Bmi-1通过INK4a/ARF抑制c-Myc诱导的凋亡，从而与c-Myc在肿瘤发生中协同作用

Bmi-1通过下调ink4a–ARF抑制Myc诱导的MEFs细胞凋亡

c-Myc诱导的Eμ–细胞凋亡增加myc；体重指数-1^+/−小鼠以及由此导致的前B细胞扩张的减少和这些小鼠对淋巴瘤的敏感性降低，表明Bmi-1抑制c-Myc诱导的凋亡，这是它们在肿瘤发生中合作的基础。为了在更明确的条件下研究这一假设，我们分析了c-Myc在过度表达Bmi-1的原发性MEF中诱导凋亡细胞死亡的能力。在低血清和高血清条件下，过度表达不同水平Myc的野生型MEF（见材料和方法）迅速发生凋亡（图。​（图2A）。2A） ●●●●。然而，感染体重指数-1-编码逆转录病毒，与对照感染的MEFs相比，表明Bmi-1的过表达抑制c-Myc诱导的细胞凋亡（图。​（图2A）。2A） ●●●●。

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图2

Bmi-1与Myc协同抑制c-Myc诱导的细胞凋亡并强烈促进增殖ink4a–ARF-依赖方式。(A类)野生型MEFs在第1代用对照（C）或体重指数-1（B） 编码逆转录病毒，在第2代与任一对照，myc公司ER或myc公司HA编码逆转录病毒并通过台盼蓝排除法分析细胞活性。myc公司在存在（圆形）或不存在（方形）125 n的情况下，将ER过表达细胞群转移到0.1%血清后0、24和48小时，分析细胞死亡情况米4欧姆(左边).myc公司将HA过表达细胞转移到0.1%（圆形）或10%（方形）血清中后0、24和48小时，分析其细胞死亡情况(正确的). 在整个实验期间，控制感染的培养物存活率>95%（未显示）。亚倍体DNA含量细胞的流式细胞术分析证实了细胞凋亡。(B类)野生型或ink4a–ARF^−/−MEF在第1代感染对照组（C，黑条）或体重指数-1（B，灰条）-编码逆转录病毒，随后在第2代与对照或myc公司ER逆转录病毒。感染后，将细胞转移到0.1%的血清中24小时后分析亚倍体DNA含量(左边)或在125n存在下转移至0.1%血清后0、16和26小时通过台盼蓝排除法检测细胞活力米4欧姆(正确的). （□+/+C；█ +/+B类；○ −/−C类；●−/−B.）(C类)野生型生长曲线(左边)或ink4a–ARF^−/−MEF公司(正确的)在第1代感染对照（C）或体重指数-1（B） 编码逆转录病毒并在第2代进行控制或myc公司HA编码逆转录病毒。实验进行了至少三次，产生了高度可重复的结果（所有标准偏差都在所示平均值的10%以内），并且通过使用myc公司ER逆转录病毒在没有4-OHT的情况下。（□控制C；█ 控制B；○ MycHA C；● MycHA B）

Myc诱导的部分凋亡是通过p19arf介导的，并且显示依赖于p53(Zindy等人，1998年). 由于Bmi-1是p16和p19arf表达的负调控因子，我们分析了Bmi-1通过下调细胞因子的表达在多大程度上抑制Myc诱导的凋亡ink4a–ARF为此，早期传代中Myc诱导的凋亡水平ink4a–ARF^−/−原发性MEF和Bmi-1过度表达ink4a–ARF^−/−比较MEF。正如预期，ink4a–ARF^−/−MEF对p19arf和p16都有缺陷(Serrano等人，1996年)，显示对Myc的凋亡反应减弱（图。​（图2B2B和​和4A，4A、 （见下文）。相反，Bmi-1在ink4a–ARF^−/−与Myc诱导的凋亡相比，MEF并没有导致对Myc诱导凋亡的敏感性进一步显著降低ink4a–ARF^−/−含有内源性Bmi-1水平的MEF（图。​（图2B）。2B） ●●●●。这表明Bmi-1抑制c-Myc诱导的细胞凋亡的大部分能力取决于功能性p19arf/p16。

