果蝇属肿瘤抑制剂PTEN公司通过拮抗Chico/PI3-激酶信号通路控制细胞大小和数量

DPTEN调节细胞数量和大小并影响特定细胞骨架依赖结构的组装

因为动物的强杂合子DPTEN公司等位基因死亡时没有明显的表型，我们利用FLP/FRT系统在杂合动物中生成纯合子突变克隆，进一步研究了该基因的功能(徐和鲁宾1993). 我们找到了两个DPTEN公司等位基因，DPTEN公司¹和DPTEN公司^三，产生的生长表型比直径（2L）170B，染色体缺陷删除DPTEN、Dror、DJNK、和奇科（图。​（图1A）。1A） 。DPTEN公司¹和DPTEN公司^三也表现出类似于缺陷与弱的、非致命的DPTEN公司突变（D.Goberdhan和C.Wilson，不详），表明它们是强的或无效的DPTEN公司等位基因。

成人复眼果蝇属由～700只规则排列的单位眼或小眼组成，每只眼包含相同数量的感光细胞和附属细胞。通过杂合动物同源染色体的体细胞重组，可以在眼睛和其他组织中产生突变克隆。如果只有非突变染色体而不是突变染色体标记有白色(w个⁺)基因突变克隆可以通过缺乏色素来区分。与这些染色体重组后产生的野生型双点，相对于眼睛的其余部分，含有更多的色素，因为该区域的细胞携带两份w个⁺基因。克隆内的Ommatidia纯合子DPTEN公司¹,DPTEN公司^三，或直径（2L）170B眼睛表面被放大和凸出（例如，见图。​图3，三、A、B、D和4、A–C）。Ommatidial小面偶尔融合，在突变区域，尤其是（但不限于）眼睛的后半部分，经常出现形态异常的小面间鬃毛簇或簇状窝（图。​（图3D-F）。三D–F）。评估损失的影响DPTEN公司在细胞数量调节功能方面，我们比较了多个突变克隆和它们的野生型双斑点中的小蜂数量。突变体克隆通常包含至少两倍于相邻双点小马菌的小马菌[突变体组织中小马菌与野生型组织的比率为2.72±0.95(n个 = 58); 例如，见图。​图3A]，三A] ，表明突变细胞过度增殖，这一结果得到了幼虫期克隆分析的支持（参见下文；例如，图。​图7C，7C、 （见下文）。最大的DPTEN公司克隆体包括了一半以上的成人眼睛，并形成了增生性肿瘤样过度生长（图。​（图3C）。三C） ●●●●。然而，与其他几种抑癌基因突变相比，这种增生表型的影响是轻微的果蝇属(Gateff and Mechler 1989年;Xu等人，1995年).

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图3

DPTEN公司调节成人眼睛发育。光显微照片(一)和扫描电子显微照片(B–F类)对于DPTEN公司¹(A、 C–F类)和直径（2L）170B(B类). 与杂合组织相比（白色箭头A–D)，突变区域（黑色箭头；in一，突变区域是不表达w个⁺基因）包含扩大的小腿面和多达四个小腿间鬃毛的异常簇（在高倍镜下观察E类). 突变克隆中的小蜂数量也比相邻的野生型双生点中的多（深色区域表达两个拷贝的小蜂w个⁺基因；用黑色箭头标记一). 猪鬃的厚度、形态和长度不均匀(D–F型; 中较短E类，在F类). 这些鬃毛内肌动蛋白束的排列异常(F类). 苍蝇的基因型为年,w、 hsFLP1；DPTEN公司¹，P[里⁺; hs–新；FRT]40A/P[里⁺; w个⁺]30摄氏度⁺; hs–新；FRT]40安(A、 C–F类)和年,w、 hsFLP1；Df（2L）170B，P[里⁺; hs–新；FRT]40A/P[里⁺; w个⁺]30C，P[里⁺; hs–新；FRT]40安(B类).

