激活基因突变ras（拉斯维加斯）致癌基因在人类癌症中的比例很高。Ras蛋白通过许多效应器促进细胞转化，包括激活ERK MAP激酶途径的丝氨酸/苏氨酸激酶Raf和激活丝氨酸/苏氨酸激酶Akt和小GTPase Rac的脂激酶磷酸肌醇3-OH激酶（PI 3-激酶）(向下1998). 许多激活的癌ras（拉斯维加斯）癌基因经历了上皮-间充质转化（EMT），其中上皮表型消失，其特征是上皮细胞层的细胞-细胞连接和极性增强，而间充质表型获得，其特征为细胞-细胞相互作用减弱和运动增强(Schoenenberger等人，1991年;Birchmeier等人，1993年;海伊1995). 虽然Ras促进EMT的确切机制尚不完全清楚，但它可能对许多肿瘤类型的行为，特别是在建立侵袭性和转移性方面很重要。
表达活化Ras（EpRas）的小鼠乳腺上皮细胞通过EMT对转化生长因子β产生反应，然后通过自分泌方式产生转化生长因子β继续维持间充质表型(Oft等人，1996年). 此外，其他一些证据表明TGFβ可以促进细胞的恶性转化：最初确定该因子是因为它能够与TGFα协同促进成纤维细胞的转化(Roberts等人，1981年). TGFβ由许多晚期人类肿瘤产生，在小鼠皮肤致癌模型中有报道可促进鳞状细胞癌向梭形细胞癌的进展（有关综述，请参阅Akhurst和Balmain 1999年). 它对肿瘤维持的重要性还体现在第二份转化生长因子β1在化学致癌过程中基因不会丢失转化生长因子β1杂合小鼠。由于转化生长因子β可以促进血管生成、伤口愈合和免疫抑制，至少它对肿瘤进展的一些积极作用可能是通过对肿瘤本身以外的细胞的作用。
与TGFβ参与癌症进展的大量数据明显矛盾的是，它也是一种有充分证据证明的细胞生长抑制剂和细胞死亡诱导剂。TGFβ通过破坏Cdk抑制剂p21的功能抑制细胞周期的进展CIP1级，第27页知识产权1和第15页INK4B（墨水4B）并能诱导caspase介导的细胞凋亡(Oberhammer等人1992;Hannon and Beach 1994年;Reynisdottir等人，1995年). 大多数肿瘤对TGFβ的抑制作用有抵抗力，在一部分肿瘤类型中，TGFβ受体或下游信号蛋白Smad4/DPC4的缺失是导致TGFβ抑制作用的原因（有关综述，请参阅1998年马萨). 这表明对TGFβ的反应性普遍丧失可能对上皮细胞形成肿瘤很重要，TGFβ对肿瘤发生的积极作用可能完全是由于其对周围正常组织的作用与肿瘤相互作用。
最近有报道称，作用于Ras下游的ERK-MAP激酶在连接MH1和MH2结构域的连接区磷酸化Smad2和Smad3(Kretzschmar等人，1999年). 这阻止了它们对TGFβ的反应而转移到细胞核，从而导致上皮细胞中TGFβ反应的普遍抑制。该模型为TGFβ在促进肿瘤发生方面的细胞自主作用留下了很少的空间，如最近的报道；例如，显性负性TGFβ受体的表达抑制了EMT肿瘤细胞在小鼠体内的转移形成(Oft等人，1998年;Yin等人，1999年).