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图4

剂量效应ink4a–ARF^+/−MEF公司。(A类)墨迹4a–ARF^+/−在Myc过度表达方面，MEF的增殖速度快于野生型MEF。野生型生长曲线(^+/+),ink4a–ARF^+/−(正确的)、和ink4a–ARF^−/−(左边)MEF感染myc公司ER病毒，存在（填充符号）或不存在（开放符号）250n米4欧姆。GFP表达分析和Western分析证实野生型和ink4a–ARF^+/−MEF公司。(B类)ink4a–ARF^+/−MEF更容易通过myc公司和ras（拉斯维加斯）致癌基因。第一代野生型，ink4a–ARF^+/−、和ink4a–ARF^−/−MEF感染了对照组或ras（拉斯维加斯）^V12版本-编码逆转录病毒并随后感染对照或myc公司HA逆转录病毒，然后分析细胞在软琼脂中的生长情况。在软琼脂中培养2周后拍摄照片。使用myc公司ER病毒在没有4-OHT的情况下，除了菌落较小外。(C、 D类)ink4a–ARF^+/−;ras/myc转化的菌落保留了野生型ink4a–ARF等位基因和野生型p53。(C类)野生型（WT）和突变型（KO）的PCR分析ink4a–ARF16个测试中9个的等位基因ink4a–ARF^+/−;ras/myc软琼脂集落，在电镀2周后从琼脂中取出，直接进行DNA分离和PCR。仅发现一例患者出现LOH。从野生型中分离出的DNA，ink4a–ARF^+/−、和ink4a–ARF^−/−MEF作为控制(D类)突变型p53蛋白的Western blot分析墨迹4a–ARF^+/−;ras/myc软琼脂菌落，在平板后1.5周从琼脂中取出，在裂解前膨胀1.5周。根据标准3T3协议（通道1)含有突变型p53，但主要为野生型MEF（车道2)和12个测试中的6个ink4a–ARF^+/−;ras/myc集落（泳道3–8)没有。微管蛋白水平分析作为负荷控制。(E类)野生型和非野生型p19arf的诱导ink4a–ARF^+/−MEF感染myc公司ER病毒，在有（+）或无（−）250 n的条件下培养米4欧姆。

在一组过度表达Myc并保持在10%血清条件下的成纤维细胞中，增殖增强和凋亡之间存在平衡(Evan等人，1992年;Zindy等人，1998年). 由此产生的净增殖率可以通过对抗Myc诱导的凋亡而提高。在我们手中，在高血清条件下过度表达Myc的MEF的净增殖率与对照感染的MEF相似（图。​（图2C）。2C） ●●●●。Bmi-1过度表达的MEF增殖速度快于对照细胞(Jacobs等人，1999年). 引人注目的是，当Bmi-1和Myc共存时，在野生型MEF中可以看到增殖率的协同增加（图。​（图2C）。2C） ●●●●。此效果需要功能ink4a–ARF，因为在ink4a–ARF^−/−MEF过度表达Myc和Bmi-1（图。​（图2C）。2C） ●●●●。Bmi-1和Myc表达水平的Western blot分析显示，在受感染的野生型和墨迹4a–ARF^−/−MEF（图。​（图3B；三B类；数据未显示）。综上所述，这表明Bmi-1和Myc过度表达对MEF增殖能力的协同作用主要通过以下途径介导ink4a–ARF.