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图7

DPTEN公司影响肌动蛋白细胞骨架在发育中的眼睛中的亚细胞定位。面板显示了第三颗恒星幼虫眼睛成像盘的共焦显微照片，其中包含DPTEN公司¹克隆。前部是左边在所有面板中。突变区域的标志是没有lacZ公司(A、 B类)或GFP(C、 D类)表达式(lacZ公司-GFP阳性组织显示为红色），而肌动蛋白元件则由肌动蛋白结合分子指骨样肽（与FITC偶联一和B类和罗丹明C类和D类; 所有面板均为绿色）。覆盖显示在左边侧面。白色箭头(A–C)指向突变区域，它不会被染成红色(一)含有两个未结合细胞的突变克隆的眼盘，位于(左边半个面板）和形态发生沟（黑色箭头）内，以及发育中的commatidial前簇内的后细胞。发展中的商业集群中的肌动蛋白元素在B类.两者一和B类显示堆叠共焦切片，扫描感光体顶端半部分～5μm的深度。与表型上的野生型相邻细胞相比，突变细胞的肌动蛋白微丝分布发生了改变，即在发育中的社区簇中，如B类，在突变细胞中有一个更复杂的微丝网络。C类和D类分别显示大屏幕的低倍和高倍视图DPTEN公司克隆。中的注释C类，野生型双斑点中细胞数量减少（标记有白色箭头的亮红色细胞），方框区域扩大D.D.迪拉姆显示了与野生型组织相比，顶端细胞骨架和相邻微丝的组织结构发生了改变（顶端投影用白色箭头标记）。在某些情况下，同一簇内的野生型和突变型光感受器（用白色箭头标记）似乎分别显示正常和突变表型。

切片显示，小脑细胞的数量和特性在DPTEN公司突变体克隆，表明该基因在确定眼部细胞命运方面没有主要作用。然而，对无色素突变体克隆的分析表明，所有突变体感光体的细胞体都大大增大了，但野生型/杂合型相邻细胞体没有增大（图。​（图4A、C）。4A、 C）。通过使用w个⁺-标记突变染色体以可视化克隆中的色素细胞层，这可能表明该层的体积也增加了（图。​（图4B）。4B） ●●●●。这些细胞生长缺陷解释了突变体小眼座增大的原因。此外，在突变型光感受器中，光敏感杆聚合物的横截面呈椭圆形而非圆形（图。​（图4A-D）。4A–D）。这种表型在几种突变体中观察到，这些突变体被认为会影响肌动蛋白细胞骨架的组装(Fischer-Vize和Mosley 1994;Treisman等人，1997年;Thomas等人，1998年). 对含有野生型和突变型光感受器的小蜂的分析表明，细胞大小和横纹肌体表型都是细胞自主的（图。​（图4C，4C、 插图）。

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图4

DPTEN公司控制单元大小和架构。(A–C)包含克隆组织纯合子的眼睛横截面带DPTEN¹染色体(A、 C类)和aw个⁺ DPTEN公司^三染色体(B类). 在一和C、 w个突变的光感受器可以与它们的表型野生型色素邻接物区分开来（参见图。​图3A）。三A） ●●●●。相反，w个⁺突变色素细胞B类携带两份w个⁺因此，与表型上的野生型邻居相比，它们的色素更丰富。在一和B类、突变组织（黑箭头）和正常杂合组织（白箭头）。虽然突变小蜂的极性基本上不受影响，w个感光细胞体(一; 在该样品中的杂合组织中仅观察到低水平的色素），并且w个⁺色素细胞(B类)缺乏DPTEN公司尺寸增大。还请注意突变的杆蛋白的椭圆形结构。突变型和表型野生型光感受器中的Rhabdomers分别用黑色和白色箭头标记C类.混合基因型的多小眼畸形C类结果表明，对大小和杆状体形态的影响是细胞自主的；这个插入图中显示了单个小眼（黑色箭头），其中存在的两个突变光感受器与两个表型野生型光感受者（白色箭头）一起标记。(D、 E类)含有纯合子克隆组织的翅膀直径（2L）170B(D类; 注意，这只苍蝇还携带DJNK公司基因组拯救构建体pWZ；Riesgo-Escovar等人，1996年)和DPTEN公司¹(E类). 克隆被标记为分叉的突变（未着色区域）。突变细胞扩大，通常交叉静脉无法从野生型组织（白色箭头）延伸到突变区域（黑色箭头），尽管偶尔会观察到额外的交叉静脉（数据未显示）。少数突变细胞含有重复的翼毛（黑色箭头）。苍蝇的基因型为y、 w，hsFLP1；DPTEN公司¹，P[里⁺; hs–新；FRT]40A/P[里⁺; w个⁺]30C，P[里⁺; hs–新；FRT]40安(A、 C类),y、 w个,hsFLP1；P[里⁺; w个⁺]30C、DPTEN^三,P[里⁺; hs–新；FRT]40安培/小时⁺; hs–新；FRT]40安(B类),y、 带，hsFLP1,（f）^第36页; Df（2L）170B，P[里⁺; hs–新；FRT]40A/P[f⁺]30B，P[里⁺; hs–新；FRT]40A；pWZ公司/+ (D类)和年,w、 hsFLP1，第页^第36页; DPTEN公司¹,P[里⁺; hs–neo；FRT]40A/P[f⁺]300亿,P[里⁺; hs–新；FRT]40安(E类).