TGFβ作为肿瘤抑制剂和肿瘤促进剂的作用之间的这些明显矛盾促使我们更详细地研究Ras–MAP激酶途径和TGFβ信号之间的相互作用。特别是，我们已经解决了Raf的激活是否会导致TGFβ信号的整体抑制（至少通过Smads），或者这种影响是否更具选择性，仅作用于TGFβ反应的肿瘤抑制方面。我们发现，持续的Raf激活能够诱导MDCK细胞产生EMT，导致自分泌TGFβ环的建立，从而促进体外胶原凝胶中细胞的侵袭行为。Raf不抑制TGFβ引起侵袭性生长的能力，但阻断了TGFβ的凋亡作用。这种凋亡抑制并不局限于TGFβ，而是常见于几种死亡刺激。Raf激活不会损害TGFβ诱导的Smad信号传导。我们认为，激活Raf–MAP激酶途径并不特异性抑制TGFβ信号传导，而是允许细胞仅显示TGFβ反应的显著方面，如侵袭性，同时广泛阻断凋亡反应。
结果
Raf–ER的激活导致MDCK细胞中p42MAPK的快速磷酸化
为了研究Raf激酶在上皮细胞形态调控和抗凋亡作用中的作用，我们构建了稳定表达4-羟基三苯氧胺（4HT）诱导的EGFP-ΔRaf-1-hbER（DD）融合蛋白的上皮MDCK细胞(Woods等人，1997年). 该融合蛋白（缩写为Raf–ER）由Raf-1的催化结构域组成，该催化结构域缺乏Ras结合位点（ΔRaf-1），两个酪氨酸磷酸化位点Y340和Y341被天冬氨酸残基（DD）取代，增强了其激酶活性(Bosch等人，1997年). 对MDCK-Raf–ER细胞进行MAPK通路激活测试。细胞被饥饿并用4HT处理不同时间（图。A） 和裂解产物通过Western blotting检测p42MAPK的磷酸化和Raf–ER融合蛋白的表达。Raf–ER融合蛋白的诱导导致p42MAPK快速而持续的磷酸化，该磷酸化在刺激后15分钟已经检测到，并且随着时间的推移而增加。相比之下，EGF或HGF/SF刺激导致MAPK的磷酸化速度更快，但只是短暂的（数据未显示）。相比之下，携带空载体（模拟）的对照细胞在4HT处理中未显示MAPK磷酸化（图。B） ●●●●。正如预期的那样，用MEK抑制剂PD98059预处理完全消除了MAPK磷酸化（图。B） ，表明可诱导的Raf–ER系统反映了生长因子诱导的MAPK通路激活。
Raf–ER的激活导致p42MAPK的快速磷酸化，并诱导MDCK细胞的形态变化。(A类)表达Raf–ER的MDCK细胞在DMEM+0.5%BSA中血清饥饿24小时，然后用100nM 4-羟基-他莫昔芬（4HT）处理指定的时间。使用抗雌激素受体抗体和p42MAPK向磷酸化形式的迁移率测定细胞质裂解物中Raf–ER融合蛋白的表达(B类)携带空载体（模拟）的对照MDCK细胞和MDCK Raf–ER细胞被血清饥饿24小时，未经处理或用100 nM 4HT处理1小时。4HT治疗前20分钟应用MEK抑制剂PD98059（30μM），并通过免疫印迹法测定p42MAPK活性。(C类)MDCK Raf–ER细胞未经处理或(E类)用100 nM 4HT处理24小时或(F类)>14天或(D类)用10 ng/ml HGF/SF浸泡24小时，并用相差显微镜检查。
Raf激活后MDCK细胞形态变化的诱导
在MDCK细胞中建立了可诱导的Raf–ER融合蛋白，我们检测了Raf激活引起的形态学效应（图。C–F）。由于HGF/SF是导致细胞散射的Raf–MAPK通路的生理激活剂，我们比较了HGF/SF诱导的形态学效应和Raf–ER效应。用4HT或HGF/SF处理MDCK Raf–ER细胞，并在Raf激活前后拍摄相控照片。而MDCK Raf–ER细胞在缺乏4HT的情况下生长在紧凑的岛状野生型细胞中（图。C） ，用4HT激活Raf–ER 24小时导致细胞间接触中断和细胞迁移增加（图。E） 与HGF–SF观察到的散射效应类似（图。D类；Stoker等人，1987年;Gherardi等人，1989年). 有趣的是，HGF/SF-和Raf–ER介导的形态学效应的发生与延时视频显微镜观察到的动力学相似（数据未显示）。用HGF/SF或4HT处理导致细胞与细胞接触中断8小时，细胞运动在12小时内增加。用MEK抑制剂PD98059（30μM）、PI 3-激酶抑制剂LY294002（20μM）或蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（10 ng/mL）预处理细胞完全阻断了Raf诱导的散射响应（数据未显示）。这些发现表明，细胞散射需要基础的PI3-激酶活性和蛋白质合成(Boyer等人，1997年;Khwaja等人，1998年). 虽然HGF/SF介导的分散表型在存在配体的情况下3天后完全恢复（数据未显示），但持续的Raf激活导致细胞形态的进一步变化（图。F） ●●●●。细胞变得细长且呈纺锤形，表明从上皮细胞表型转变为间充质细胞表型，4HT处理14d后稳定维持。这些结果和转化细胞在软琼脂中生长的能力（数据未显示）表明，MDCK细胞中持续的Raf–ER激活足以介导细胞转化。
Raf–ER的激活导致上皮细胞的抑制和间充质标志蛋白的诱导
从上皮向间充质表型转化的特征是细胞间连接组织减少，上皮特征丧失，间充质特征增加(Greenburg and Hay 1986年;Boyer等人1989). 为了研究Raf–ER介导的细胞形态变化，对上皮和间充质标记蛋白进行了免疫染色（图。). 以0.25-μm的间隔获得光学切片，并生成三维图像堆栈。
Raf–ER的激活导致上皮标记蛋白的抑制和间充质标记蛋白的表达诱导。MDCK Raf–ER细胞未经处理(a、 e、i、k、o)或用100 nM 4HT处理4天(b、 f、j、l、p)，6天(c、 克、米、q)或持续Raf激活后（>14天；d、 h、n、r)用识别E-cadherin、ZO-1、细胞角蛋白和波形蛋白的抗体进行免疫染色，并用共焦激光扫描显微镜进行检查。共焦图像显示水平截面的三维堆栈(一–h、 k个–第页)垂直截面的或(i、 j个).