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图3

(A类)Myc和Bmi-1诱导MEF转化。用对照或体重指数-1-编码逆转录病毒并随后进行控制或myc公司-编码逆转录病毒。(B类)Bmi-1抑制Myc对p19arf的诱导。Western blot显示首先感染对照组（C）或bmi-1型（B） 逆转录病毒和随后的对照，myc公司HA，或myc公司ER逆转录病毒。微管蛋白水平作为负荷控制。Bmi-1的过度表达导致p16和p19arf水平的下调，而MycHA或MycER的过度表达（在没有4-OHT的情况下）诱导p19arf而非p16。Bmi-1和Myc的联合过表达完全消除了Myc对p19arf的诱导作用。

Bmi-1通过抑制Myc介导的p19arf上调与Myc协同转化

为了研究Bmi-1和Myc的联合过度表达除了增加细胞增殖外，是否还可以转化原代MEF，我们分析了它们在半固体培养基中的生长能力。野生型感染，ink4a–ARF^+/−、和ink4a–ARF^−/−有控制权的MEF或体重指数-1-编码逆转录病毒不会引起转化（图。​（图3A）。三A） ●●●●。仅转化Myc的过度表达ink4a–ARF^−/−，但不是ink4a–ARF^+/−或野生型MEF（图。​（图3A三A和​和4B）。4B） ●●●●。相反，这些野生型和ink4a–ARF^+/−当过表达Bmi-1和Myc时，MEFs在软琼脂中迅速产生菌落（图。​（图3A），三A） 表明Bmi-1和Myc不仅在体内转化中协同作用，而且在体外原代MEF中协同作用。然而，与Ras和Myc共表达相比，这里观察到的凤尾鱼非依赖性生长效率更低（产生更小的菌落）（图。​（图4B）。4B） ●●●●。

上述实验清楚地表明myc公司和体重指数-1主要通过ink4a–ARF由于Bmi-1和Myc对p19arf表达有相反的影响，我们有兴趣了解当Bmi-1与Myc在MEF中过度表达时，p19arf蛋白水平会发生什么变化。在MEFs中Myc的过度表达导致p19arf水平的预测增加。然而，在MEF中首次感染体重指数-1编码逆转录病毒，然后用myc公司编码病毒，未发现p19arf的诱导，而在所有myc公司病毒感染的MEF（图。​（图3B，三B、 显示用于不同myc公司-逆转录病毒）。这清楚地表明，Bmi-1禁止Myc上调p19arf，结合上述数据，强烈表明这是他们在转化过程中有效合作的基础。

Myc和Ras在ink4a-ARF中的过度表达^+/−MEF揭示了剂量效应

Bmi-1过表达导致p16和p19arf的强烈下调，然而，它并没有完全消除它们的表达（图。​（图3B）。三B） ●●●●。然而，我们观察到Bmi-1和Myc明显的剂量依赖性协同作用，这在很大程度上是通过Bmi-1对ink4a–ARF轨迹。这意味着Myc诱导的凋亡和转化对细胞ink4a–ARF剂量。Myc过度表达ink4a–ARF^+/−与Myc过度表达的野生型MEF相比，MEF似乎对Myc诱导的凋亡更具抵抗力，并且在高血清条件下增殖更快（图。​（图4A）。4A） ●●●●。评估是否ink4a–ARF基因剂量与转化效率的提高相关，我们感染了野生型，ink4a–ARF^+/−、和ink4a–ARF^−/−连续两轮受控或ras（拉斯维加斯）-编码逆转录病毒并随后进行控制或myc公司-编码逆转录病毒并分析其在半固体培养基中增殖的能力（图。​（图4B）。4B） ●●●●。据其他人报道(Serrano等人，1996年)，野生型和ink4a–ARF^+/−单靠Myc或Ras不容易转化MEF。相反，ink4a–ARF^−/−MEF可以由Ras或Myc转化。通过Ras和Myc组合对所有三种基因型进行转化，其中Ras和Myc的转化率最高ink4a–ARF^−/−MEF，与野生型或ink4a–ARF^+/−MEF（图。​（图4B）。4B） ●●●●。然而，最初在ras（拉斯维加斯）+myc公司-受感染的野生型或ink4a–ARF^+/−MEF，从～1.5周后，许多野生型菌落停止生长并死亡（图。​（图4B）。4B） ●●●●。相比之下ras（拉斯维加斯）+myc公司-受感染的ink4a–ARF^+/−MEFs导致更多更大的菌落继续生长（图。​（图4B，4B、 底部）。野生型MEF，效率更高，ink4a–ARF^+/−MEF可以通过丢失剩余野生型来抵抗Myc诱导的凋亡ink4a–ARFp53等位基因或突变。(Zindy等人，1998年; J.Jacobs，未解释）。然而，软琼脂菌落分析ink4a–ARFPCR基因型和抗突变型和野生型p53抗体的Western blotting检测p53状态表明，16个菌落中只有1个表现出杂合性缺失（LOH）ink4a–ARF（图。​（图4C），4C） 12个受试菌落均未出现p53突变（图。​（图4D）。4D） 。这清楚地表明ink4a–ARF该剂量已经为过度表达Ras和Myc的MEF提供了选择性生长优势。这进一步反映在Ras和Myc对p16和p19arf的相对诱导中，在ink4a–ARF^+/−与野生型MEF相比，MEF（图。​（图4E，4E、 显示为Myc）。