翅膀中的细胞，通常每一个都有一根翅膀毛，在突变体中也显著增大DPTEN公司克隆（图。​（图4E、F）。4E、 F）。翼毛偶尔会被复制，这是在翼上皮细胞的细胞骨架被破坏的情况下观察到的缺陷(Eaton等人，1996年). 此外，在翅膀中形成交叉静脉，这是一个涉及翅膀上皮细胞和细胞外基质（ECM；Fristrom等人，1993年)，在突变区异常。在～70%的病例中，突变克隆中前交叉静脉缺失或部分缺失，而在～35%的病例中后交叉静脉受到影响（图。​（图4D，E）。4D、 E）。偶尔会观察到额外的翼脉材料（数据未显示）。纵向静脉很少受到影响。

DPTEN和Dp110在调节细胞大小和增殖中起拮抗作用

在哺乳动物中，PTEN通过其PIP3调节细胞生长三-磷酸酶活性(Furnari等人，1998年;前滨和Dixon 1998;Myers等人，1998年;Stambolic等人，1998年). DPTEN也可以类似地调节生长，因为从本研究中使用的cDNA中获得的重组DPTEN蛋白表现出与哺乳动物类似的行为，表现出IP4-和PIP3-磷酸酶活性（I.Pass、G.McConnachie和C.P.Downes，pers.comm.）。

我们对突变株的分析DPTEN公司眼睛和翅膀中的克隆表明DPTEN公司不仅调节细胞数量，而且调节细胞大小，从而导致突变组织的增生生长。有趣的是，Dp110/PI3激酶显性阴性形式的过度表达(Leevers等人，1996年)和突变果蝇属胰岛素受体(Chen等人，1996年)或在奇科/IRS1-4型(Böhni等人，1999年)减少细胞大小和增殖。此外，野生型和活化型Dp110的过度表达产生的大小和增殖缺陷与DPTEN公司突变细胞(Leevers等人，1996年). 这些观察结果与一个模型一致，在该模型中，增长受果蝇属通过特定的磷脂酰肌醇，其水平由DPTEN和Dp110活性的平衡控制。为了验证这一观点，我们研究了增加DPTEN表达是否会影响生长，以及是否DPTEN公司突变与胰岛素受体/Dp110信号通路的成分发生遗传相互作用。

野生型DPTEN公司使用GAL4–UAS系统在翅膀的特定区域过度表达cDNA(布兰德和佩里蒙1993). 最初我们用苍蝇携带dpp（数据处理程序）–GAL4构造(Staehling-Hampton和Hoffmann 1994年)它驱动细胞中的基因表达，这些细胞通常会填充第三和第四纵翼静脉（LIII和LIV）之间的区域。的过度表达DPTEN公司与野生型相比，该地区的面积缩小了近25%（图。​（图5C）。5C） ●●●●。这并不是过度表达果蝇的翅膀尺寸普遍减小的结果，因为LIV和LV之间的相邻翅膀区域基本上不受影响。对翅膀面积的影响与过度表达第110页^D954A型是Dp110的一种显性负性、激酶缺失型（图。​（图5B；5B类；Leevers等人，1996年). 这种减少是由细胞大小和细胞数量减少引起的，与在同一区域过度表达活化的膜相关型Dp110，Dp110–CAAX的效果相反（表​（表1；1;Leevers等人，1996年).

