×SJL F1小鼠，建立并鉴定了两个独立衍生的转基因小鼠系，即转基因aP2–SREBP-1c436（A和B）。

小鼠被安置在集落笼中，并保持14小时光照/10小时黑暗周期。转基因和非转基因同窝小鼠由Harlan Teklad Premier Laboratory Diets（威斯康星州麦迪逊）提供的Teklad4%小鼠/大鼠7001号饮食喂养。

RNA印迹杂交

含有编码小鼠C/EBPβ和C/EBPα序列的质粒来自Steven McKnight(曹等人，1991年). 从Ronald Evans获得编码小鼠PPARγ的质粒(Kliewer等人，1994年). 质粒编码小鼠UCP1（UCP1）是从Leslie Kozak那里获得的(Kozak等人，1988年). 从Morris White获得了一个质粒编码小鼠IRS-2(威瑟斯等人，1998年). 用于分析小鼠18S rRNA的寡核苷酸探针为5′-GCCGTCGTACTATAGCATG-3′(Torczynski等人，1983年).

利用小鼠附睾脂肪多聚体（A）的第一链cDNA，通过RT-PCR制备小鼠腺苷、胰岛素受体、IRS-1和GLUT4的cDNA探针⁺RNA，如前所述，用于其他探针(Shimano等人，1996年). 用于产生这些探针的PCR引物如下。脂肪酶：5′引物，5′-CGAGGCCGGATTCTGTGCCAG-3′；和3′引物，5′-TCGACACATCCGGTAGGATG-3′(Min等人，1986年). 胰岛素受体：5′引物，5′-GTAGCTGATCAACATCCG-3′；和3′引物，5′-CCTGCACACTCTGCAC-3′(Flores-Reveros等人，1989年). IRS-1:5′引物，5′-ATGGCGCCTCCCGGATACCG-3′；和3′引物，5′-CCTCTCCACGCAGAGAGATGCC-3′(Araki等人，1994年). GLUT4:5′引物，5′-CTCCAGCAGCGAGTGACTGGGAC-3′；和3′引物，5′-CCCTGGAGTAGGCCAATGAGG-3′（GenBank AccessionD28561型). 所有其他探针已在前面介绍过(Shimano等人，1996,1997年a,b条). cDNA探针用[α-³²P] dCTP（3000 Ci/mmole）通过使用Megaprime DNA标记系统（Amersham）。

使用RNA STAT-60试剂盒（TEL-TEST'B'，Friendswood，TX）制备总RNA。收集每组小鼠的总RNA，并对10μg的等分样品进行Northern blot分析。过滤器与指示的³²P标记探针（10⁶cpm/ml）在65°C下用Rapid-hyb缓冲液（Amersham Corp.）冲洗2小时，用0.1%SDS/0.2×SSC在65°C下冲洗30分钟，并暴露于反射NEF 496膜（Dupont-NEN，Boston，MA），在−80°C下使用增感屏。通过将过滤器暴露于具有BAS1000 MacBus软件（Fuji Medical Systems）的生物成像分析仪来量化放射性，并将结果标准化为18S rRNA产生的信号。

核糖核酸酶保护试验

从3T3-L1前脂肪细胞多聚体（A）制备的第一链cDNA中，通过PCR扩增小鼠前脂肪细胞因子1（Pref-1）和小鼠TNFα的cDNA片段⁺RNA和小鼠脾脏5′-伸展加cDNA文库（Clontech，Palo Alto，CA）分别带有以下引物。Pref-1:5′引物，5′-GCCGGCTAGCCCCGTGCAGG-3′；和3′引物，5′-AGGTGGTCATGTCAATCTCGG-3′(Smas等人，1993年). 肿瘤坏死因子α；5′引物，5′-GCATGATCCGGACGGAACTGC3′；和3′引物，5′-GCTCAGCCACTCCTC-3′(Caput等人，1986年). 在5′和3′引物中添加Hin公司dIII和生态RI站点。使用SuperscriptII试剂盒（GIBCO-BRL）制备第一链cDNA。

扩增的cDNA片段亚克隆到pGEM-3Zf（+）载体（Promega）中。质粒DNA线性化后Hin公司dIII，用[α]转录反义RNA-³²P] CTP（800 Ci/mmole），使用噬菌体T7 RNA聚合酶（Ambion，Austin，TX）。在每个实验中测量转录RNA的比活性，其范围为1.7–2.6×10⁹除β-actin RNA外，所有RNA的cpm/μg为5.3–8.1×10⁸cpm/微克。

如前所述，使用HybSpeed RPA试剂盒（Ambion，Inc.）对每个样品的等分总RNA（20μg）进行RNase保护试验(Shimomura等人，1997年a,b条). 每个检测管包含一个待测mRNA的cRNA探针，以及一个与β-肌动蛋白mRNA互补的cRNA探头。在制备探针时，我们调整了[α-³²P] CTP提供与测试mRNA相当的β-肌动蛋白信号。RNase A/T1消化后，在8米尿素/4.8%聚丙烯酰胺凝胶，凝胶干燥后使用反射膜和增感屏进行放射自显影（杜邦，威明顿，德国）。如上所述，还使用富士荧光成像仪对干燥凝胶进行定量分析。每个RNA样本中的β-肌动蛋白mRNA水平用于标准化测试mRNA获得的信号。

胰岛素耐受试验

对喂食12周龄（A系）和14周龄（B系）小鼠进行胰岛素耐受性试验。向动物腹腔内注射0.75 U/kg体重（每只小鼠约900 ng）的人胰岛素。在注射前以及注射后15、30和60分钟通过逆行穿刺采血，以测量血糖水平。

我们感谢同事Hitoshi Shimano、Jay Horton、Sarah Comerford、Robert O'Doherty、Robert Grange、Michio Shimabukuro、Denis Mc（c）Garry和Roger Unger的有益讨论和试剂；理查德·吉布森（Richard Gibson）、贝斯·欣纳特（Beth Hinnart）、珊·麦卡（Shan Maika）和马里奥·维拉里尔（Mario Villarreal）为动物研究提供专家帮助；Scott Clark、Robin Craddock和Debra Morgan提供了出色的技术援助；Robert Webb在组织切片方面提供了宝贵的帮助。这项工作得到了国家卫生研究院（HL-20948）、莫斯心脏基金会和佩罗家庭基金会的资助。I.S.是日本东京Manpei Suzuki糖尿病基金会研究奖学金的获得者。S.I.获得了日本国立健康与营养研究所的研究奖学金。

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