Myc过度表达和ink4a–ARF丢失之间的体内紧密协作

Bmi-1和Myc在小鼠中的过度表达强烈加速了肿瘤的发生，双转基因小鼠在出生时已经发展成大规模白血病(van Lohuizen等人，1991年;Alkema等人，1997年). 在这里，我们表明，在体外，Bmi-1和Myc之间的大多数协同作用都可以归因于ink4a–ARFBmi-1位点。根据这些观察结果，我们希望评估墨迹4a–ARF^−/−当交叉到Eμ–时，小鼠也表现出有效的淋巴腺病加速myc公司转基因小鼠。然而，我们无法生成这些小鼠，因为Eμ-myc；ink4a–ARF^+/−小白鼠在5.5周到7.5周之间迅速病重，在生下后代之前全部死亡（图。​（图5A）。5A） ●●●●。组织病理学分析显示，这些小鼠都死于异常侵袭性淋巴母细胞白血病。在大多数动物中，肿瘤细胞侵袭不同的器官，如胸腺和邻近淋巴结、肝脏、卵巢、子宫、乳腺脂肪垫，有时也侵袭肺部、肾脏和脑膜（如图。​图5B，5B、 面板A和B，用于肝脏和肺部）。毫无例外，血液是极度白血病，这让人想起我们在Eμ–体重指数-1; Eμ–myc公司双转基因（图。​（图5B，5B、 参见面板D和E）。胸腺肿瘤细胞悬浮液的流式细胞术分析显示，这些肿瘤起源于B细胞，sIgM呈高度或中度阳性（图。​（图5C）。5C） ●●●●。克隆或寡克隆B细胞受体重链重排的存在证实了这些结果，在成熟sIgM病例中⁺肿瘤，也有克隆性轻链重排，但未观察到TCRβ重排（数据未显示）。肿瘤细胞似乎在一定程度上保留了分化能力，因为在明显发生肿瘤之前牺牲的一只动物的胸腺中已经显示出显著的前B（肿瘤）细胞群（K1911，图。​图5C）。5C） ●●●●。这些结果是显著的，因为还没有关于ink4a–ARF^+/−小鼠体内肿瘤发生前(Serrano等人，1996年). 体外，Myc在p19arf中过度表达^+/−MEF被显示为选择丢失剩余的单元格ink4a–ARF等位基因(Kamijo等人，1997年). 因此，我们检查了Eμ–myc；ink4a–ARF^+/−通过Southern分析发现LOH的B细胞肿瘤。所有15 Eμ–myc；ink4a–ARF^+/−肿瘤和一个CD2-myc；墨迹4a–ARF^+/−B细胞瘤检查显示LOHink4a–ARF轨迹，而控制Eμ-myc公司，CD2-myc公司，或Eμ–bmi-1；ink4a–ARF^+/−肿瘤没有（图。​（图5D）。5D） 。与Eμ中显著加快肿瘤发展相反——myc；ink4a–ARF^+/−小鼠，在Eμ–体重指数-1；ink4a–ARF^+/−与Bmi-1过表达也通过ink4a–ARF在肿瘤发生中（图。​（图5A；5A；数据未显示）。许多固缩肿瘤细胞的存在以及Eμ-的TUNEL染色的初步证据myc公司肿瘤显示，相对较高比例的肿瘤细胞发生凋亡，然而，在Eμ–myc；ink4a–ARF^+/−B细胞肿瘤（显示LOH），凋亡肿瘤细胞的百分比较低（图。​（图5B、G、，5B、 G和H；数据未显示）。这表明，在体外，体内ink4a–ARF尽管不同的归巢/环境或分化阶段（胸腺、成熟的B细胞淋巴瘤与Eμ–myc公司前B细胞淋巴瘤）。