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图5

DPTEN对翅膀中的PI3激酶Dp110具有拮抗作用。(A–C)苍蝇携带的翅膀dpp–镀锌4单独驾驶(一)，或表达一种激酶头，显性负形式的第110页,第110页^D954A型(B类;Leevers等人，1996年)，或野生类型DPTEN公司(C类)在…的控制下dpp–镀锌4(Staehling-Hampton和Hoffmann 1994年)，在翼脉LIII和LIV之间表达GAL4（箭头；翼脉LI至LV标记为一). 这些翼脉之间的面积（称为区域I）在这两种情况下都减少了约25%B类和C类（见表​表1）。1). (D–F型)单独携带MS1096驱动程序的苍蝇翅膀(D类)或表达第110页^D954A型由MS1096驱动程序控制(E、 F类)GAL4在翅膀中表达，特别是在背表面(Leevers等人，1996年;Capdevilla和Guerrero 1994年)从而减少了机翼面积E类超过30%。在F类，苍蝇也是杂合子DPTEN公司¹，部分抑制该表型。机翼面积比E类25%抑制减少的翅膀表型（见材料和方法）。苍蝇的基因型为w；Sp公司/+;P[周⁺; dpp–GAL4]/+ (一),w；P[周⁺; UAS–第110页^D954A型]/P[周⁺; dpp–GAL4](B类),w；P（w）⁺; UAS–DPTEN（FF20.2）]/Sp；P[周⁺; dpp–GAL4]/+ (C类),w个,P[周⁺; MS1096–镀锌4]/w(D类),w、 P[周⁺; MS1096–GAL4]/w；P[周⁺; UAS–第110页^D954A型]/+ (E类)、和w、 P[周⁺; MS1096–GAL4]/w；DPTEN公司¹/+;P[周⁺; UAS–第110页^D954A型]/+ (F类).

为了测试DPTEN的生长调节功能是否主要由其对胰岛素受体–Dp110信号通路的作用而非独立的信号级联介导，我们研究了DPTEN公司突变表型的等位基因与奇科和第110页因为IRS1–4同源物Chico被认为只传输来自果蝇属胰岛素受体(Böhni等人，1999年)，预计Dp110活性和PIP3产量应减少，但不会在奇科突变体。如果DPTEN在Chico下游通过将大多数新合成的PIP3转化为PIP2来对抗Dp110DPTEN公司即使在奇科突变体。

在眼睛克隆中，特异性纯合子奇科等位基因或缺陷，干膜厚度（2L）147F和直径（2L）41C，消除了奇科，bsk，在后一种情况下德罗尔活动（图。​（图1A），1A） ，相对于孪生点，细胞的大小和数量显著减少(Böhni等人，1999年; 数据未显示）。事实上，重组产生的大多数孪生点与可见的突变克隆无关（参见Böhni等人，1999年供讨论）。相反，如上所述，细胞纯合子直径（2L）170B，为空的缺陷奇科,DJNK、Dror、和DPTEN公司功能几乎与特异性突变细胞一样扩大DPTEN公司等位基因（图。​（图3B三B和​和4E）。4E） ●●●●。在这些克隆中观察到的外部过度生长表型（例如，见图。​图3B）三B） 在苍蝇身上也没有看到DPTEN公司基因组构建，viv1（图。​（图1A），1A） 证明了DPTEN公司功能在产生这种表型中起着重要作用。多行证据表明，其他两个基因在这种缺陷中被删除，DJNK公司和德罗尔，在抑制奇科表型。首先，如上所述，在干膜厚度（2L）41C眼睛内的克隆并不影响奇科表型；克隆体很小，通常在外部看不到。此外，DJNK公司在细胞生长控制和德罗尔是一种神经特异性基因(Wilson等人，1993年)，预计这不会对机翼等结构的增长产生总体影响。最后，两者都不是DJNK公司基因组构建体（即，见图。​图4D）4D） 也不是德罗尔基因组构建（数据未显示）对由直径（2L）170B缺乏。这些结果表明DPTEN公司是上位的奇科，强烈支持DPTEN在调节Chico依赖性生长促进信号中的作用。