免疫染色模式显示，在未刺激的MDCK-Raf–ER细胞中，粘附连接蛋白E-cadherin和紧密连接成分ZO-1定位于细胞间连接（图。a、 e）。此外，在垂直部分（图。i） 未诱导的MDCK细胞表现出极化表型，ZO-1定位于E-cadherin定位上方的顶端细胞边界。
4HT处理后4天内（图。b） ZO-1主要从细胞-细胞连接处去除，并在细胞表面广泛表达。4HT治疗6天后，这种效果更加明显（图。c） 以及在持续Raf活化后转化的MDCK Raf–ER细胞中（图。d） ●●●●。在加入4HT 4天后，E-钙粘蛋白存在于细胞间接触处（图。f） 如垂直剖面所示，它们现在和细胞表面上形成得更松散（图。j） ●●●●。相反，在Raf持续激活后，E-cadherin的定位变得弥散且大大减少（图。g、 h）。在没有4HT的情况下（图。k） ，中间丝蛋白细胞角蛋白18在细胞边界内形成丝的网络。4HT处理4天后（图。l） 或6 d（图。m） ，只有少数细胞角蛋白丝穿过细胞体可见，Raf转化的MDCK-Raf–ER细胞中的水平大大降低（图。n） ●●●●。间充质标记蛋白波形蛋白（一种细胞骨架中间丝蛋白）的免疫染色显示在未诱导的MDCK细胞中低表达（图。o） 但4HT处理6d后染色强烈（图。q） 以及在Raf转化细胞中（图。r） ●●●●。
这些结果表明，强大而持续的Raf信号足以诱导上皮细胞向间充质细胞转化（EMT），其特征是顶端-基底极性、上皮标记蛋白和间充质标记蛋白的表达缺失（有关综述，请参阅Birchmeier等人，1995年;海伊1995).
活化MDCK细胞中的Raf诱导TGFβ分泌
研究表明，EMT的过程伴随着TGFβ1的分泌，而TGFβ是维持转化表型所必需的(Oft等人，1996年). 因此，在不同时间用4HT处理MDCK Raf–ER细胞，并用ELISA分析细胞培养上清液中是否存在TGFβ1（图。A） ●●●●。4HT处理48小时后，培养基中TGFβ蛋白的表达上调了三倍。当MDCK细胞经历EMT后，Raf持续激活超过14天，出现八倍的增加。浓缩细胞培养上清液的免疫印迹也证明了TGFβ对Raf–ER激活的反应（图B） ●●●●。研究表明，通过丝氨酸蛋白酶尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）诱导纤溶酶激活，TGFβ的生物活性形式从其细胞表面结合的潜在形式（LTGFβ1）中释放出来(Lyons等人，1990年;Godar等人，1999年)，我们询问Raf–ER激活是否导致MDCK细胞分泌uPA。4HT治疗8小时后，uPA分泌开始，并以类似于TGFβ分泌的方式随时间增加。uPA的激活增加基质金属蛋白酶（MMP）的表达，并促进细胞外基质成分的降解，这是肿瘤细胞侵袭性生长的先决条件(Rosenthal等人，1998年).