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图5

Eμ-淋巴腺病严重加速myc；墨迹4a–ARF^+/−老鼠。(A类)Eμ–myc；ink4a–ARF^+/−小鼠很快死于侵袭性B细胞肿瘤。Eμ–的Kaplan-Meier生存图myc；ink4a–ARF^+/−小鼠和Eμ-myc公司老鼠。(B类)出现在Eμ–myc；ink4a–ARF^+/−和Eμ–myc公司老鼠和这些动物的血液ink4a–ARF^−/−老鼠。(A类)Eμ的典型示例myc；ink4a–ARF^+/−肿瘤侵犯肝脏；(B类)肺血管Eμ-myc；ink4a–ARF^+/−充满肿瘤细胞的小鼠。(C类)肺血管Eμ的典型示例myc公司小鼠，无肿瘤细胞；(D-F公司)Eμ–的血液myc；ink4a–ARF^+/−(D类)，Eμ–myc公司(E类)、和ink4a–ARF^−/−(F类)老鼠。注意，与Eμ相比myc公司和ink4a–ARF^−/−小鼠，Eμ-的血液myc；ink4a–ARF^+/−小鼠有高度白血病。(G、 H（H）)在Eμ–myc；ink4a–ARF^+/−(G公司)和Eμ–myc公司(H（H）)老鼠。注意Eμ中存在更多的固缩肿瘤细胞，这表明细胞凋亡myc公司与Eμ相比，肿瘤myc；ink4a–ARF^+/−肿瘤。照片是10倍拍摄的(A-C公司)和20倍(D-H公司)放大倍数。(C类)三种Eμ–的细胞悬浮液的流动滴定分析myc；ink4a–ARF^+/−细胞表面CD8、CD4、sIgM和B220染色后的肿瘤。(D类)Southern blot分析ink4a–ARF从正常肝脏（L）或肿瘤（T）组织中分离出的基因组DNA的状态，显示ink4a–ARF肿瘤发生部位Eμ-myc；ink4a–ARF^+/−（车道1)和CD2–myc；ink4a–ARF^+/−（车道三)小鼠，但不在CD2中–myc公司（车道2)Eμ–myc公司（车道5)和Eμ–体重指数-1；ink4a–ARF^+/−（车道4)老鼠。