如果DPTEN与Dp110作用相反以控制生长，则DPTEN和Dp110共存应抑制后者的促生长作用。当野生型第110页使用雕刻的(英语)–镀锌4司机（来自英国剑桥威康/CRC研究所的a.Brand的礼物），几乎所有的动物都以幼虫或蛹的形式死亡，而那些幸存下来的动物翅膀扭曲褶皱。这些机翼的后室相对于前室显著增大（图。​（图6B）。6B） ●●●●。的过度表达DPTEN公司使用相同的驱动程序也会降低存活率，但在20%的从蛹中羽化的苍蝇中，后室的大小显著减小（图。​（图6C）。6C） ●●●●。过表达这两个基因的苍蝇比单独表达这两种基因的苍鼠存活率要高得多（>95%的蛹隐匿）。此外，与只过度表达的动物相比，翅膀后室的面积几乎减少了DPTEN公司（图。​（图6D；6D类；材料和方法），表明DPTEN公司完全抑制第110页在这个系统中。

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图6

DPTEN公司完全抑制过度表达的促生长活性第110页在机翼上。苍蝇携带的翅膀英语–GAL4只有驾驶员(一)或过度表达第110页(B类),DPTEN公司(C类)或两者兼而有之第110页和DPTEN公司(D类)低于en–GAL4/UAS控制机翼后部。隔室边界位于LIV正前方；因此，后部隔室包括翼静脉LIV和LV（以一并在其他面板上用箭头标记）。尽管Dp110过度表达产生的翅膀皱缩变形，但值得注意的是，与前房相比，其后房扩大，这是LIV和LV之间最明显的表现，该区域在过表达DPTEN和过表达DPTEN和Dp110的组合的苍蝇中减少。苍蝇的基因型为w；P[周⁺; 英语–GAL4]/+ (一),w；P[周⁺; UAS–Dp110]/P【w⁺; 英语–GAL4](B类),w；P[周⁺; UAS–DPTEN]/P【w⁺; 英语–GAL4](C类)、和w；P[周⁺; UAS–第110页]，P[周⁺; UAS–DPTEN]/P【w⁺; 英语–GAL4](D类).

最后，我们还观察到DPTEN公司突变主要改变了几种不同等位基因组合中Dp110诱导的表型。例如，在特定于机翼的GAL4驱动器MS1096的控制下，激酶头型Dp110的过度表达导致机翼面积减少30%(Leevers等人，1996年). 这在杂合果蝇中被部分抑制DPTEN公司¹或直径（2L）170B（图。​（图55D–F）。

综上所述，这些数据表明，DPTEN通过拮抗Chico/Dp110信号传导来控制体内生长，并且与DPTEN主要通过去磷酸化生长调节剂PIP3发挥作用的模型一致。我们得出结论，发育期间DPTEN和PI3-激酶活性的比率是苍蝇生长的关键调节决定因素。我们的结果为以下假设提供了重要的体内支持：PTEN公司-相关癌症和显性遗传疾病是这些疾病生长缺陷的基础。

DPTEN是一种高度进化保守的脂类和蛋白磷酸酶

预测的DPTEN蛋白与其人类对应物具有相当大的同源性。相似性超出了高度保守的氨基末端张力蛋白和磷酸酶结构域，延伸到分子的羧基末端一半（图。​（图2），2)，在酵母和秀丽线虫PTEN同源物。这个羧基末端区域目前没有明确的功能，但它受到一些错义突变的影响，这些错义突变与癌症和人类显性遗传病有关（有关综述，请参阅Maehama和Dixon 1999). 显然，该区域可能具有调节作用或将PTEN分子定位于适当的细胞隔室。然而，在这种情况下，需要注意的是，人类PTEN的羧基末端与PDZ结构域的已知结合位点相似(Teng等人，1997年)，在DPTEN中不保守。

DPTEN在发育过程中调节细胞大小和数量

我们发现了几个非补体突变，通过缺陷定位，这些突变位于DPTEN公司基因。我们在本研究中使用的其中两种突变表现出类似于DPTEN公司因此可能是强等位基因。与DPTEN公司缺乏，这些突变会在胚胎晚期和一龄幼虫早期发育期间导致死亡。这种致命性是由DPTEN公司基因组位点和热休克的低水平表达DPTEN公司在非诱导温度下构建cDNA，证明互补基团与DPTEN公司.