MDCK细胞中Raf的激活诱导TGFβ的分泌。(A类)MDCK Raf–ER细胞、对照MDCK细胞和通过在4HT（Raf T）中长期培养转化的MDCK Raf–ER细胞在有或无100 nM 4HT的DMEM+2%FCS中培养24小时。细胞在DMEM+0.5%BSA中再培养24小时，然后收集上清液。ELISA检测细胞培养上清液中TGFβ1的水平。显示的值是针对细胞数的标准化值。(B类)在DMEM+2%FCS中培养MDCK Raf–ER细胞、对照MDCK细胞和Raf转化的MDCK-Raf–ER细胞（RafT），并用100 nM 4HT刺激指定时间。通过超滤浓缩细胞培养上清液，在非还原条件下用12%SDS-PAGE分析等分样品，并免疫印迹TGFβ和尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）。(C类)MDCK对照细胞未经处理或用2 ng/mL TGFβ、4HT未经处理的MDCK Raf–ER细胞（cm-4HT）条件培养基或长期暴露于4HT（cmRafT）转化的MDCK-Raf–ER细胞条件培养基处理1 h。测定核提取物中活化的Smad3/4复合物与32EMSA标记的P-jun寡核苷酸探针（lanes1–4). 用2 ng/mL TGFβ刺激未处理的MDCK Raf–ER细胞1 h，并在超移条件下检测核提取物中Smads在与c-jun探针结合的复合物中的存在，该复合物带有以下抗体：抗Smad3、抗Smad4、抗Smad2、与Smad3（Transduction Laboratories）交叉反应和抗Smad2（SED）。用抗Smad3（Smad3+pep）进行肽竞争。
接下来，我们利用电泳迁移率变化分析（EMSA）对Raf诱导的分泌型TGFβ的生物活性进行了测定32P-标记的c-jun探针与Smad4复合物结合TGFβ诱导的活化Smad3(Wong等人，1999年). 来自Raf转化的MDCK Raf–ER细胞（cmRafT）的浓缩细胞培养上清液能够在对照MDCK细胞（模拟）中诱导TGFβ信号传导，通过结合c-jun探针的复合物检测到（图C、 车道2、4）。同样的复合物是由外源性添加的TGFβ诱导的（图C、 车道1、2）。为了证实该复合物是由TGFβ激活的Smad3和Smad4形成的，我们在抗Smad4抗体或抗Smad3抗体存在的情况下定量地超转移了TGFβ诱导的复合物（图。C、 车道7、9）。添加用于提高抗Smad3抗体的肽可防止超位移（图。C、 车道8）。与Smad3（数据未显示）发生交叉反应的商业抗Smad2抗体（Transduction Laboratories）有效地超转移了Smad3/4复合物（图。C、 车道10）。然而，更特异的抗Smad2抗体（SED）并没有改变复合物的迁移率（图。C、 11号车道；Nakao等人，1997年).
综上所述，这些结果表明，Raf诱导uPA和生物活性TGFβ的分泌，这两种成分在侵袭性和细胞转化中起重要作用。
MDCK细胞中Raf的激活导致依赖自分泌TGFβ刺激的胶原凝胶中侵袭性表型的建立
在证明转化生长因子β在Raf诱导的EMT过程中分泌后，我们开始分析其在这一过程中的作用。MDCK Raf–ER细胞在有无4HT的胶原蛋白凝胶中培养。而野生型MDCK细胞（图。a） 和未经处理的MDCK Raf–ER细胞（图。b） 生长在典型的管腔囊肿中(Khwaja等人，1998年)4HT处理导致细长的分支结构以侵入方式生长（图。c） ●●●●。此外，Raf转化的MDCK-Raf–ER细胞导致侵袭性生长的线状结构的形成（图。d） ●●●●。众所周知，TGFβ可抑制胶原中生长的上皮细胞的生长并诱导其凋亡(Oft等人，1996年)我们检测了TGFβ对野生型和未经处理的MDCK Raf–ER细胞的影响，这些细胞在胶原凝胶中培养了12天。当细胞在TGFβ存在下生长6天时，囊性结构降解并解离成小片段（图。e、 f），可能反映了TGFβ的凋亡作用。相反，Raf表达细胞（图。g、 h）在TGFβ的存在下保持其侵袭性表型。为了检测TGFβ信号传导的阻断是否会导致侵袭表型的逆转，我们测试了中和TGFβ抗体抑制这一过程的能力。MDCK Raf–ER细胞用4HT处理6天，然后再添加TGFβ中和抗体6天。这导致侵袭结构逆转为囊肿，表明需要分泌TGFβ来维持侵袭表型。
MDCK细胞中Raf的激活导致依赖自分泌TGFβ效应的胶原凝胶中侵袭性表型的形成。野生型MDCK细胞（WT；a、 e，i)、MDCK Raf–ER细胞未经处理(b、 f、j)或经过处理(c、 克，千)200 nM 4HT持续6天，MDCK Raf–ER细胞通过长期4HT刺激转化（RafT；d、 小时，小时)生长在I型胶原基质中(一–d日)或存在5 ng/mL TGFβ(e（电子）–小时)或中和TGFβ抗体(我–我)在无血清条件下再进行6d。以20倍放大率拍摄结构。