ink4a–ARF剂量效应：对肿瘤发生的影响

除了Bmi-1对ink4a–ARF，MEF转化分析myc公司和ras（拉斯维加斯）也透露清楚ink4a–ARF凤尾鱼非依赖性生长能力效率的剂量依赖性。如经典的REF共转化分析(Land等人，1983年)，Myc和Ras在野生型MEF中的共表达导致软琼脂中的菌落生长；然而，鉴于我们使用的病毒感染效率很高，这种情况发生的效率很低。有趣的是，Ras+Myc的转化效率在ink4a–ARF基因剂量依赖性方式ink4a–ARF^+/−和ink4a–ARF^−/−MEF公司。值得注意的是，Myc+Ras在未附着的野生型REF中的初始促有丝分裂作用，以及随后大多数细胞的快速死亡，已被证明是由于基质粘附的剥夺而发生的(麦吉尔等人，1997年). 我们的结果清楚地表明ink4a–ARF基质附着破坏时发生的细胞凋亡需要剂量依赖性。因为高效的细胞周期蛋白D1上调需要基质连接（有关审查，请参阅Assoian 1997年)，这可能表明p16在这方面发挥作用。我们认为，最初的增殖和随后的凋亡反映了随着每个细胞分裂p16和p19arf水平的逐渐增加；这是在胚胎被分解和MEF被培养时观察到的(Zindy等人，1997年,1998). 当p16和/或p19arf达到临界水平时，这些原代细胞通常进入称为细胞衰老的静止状态，而在Myc（可能还有Ras）过度表达的情况下，这些细胞的命运现在变成ink4a–ARF-依赖性凋亡。与此假设一致，我们发现在病灶形成分析中，当将这种Ras+Myc转导的原代MEF涂布在涂布皿上时，整个单层有效过度生长，表明大多数细胞在这些条件下都能有效增殖（未显示）。

我们进一步观察到，共同表达Ras和Myc的MEF保持了p16和p19arf蛋白水平的高诱导（我们的未发表数据）。重要的是，在ink4a–ARF^+/−MEF显示，在（相对早期）分析时，没有显著的p53突变或LOH水平ink4a–ARF如果在p16/p19arf的其他效应器中没有其他（迄今为止前所未有的）突变快速发生，这可能意味着ink4a–ARF在这些快速增殖的克隆中，阻止达到野生型衰老阈值水平。我们认为这不太可能，因为Ras+Myc显著诱导p16和p19Arf水平。相反，我们支持Ras+Myc的共表达，以使MEF对p16/p19arf阻滞相对更不敏感。我们推测，实现不敏感的一种方法可能是已知Ras通过PI3-激酶-AKT/PKB途径阻止Myc诱导的凋亡(Kauffman-Zeh等人，1997年). 值得注意的是，软琼脂分析是在高血清条件下进行的，这可能有助于平衡生存。或者，Ras+Myc的过度表达可能影响其他调控因子或ink4a–ARF例如Mdm2、pRB或p53。在这方面，我们未能检测到Myc+Ras感染者中p53的显著上调，这一点具有潜在的相关性ink4a–ARF^+/−软琼脂克隆（未显示），而在野生型MEF中，Myc已被证明诱导p53，同时也诱导p53靶基因百万平方米两者都参与调节p19arf抑制反应(Zindy等人，1998年).

也许是对ink4a–ARF肿瘤抑制作用是Eμ–myc；ink4a–ARF^+/−小鼠，这明显让人联想到Eμ–myc公司; Eμ–体重指数-1双转基因小鼠(Alkema等人，1997年). 这些主要为克隆性的肿瘤总是显示出剩余野生型的丢失墨迹4a–ARF等位基因，符合以下概念：ink4a–ARF允许Myc的完全促生长和致癌活性。这意味着LOH一定发生得很快，可能反映了最近描述的Myc在引发基因组不稳定中的作用(McCormack等人，1998年;Felsher and Bishop 1999年). 获得的白血病表现出几个不寻常的特征，因为它们是高度侵袭性的成熟B细胞白血病，侵袭胸腺和/或邻近的淋巴结、皮下和乳腺脂肪垫以及肝脏、肺和胰腺等几个器官。这与Eμ中主要的前B细胞淋巴瘤不同myc公司主要局限于外周淋巴结和脾脏的小鼠(Langdon等人，1986年)或B细胞前淋巴瘤和主要纤维肉瘤ink4a–ARF^−/−小鼠(Serrano等人，1996年). 鉴于Eμ的异常攻击性和早期发病——myc；ink4a–ARF^+/−B细胞肿瘤及其上述含义ink4a–ARF在基质附着破坏后的细胞凋亡中，很容易推测这些肿瘤细胞可能对粘附介导的生存信号的丢失更具耐受性，因为ink4a–ARF-损失。