因为DPTEN公司突变动物死亡时没有明显的表型，我们通过诱导突变克隆来研究该基因在发育期幼虫中的功能。成人眼睛和翅膀的分析表明DPTEN公司减少细胞大小，这一结果得到了野生型基因在翅膀中过度表达的实验的支持。影响DPTEN公司在眼睛内的克隆体中最为明显，突变体光感受器大小的几倍增加会扭曲高度有序的ommatidial阵列。眼睛中多种细胞类型的生长受到影响，包括色素细胞和所有感光细胞，这表明DPTEN公司是细胞大小的一般调节器。

在眼睛内，纯合子中的细胞数量DPTEN公司突变克隆始终大于相关野生型双斑点中的细胞数量，这表明DPTEN公司还通过调节细胞数量影响组织生长。我们对DPTEN在翅膀中过度表达的影响的分析支持了这一结论，翅膀中的细胞大小和数量都减少了。因为DPTEN公司突变克隆中的细胞数量似乎也超过了幼虫眼视盘上对应的双生点，这些对细胞生长的影响可能至少部分是由增殖率的变化引起的，这一结论也在对奇科突变体(Böhni等人，1999年).

DPTEN通过拮抗Chico/Dp110信号通路调节组织生长和体型

在哺乳动物细胞培养中，PTEN已被证明通过其脂质磷酸酶活性调节细胞增殖和存活，该活性将PIP3转化为PIP2(Furnari等人，1998年;Stambolic等人，1998年). 这里提出的一系列遗传实验表明，在活蝇中，DPTEN通过拮抗Dp110/PI3-激酶（一种将PIP2转化为PIP3的酶）的作用而影响细胞大小和数量。

我们已经证明纯合子的表型DPTEN公司突变细胞与过度表达组成激活型Dp110的细胞的生长表型非常相似(Leevers等人，1996年). 此外，在翅膀中过度表达显性负性形式的Dp110的影响（图。​（图5B）5B） 可以通过过度表达野生型DPTEN进行现象复制（图。​（图5C）。5C） ●●●●。DPTEN公司突变显示显性负性Dp110过度表达诱导的翅生长表型显著显性抑制。此外，DPTEN的过度表达（在英语-GAL4驱动因子）完全抑制过表达Dp110的促生长活性。然而，DPTEN在体内对胰岛素信号的促生长效应进行负调控方面的重要性在两种基因的纯合克隆突变中得到了最好的说明奇科和DPTEN公司在这些克隆中，生长表型降低通常见于奇科突变细胞完全被与细胞丢失相关的过度生长表型所掩盖DPTEN公司这表明DPTEN在Chico下游正常情况下在维持非增生水平的促生长信号方面起着关键作用。

Böhni等人（1999）最近的研究表明，胰岛素受体信号控制果蝇属。我们的数据扩展了该模型，并表明该途径中DPTEN和Dp110活性的平衡是苍蝇生长的关键决定因素（图。​（图8）。8). 虽然我们不能排除这些分子的蛋白底物在这一过程中发挥作用的可能性，但似乎Dp110和DPTEN主要通过控制磷脂酰肌醇生长调节剂PIP3的水平发挥作用。

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图8

Dp110和DPTEN拮抗作用模型示意图果蝇属增长控制。在哺乳动物中，果蝇属、和秀丽线虫PI3-激酶活性由包括胰岛素受体和IRS1-4的信号级联调节(Chen等人，1996年;Maehama和Dixon 1998;Ogg和Ruvkun 1998;Böhni等人，1999年). 小鼠体内此途径的中断(贝克等人，1993年;Liu等人，1993)和果蝇属(Böhni等人，1999年)显示胰岛素受体信号控制组织和身体大小。我们的数据表明，DPTEN可拮抗苍蝇的这一途径，并减少细胞大小和数量。似乎DPTEN的影响主要是通过降低PIP3水平及其假定下游靶点（包括Dakt1）的活性来介导的。然而，DPTEN的蛋白磷酸酶活性也可能发挥作用（参见Gu等人，1999年). DPTEN似乎还通过目前尚未表征的机制（虚线）调节肌动蛋白细胞骨架的组织，这些机制可能涉及其蛋白质或脂质磷酸酶活性。DPTEN对细胞骨架的影响可能通过调节细胞扩散和侵袭性等过程影响其抑瘤活性。

我们的表型分析支持这样一种观点，即Chico/Dp110/DPTEN调节的生长控制信号（由胰岛素受体激活刺激）与其他几种影响苍蝇细胞增殖的信号表现不同。例如，E2F是细胞增殖的积极调节因子，在翅膀中过度表达会增加细胞数量，但似乎不会影响蛋白质合成速率，因此会导致细胞尺寸的相应减小，因此翅膀面积不会受到影响(Neufeld等人，1998年). 相反，相对于DPTEN，Dp110活性水平的增加会导致细胞数量和生长增加，这一表型很容易在细胞的高度组织结构中评分果蝇属翅膀和眼睛。对缺乏胰岛素信号级联成分的小鼠的分析（例如。，贝克等人，1993年;Liu等人，1993年)提示该途径也控制哺乳动物的组织生长。然而，目前尚不清楚这些动物的细胞大小和增殖是否受到影响，也不清楚在患有遗传缺陷的人类中是否受到影响PTEN公司.