总之，这些结果表明，Raf–ER的激活可诱导胶原凝胶中的侵袭性生长，并且需要自分泌TGFβ功能来维持Raf诱导的表型。
短期激活Raf不能阻止TGFβ诱导的细胞周期阻滞
我们已经证明，激活Raf–ER可以克服胶原蛋白凝胶中MDCK细胞的TGFβ抑制作用。为了确定Raf激活是否干扰TGFβ介导的生长停滞，检查了细胞周期分布（图。A） ●●●●。在用4HT预处理的MDCK Raf–ER细胞中，TGFβ暴露导致G1（67%）和S期细胞百分比降低（9%），与4HT未处理细胞中TGFβ的作用相当（G1: 63%; S： 20%）。相反，长期激活Raf（RafT）转化的细胞对TGFβ诱导的生长停滞不敏感。正如已经证明的那样，TGFβ直接诱导上皮细胞中细胞周期蛋白A的下调(Ralph等人，1993年)，我们还通过总裂解物的Western blotting研究了TGFβ对细胞周期蛋白A表达的影响（图。B） ●●●●。在增殖细胞中，细胞周期蛋白A在G晚期上调1表明细胞周期进入S期。在异步生长的MDCK Raf–ER细胞中，细胞周期蛋白A在缺乏TGFβ的情况下高表达，4HT预处理24小时不会改变表达水平，而添加TGFβ导致4HT处理和未处理细胞中细胞周期蛋白A的表达显著降低。与上述数据一致，Raf转化的MDCK-Raf–ER细胞的cyclin A表达没有变化，表明它们对TGFβ介导的生长抑制信号不再敏感。
短期激活Raf并不能阻止TGFβ诱导的细胞周期阻滞，但可以阻止TGFα诱导的细胞凋亡。(A类)未经处理或用100 nM 4HT处理24或48 h的MDCK Raf–ER细胞和长期暴露于4HT（RafT）转化的MDCK-Raf–ER细胞用TGFβ（7.5 ng/mL）刺激24 h。在TGFβ处理前24 h，将培养基改为DMEM+2%FCS。碘化丙啶染色后用流式细胞术检测细胞周期分布。(B类)未经处理或用100 nM 4HT预处理的MDCK Raf–ER细胞，以及用4HT长期处理转化的MDCK Raf–ER细胞（RafT）用7.5 ng/mL TGFβ刺激指定时间。在TGFβ刺激前，细胞在DMEM+2%FCS中培养24 h，并通过Western blotting检测细胞周期蛋白A的表达。(C类)用7.5 ng/mL TGFβ刺激长期暴露于4HT（RafT）转化的MDCK Raf–ER细胞和未经处理或用100 nM 4HT预处理的MDCK-Raf–ER细胞24小时。通过Hoechst染色测定凋亡细胞的百分比。所示数据为重复进行的三个独立实验的平均值±标准偏差。(D类)活化的Raf对TGFβ诱导的caspase活化的影响。未经处理或用100 nM 4HT预处理8小时或24小时的MDCK Raf–ER细胞用7.5 ng/mL TGFβ刺激24小时。为了抑制caspase激活细胞，用100μM z-VAD预处理20分钟。细胞溶解液与ZEK（bio）D-aomk肽在37°C孵育5分钟，并用Western blotting进行分析。(E类)在未经处理或用100 nM 4HT预处理24或48 h的MDCK Raf–ER细胞中检测到caspase-8和p42MAPK的激活。用TGFβ（7.5 ng/mL）刺激24 h后，用Western blotting分析总细胞裂解物。
总之，这些研究结果表明，在几天的时间内，TGFβ诱导的生长停滞不会受到Raf激活的干扰，而已经经历EMT的长期Raf转化MDCK细胞显示出对TGFβ的抗增殖反应的丧失。
激活Raf可以阻断TGFβ诱导的细胞凋亡
研究表明，TGFβ通过激活多种细胞类型中的caspase级联反应诱导凋亡(陈和张1997)，我们探讨了TGFβ在触发促凋亡信号中的作用以及Raf对这一过程的影响。TGFβ处理后，通过测定染色质浓缩的细胞核百分比，对MDCK细胞的凋亡进行评分。TGFβ1治疗使凋亡细胞的百分比增加了7.5倍（图。C） 而4HT预处理48小时或长期（RafT）完全消除了TGFβ诱导的细胞凋亡。接下来，我们研究了TGFβ对效应半胱天冬酶的激活作用。细胞溶胶裂解物用Z-EK（bio）D-aomk肽亲和标记，该肽与活化的半胱氨酸天冬氨酸酶共价结合(Martins等人，1997年). TGFβ刺激导致caspase强烈激活，这是通过用泛酶抑制剂z-VAD预处理细胞来阻止的（图。D） ●●●●。在添加TGFβ之前激活Raf也可以阻断caspase的激活。此外，我们研究了caspase-8对TGFβ的激活（图。