流式细胞术和Annexin-V染色

用CD3ε（145-2C11）、CD4（RM4-5）、CD8a（53-6.7）、CD45R/B220（RA3-6B2）、TCRβ（H57-597）和sIgM（Biosource；LO-MM-9-F）。为了进行凋亡分析，在用CD4和Annexin-V抗体分离胸腺细胞后立即对其进行染色，而骨髓细胞在含有50μ米根据供应商（Boehringer）的说明，在用B220和Annexin-V抗体染色之前使用β-巯基乙醇。

细胞培养与逆转录病毒感染

如前所述，分离出了MEF(Jacobs等人，1999年)改良后，胎儿组织在解离前在37°C的400μl胰蛋白酶/EDTA中培养45分钟。MEF以1:4的比例拆分，并保存在补充了10%FBS（PAA）的DMEM（GIBCO）中。用LZRS-iresGFP病毒进行逆转录病毒感染，并用结晶紫染色进行生长曲线测定，如下所述(Jacobs等人，1999年). 使用高滴度LZRS–iresGFP病毒可确保100%的感染效率，而无需通过分析GFP表达来轻松检查细胞的药物选择。对于Myc，使用了两个版本，LZRS–myc公司HA–iresGFP和LZRS–myc公司ER–iresGFP。后者导致非活性MycER融合蛋白的表达，可通过添加4-羟基三苯氧胺（4-OHT）诱导其形成活性构象(Littlewood等人，1995年). 然而，该系统有点泄漏，在没有4-OHT的情况下导致相当大的Myc活性，添加4-OHT可以进一步增加Myc活性。

生长曲线、凋亡和软琼脂分析

对于生长曲线，将细胞置于12孔培养皿中，每天用结晶紫染色法测定细胞数量(Jacobs等人，1999年). 为了分析Myc诱导的细胞死亡，第一代MEF感染了对照空LZRS–iresGFP病毒或LZRS-体重指数-1PY–iresGFP病毒48小时；然后分裂细胞并用空白对照LZRS–iresGFP，LZRS-感染48小时myc公司HA–iresGFP或LZRS–myc公司ER–iresGFP病毒。随后将逆转录病毒感染的细胞接种在含有或不含4-OHT的10%血清培养基中的12孔板上。第二天，用含有0.1%或10%血清（含或不含4-OHT）的培养基替换培养基，24或48小时后收集粘附细胞和非粘附细胞，并通过台盼蓝排除法分析细胞死亡情况。为了测量亚倍体DNA含量，将细胞接种在60mm培养皿上，如上所述进行处理，然后收获、固定、用碘化丙啶染色，并按所述进行流式细胞术分析(Rowan等人，1996年).

用于分析半固体介质中的生长，～5×10⁴细胞在含有10%血清和0.4%低凝胶温度琼脂糖（Sigma）的DMEM中每孔六孔培养皿中培养。

我们感谢M.van der Valk的组织学分析，感谢L.Rijswijk、N.Bosnie和C.Friedrich的动物护理。感谢G.I.Evan和H.Hermeking提供Myc–MER和HA–Myc融合结构，感谢A.Strasser和S.J.Korsmeyer提供Eμ–bcl-2基因-36和Eμ–bcl-2基因转基因小鼠。G.I.Nolan博士提供了LZRS-病毒构建物和PHOENIX包装细胞系。我们感谢C.J.Sherr在发布之前传达结果。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。