DPTEN影响多种细胞类型的肌动蛋白细胞骨架组织

进一步分析DPTEN公司翅膀和眼睛中的突变细胞使我们对该基因在发育中的功能得出了两个进一步的结论。第一，DPTEN公司通常在细胞命运规范中没有作用。这与有关PTEN公司突变小鼠胚胎，早期模式缺陷已被观察到(Di Cristofano等人，1998年;铃木等人，1998年)尽管这些表型的细胞基础尚未确定。也许PTEN的磷酸酶活性是控制这些胚胎模式的特定细胞-细胞或细胞-基质通讯事件所必需的。同样DPTEN公司飞翼中的突变克隆可能是这样解释的。损失DPTEN公司苍蝇的功能总是产生增生性生长，而不是肿瘤性生长。相反，Di Cristofano等人（1998年）发现胚胎干细胞纯合子突变PTEN公司可以在嵌合小鼠中形成肿瘤。然而，这些细胞可能携带导致这种表型的其他基因突变。

第二个显著特征是DPTEN公司突变细胞表现出与肌动蛋白细胞骨架组织缺陷一致的表型。成年克隆中观察到的鬃毛、横纹肌体和翼毛表型表明，细胞骨架可能在许多细胞类型中受到影响，我们对眼睛成像盘的分析表明，缺陷在这些细胞的发育早期出现。一个有待检验的有趣假设是，这些对细胞骨架的影响可能通过控制细胞表面的扩散和形状变化，在调节细胞生长方面发挥重要作用。很有意思的推测是DPTEN公司功能可能改变外周肌动蛋白细胞骨架、质膜和细胞外基质之间的通讯，从而影响细胞的侵袭性，正如哺乳动物细胞培养的研究所表明的那样(Tamura等人，1998年). 为了解决这个问题，我们目前正在调查DPTEN公司在发育过程中可以调节几种细胞类型的细胞迁移或侵袭性。

有趣的是，在发育中的眼睛或翅膀中过表达组成激活型Dp110似乎不会产生类似于DPTEN公司突变细胞(Leevers等人，1996年; 数据未显示），表明DPTEN公司-相关的突变缺陷可能不是由PIP3水平增加引起的。然而，这些观察结果并没有消除DPTEN通过局部产生已知的细胞骨架调节因子PIP2来调节细胞骨架组装的可能性(托克1998)Dp110活性增加可能会增强而非抑制这一过程。与这个想法一致，显性负性Dp110的过度表达会降低PIP3，从而可能抑制DPTEN产生局部PIP2，这确实会导致蛹感光细胞顶端细胞骨架的缺陷(Leevers等人，1996年). 相反，哺乳动物细胞培养中的过度表达研究表明PTEN的蛋白磷酸酶活性参与了局部黏附处细胞骨架的分解(Tamura等人，1998年). 在苍蝇身上进行的进一步实验，包括使用DPTEN突变蛋白拯救细胞骨架缺陷，该突变蛋白特异性缺乏脂质磷酸酶活性，应阐明DPTEN的哪种催化活性在这些发育功能中是重要的。

DPTEN等位基因的产生

使用标准程序用乙基甲基磺酸盐生成突变等位基因(阿什伯恩1989).DPTEN公司¹在野生型Canton S染色体上诱导，随后重组到P[FRT]40安染色体(徐和鲁宾1993)，而DPTEN公司^三是在上诱导的P[周⁺]30C功率[FRT]40A染色体（有关基因型的详细信息，请参见图。​图3三和​和44).