E、 上部面板）。研究表明，在细胞死亡受体刺激下，启动子caspase-8被激活，促进各种效应caspase的裂解和激活(Muzio等人，1996年; 有关查看信息，请参阅沃尔夫与格林1999). 作为放大环的一部分，Caspase-8也可以在效应Caspase下游被激活(Schulze-Othoff等人，1998年). 免疫印迹分析表明，TGFβ处理导致caspase-8的强烈激活，而4HT预处理的MDCK Raf–ER细胞中caspase-8被取消。综上所述，这些发现表明TGFβ通过激活caspase级联，对MDCK细胞提供促凋亡刺激。然而，短期Raf激活完全阻断了TGFβ诱导的caspase激活，表明Raf–MAPK通路可快速拮抗TGFβ介导的凋亡。
Raf的激活不影响Smads的信号转导
我们已经证明，MDCK细胞中Raf–ER的激活导致TGFβ的分泌，这是保持高度转化状态所必需的，同时，激活的Raf使细胞对TGFβ促凋亡作用不敏感。迄今为止，激活的Raf–ER抑制TGFβ介导的凋亡的机制尚不清楚。因此，我们研究了Raf激活对TGFβ介导的Smad信号的影响。最近，它被其他人展示了(Kretzschmar等人，1999年)小鼠上皮细胞中Ras或EGF信号的激活阻断了TGFβ诱导的Smads向细胞核的易位，从而抑制了TGFβ诱导的转录反应。因此，在MDCK Raf–ER细胞中研究Raf的激活是否直接干扰TGFβ-Smad通路是很重要的。我们研究了TGFβ信号转导的几个方面，即Smads进入细胞核的易位、Smads与DNA的结合，以及Smad-依赖于TGFβ的转录反应。用TGFβ刺激未经处理或用4HT预处理的MDCK Raf–ER细胞和MDCK V12Ras细胞，并用抗体免疫印迹核提取物以检测Smad2、Smad3和Smad4。在没有TGFβ信号的情况下，仅在细胞核中检测到极少的Smad4，而暴露于TGFβ导致Smad4在细胞核中大量积累（图。A、 顶部面板）。抗Smad2/3抗体也获得了相同的结果（图。A、 第二组），表明Smad2、Smad3和Smad4在TGFβ刺激下转位到细胞核，这在4HT预处理的MDCK-Raf–ER细胞中没有受损。组成性表达激活型Ras的MDCK细胞（MDCK V12Ras）也显示出Smad2、Smad3和Smad4对TGFβ的明显核移位。Raf激活后，p42MAPK的磷酸化形式很容易在细胞核中检测到，并且不受TGFβ暴露的影响（图。A、 第三个面板）。此外，核提取物的免疫印迹显示没有受到细胞溶质衔接蛋白Grb2的污染（数据未显示）。从这个实验中我们得出结论，Ras–Raf–MAPK通路的激活并不能阻止TGFβ诱导的Smad易位进入细胞核。
转化生长因子β诱导的核移位、DNA结合和Smad3/4复合物的转录活性不受Raf激活的影响。MDCK Raf–ER细胞未经处理或用100 nM 4HT预处理指定时间段，V12Ras MDCK细胞用TGFβ（2 ng/mL）刺激1 h(A类)Western blotting检测核提取物中Smad4、Smad2、Smad3的核移位和p42MAPK的激活。对核蛋白PCNA的表达进行分析，以显示核提取物的负载量相等。(B类)激活Smad3/4绑定到32用EMSA在细胞核提取物中检测P标记的c-jun探针。(C类)用ARE-Luc报告基因、pEF-XFast1和pEF-lacZ瞬时转染MDCK-Raf–ER细胞。在用100 nM 4HT处理指定时间段后，用2 ng/mL TGFβ刺激细胞6 h，并测量ARE-Luc报告子的激活。荧光素酶活性标准化为共转染的β-半乳糖苷酶控制质粒的活性。所示数据为三个代表性实验中一个重复实验的平均值±平均偏差。
接下来，使用相同的核提取物来检测易位Smad结合DNA的能力，这是基因激活的先决条件。使用32P-标记的c-jun探针作为EMSA中Smad3/4与DNA结合的读数，我们仅在TGFβ处理的细胞的核提取物中观察到一个移位的蛋白质-DNA复合物（图。B、 车道2、4、6、8、10）。同样，Raf或Ras激活并不能阻止核Smad3和Smad4与DNA的结合。剂量反应分析显示，即使在低浓度TGFβ的情况下，Raf刺激对Smad3激活也没有影响（数据未显示）。
最后，我们研究了Raf–ER的激活是否影响Smads对TGFβ的转录活性。研究表明，激活的Smad2和Smad4被转录因子招募到TGFβ靶基因的调控区域。例如，激活的Smad2和Smad4可以被翼螺旋转录因子Fast-1招募到Mix.2启动子的激活素/TGFβ响应元件（ARE）中，然后以信号依赖的方式刺激转录(Huang等人，1995年;Chen等人，1996年).
为了在激活的Raf存在的情况下测定Smads的转录活性，我们用编码荧光素酶报告基因的质粒瞬时转染MDCK Raf–ER细胞，该基因由三个拷贝的ARE驱动（图。C） ●●●●。在未经4HT处理的MDCK细胞中，荧光素酶活性在TGFβ的作用下显著增加，而在缺乏配体的情况下，荧光素酶活性相对较低。在经4HT预处理的MDCK Raf–ER细胞中，TGFβ诱导的荧光素酶活性没有改变。
总之，这些数据表明，MDCK细胞中V12Ras或Raf–ER激活的表达并没有阻止TGFβ激活的Smads移位到细胞核，与DNA结合并激活基因表达。
Raf抑制TNFα诱导的细胞凋亡
为了进一步研究Raf的激活是否导致对TGFβ以外的其他促凋亡刺激的保护，我们检测了Raf对TNFα诱导的凋亡的影响（图。). TNFα通过其死亡受体（TNFRI）在多种上皮细胞类型中引起凋亡(Sidoti-de Fraisse等人，1998年). 在蛋白合成抑制剂放线菌酮的存在下，用不同浓度的TNFα处理MDCK Raf–ER细胞4小时，这是阻断抗凋亡NF-κB对TNFα的转录反应所必需的。TNFα诱导凋亡细胞百分比的剂量依赖性增加（图。A） 以及caspase-8的强烈激活（图。B） 如Hoechst染色或Western印迹所示。相反，4HT预处理保护细胞免受凋亡，并导致caspase-8未被检测到激活。此外，我们可以证明，激活MDCK细胞中的Raf–ER可以阻止分离诱导的凋亡，即“失巢凋亡”(Le Gall等人，2000年;Rytömaa等人，2000年). 这些结果表明，Raf不仅抑制TGFβ诱导的死亡信号，而且使细胞对各种促凋亡刺激不敏感，表明Raf具有更广泛的抗凋亡功能。
Raf抑制TNFα加环己酰亚胺诱导的细胞凋亡。MDCK Raf–ER细胞未经处理或用100 nM 4HT处理24小时，并用指定浓度的TNFα和环己酰亚胺（2μg/mL）刺激4小时(A类)Hoecht染色检测凋亡细胞百分比。所示数据代表至少三个重复进行的独立实验。(B类)通过Western blotting检测caspase-8的激活，显示caspase-8的加工和激活的p20亚基。
讨论
Raf和上皮-间质转化
MDCK细胞是一种未转化的永生犬肾上皮细胞系，在体外可形成极化上皮单层。我们在此表明，使用可诱导的Raf–ER系统持续激活Raf和ERK MAP激酶足以引起上皮细胞向间充质细胞表型的改变。Raf激活后8小时，细胞开始出现细胞-细胞接触解体的迹象，在Raf激活的前2天，紧密连接和粘附连接断裂。在这段时间内，细胞以散射反应扩散并分离，与HGF/SF处理类似。细胞连接的破裂早在连接蛋白如E-钙粘蛋白和ZO-1的表达水平改变之前就发生了（K.Lehmann和J.Downward，unpubl.）；这可能涉及连接蛋白或其调节因子的翻译后修饰，或如最近对闭塞蛋白的研究所建议的那样，此处未检测到的一种特别不稳定的连接蛋白的表达快速下降(李女士2000).