DPTEN的分子表征

DPTEN公司-从果蝇属基因组文库（由德克萨斯州休斯顿贝勒医学院R.Davis构建）位于λDASH II（Stratagene），使用德罗尔cDNA探针（图。​（图1A；1A；Wilson等人，1993年).DPTEN公司cDNA随后从第三恒星幼虫脑cDNA文库中分离得到(Wilson等人，1993年). 几个独立的DPTEN公司对两条链上的基因组和cDNA克隆进行测序。寡核苷酸引物由Oswel DNA Service（UK）和MWG-Biotech UK Ltd.合成。DNA序列分析由Charing Cross和Westminster医学院高级生物技术中心进行。序列数据使用GCG软件包（威斯康星大学，麦迪逊分校）进行汇编。

一种推定的全长cDNA（克隆5C），包括整个DPTEN公司开放式阅读框（ORF）（图。​（图1B）1B） 主要用于本研究。该cDNA长度为2.2 kb，主要ORF上游294 bp，下游397 bp。另一个提前终止的cDNA（克隆6C）和一个截短的DPTEN公司来自EST数据库（GM01261）的cDNA从3′上游翻译区（UTR）向5′方向分别延伸到基因组序列中的1396和1655位置（图。​（图1B）。1B） ●●●●。序列分析显示，这两个转录物中的前一个是交替剪接的，删除了外显子11，导致概念DPTEN蛋白的短羧基末端延伸（图。​（图1B）。1B） ●●●●。与DPTEN公司基因组序列（图。​（图1B），1B） cDNA克隆显示以下多态性：第91位，A→C（克隆5C）；907，C→A（5C）；1159，C→A（5C）；1645年，T→C（5C）；3001–3009，删除（5C、6C，非GM01261）；3504，C→A（5C，6C）；3557，C→T（GM01261）；3603，T→G（5C）。一些cDNA还具有扩展的3′UTR（到4203而不是4197；5C，6C）。只有多态性缺失改变了编码的DPTEN蛋白。The sequences of theDPTEN公司基因组位点、cDNA克隆5C和cDNA克隆6C已以登录号存放在GenBank数据库中AF201904型,AF201905型和AF201906型分别是。

PILEUP程序生成比对，Boxshade程序突出显示保守氨基酸(www.isrec.isb-sib.ch/software/BOXform.html)，但A→S和W→Y未被视为保守变化。

种系转化与拯救实验

基因组拯救构建体vivI是通过亚克隆6.3kb基因组产生的不是I–萨尔I片段（图。​（图1A）1A） 转换向量pW8(灰烬燃烧器1989). 基因组不是I位点来自侧面的λDASH II序列。对于热冲击结构，可用时间最长DPTEN公司cDNA（克隆5C），编码DPTEN的短形式（参见结果；图。​图1B），1B） ，被克隆到不是我修改了站点热休克蛋白70pCaSpW18中的构造，pCaSpeR衍生物(阿什伯恩1989). 将这些构建物的Qiagen DNA制备物显微注射到切割阶段w；K pp P[Δ2-3]99B胚胎。对于这两种结构，至少有三条独立线路挽救了所有潜在的DPTEN公司等位基因在25°C下的存活率，基因组构造提供了较高比例的获救苍蝇。

克隆分析

纯合子DPTEN公司利用FLP/FRT系统生成突变克隆(徐和鲁宾1993)并以缺少（或重复）w个⁺在成人眼中构建，分叉的⁺在机翼和lacZ公司或GFP在幼虫影像盘中的表达。在产卵后24到72小时之间，通过37°C下1小时的热休克（AEL）诱导重组。在24到48小时之间由热激诱导的突变克隆较大（通常至少为50到100个小蜂），并且通常包含的小蜂数量至少是孪生点的3到4倍。其中许多克隆体延伸到眼睛的边界之外，因此不包括在本文中讨论的ommatidial数分析中。s.e.m.公司。成人眼切片按标准程序进行。根据徐和鲁宾（1993）.

我们感谢Y.He和H.Bellen生产转化剂；E.Hafen、H.Bellen、D.Strutt、A.Brand和布卢明顿蝇种库存中心；K.Beckingham在出版前提供苍蝇菌株；I.Pass、G.McConnachie和C.P.Downes沟通未公开的数据；以及U.Weber和R.Newsam提供技术援助。D.C.I.G.感谢V.R.Goberdhan的支持和建议。本研究得益于SEQNET设施的使用。C.W.实验室的工作得到了生物技术和生物科学研究委员会以及Wellcome信托基金的资助。

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