在Raf激活后的几天内，细胞开始产生自身的生物活性TGFβ，并伴随uPA表达上调。这种自分泌的TGFβ负责促进胶原凝胶中活化的Raf表达MDCK细胞的侵袭性生长，这可以通过中和TGFβ抗体的能力在Raf在实验过程中或更长时间内被激活的细胞中阻断这种表型来证明。该系统与之前描述的活化Ras转化的EpH4小鼠乳腺上皮细胞EpRas之间有明显的相似之处，也有一些不同之处(Oft等人，1996年). 与这里使用的细胞不同，在EpRas细胞中，需要初始添加外源性TGFβ以建立自分泌TGFβ环。然而，一旦建立，自分泌TGFβ将维持侵袭性表型和EMT，可能与激活的Ras蛋白协同作用。
我们之前描述了一种MDCK细胞系，该细胞系组成性地表达一种通过定位于质膜而激活的Raf，即Raf-CAAX(Khwaja等人，1997年,1998). 与4HT处理的Raf–ER MDCK细胞不同，该细胞系没有显示间充质表型，也没有在胶原凝胶中形成侵袭性生长。与4HT处理的Raf–ER MDCK细胞不同，它也没有因细胞外基质脱落或其他凋亡损伤而受到凋亡保护。这两种细胞系之间可能的关键差异在于两种结构体所实现的Raf活性强度：Raf–ER细胞中ERK的激活程度远远高于Raf-CAAX细胞的构成水平（数据未显示）。Raf–ER结构的强活性也可以解释为什么这些细胞在4HT反应中分散，而表达Raf-CAAX的细胞却没有分散，尽管它们经历了一些形态变化(Khwaja等人，1998年).
Raf和TGFβ信号通路之间的相互作用
已有研究表明，某些肿瘤对TGFβ的抑制作用失去敏感性，特别是其通过失去TGFβ细胞表面受体的表达而导致生长停滞和凋亡的能力。或者，可能会丢失Smad4/DPC4，这是一种关键的常见Smad，与TGFβ受体激活的Smad2和Smad3相互作用，并与它们一起转位到细胞核(1998年马萨). 这两种机制都会导致TGFβ信号传导的全面阻断。然而，很明显，在许多情况下，TGFβ可以促进人类肿瘤或动物肿瘤模型中转化细胞的恶性表型(Akhurst和Balmain 1999年)因此，可能存在使肿瘤细胞避免TGFβ的抑制作用，同时继续利用其积极作用的机制。
就MDCK Raf–ER细胞而言，相对于亲代细胞，TGFβ反应的变化取决于研究的终点。在添加TGFβ前48小时激活Raf并不能阻止细胞周期进展的减缓。TGFβ治疗超过24小时并不能完全阻止细胞生长，但增殖速度明显降低。有趣的是，用4HT处理数周的MDCK Raf–ER细胞对TGFβ的生长抑制作用产生完全抵抗，这表明这是由于细胞经历了完全的EMT和随后的基因表达谱的重大变化，而不是早期或中期Raf调节信号直接或转录的结果。然而，长期Raf转化的细胞在胶原凝胶中持续依赖TGFβ自分泌回路进行侵袭性生长，这表明它们仍然对TGFβ的一些刺激作用有反应。
相比之下，转化生长因子β诱导细胞凋亡的能力很快被Raf的短期激活所阻断，早在EMT发生之前，尽管速度慢到需要转录事件。然而，这种对凋亡的保护作用并不针对TGFβ，在TNFα诱导的凋亡和基质脱落诱导的凋亡中也同样明显(Le Gall等人，2000年; 数据未显示）。因此，Raf–ERK通路的中短期激活似乎以非特异性方式抑制了该系统中的程序性细胞死亡。这一点，再加上TGFβ对细胞增殖抑制的不完全性，使得细胞在很大程度上避免了TGFβ的抑制作用，同时以恶性肿瘤的侵袭性增加和EMT的诱导为特征对其作出反应。在Raf长期激活后建立EMT；TGFβ对细胞增殖的抑制作用也丧失了，导致细胞对TGFβ没有抗增殖/产生反应，但确实表现出前侵入反应。目前我们尚不清楚强烈的Raf激活阻断MDCK细胞凋亡反应的机制；在另一种上皮系MCF-10A中观察到的类似反应已被发现是由表皮生长因子家族自分泌回路引起的，从而产生存活信号（a.Schulze和J.Downward，unpubl.）。
Raf和Smad信号
最近，有报道称ERK可以在连接MH1和MH2结构域的连接区磷酸化Smad2和Smad3(Kretzschmar等人，1999年). ERK磷酸化Smads不能在TGFβ的反应中转位到细胞核，导致Smad-mediated TGFβ反应的普遍抑制。事实上，在Raf–ERK通路的强烈和持续激活后，仍然可以在细胞中看到TGFβ的明确生物效应，这表明这些效应可能通过不涉及Smad的机制介导。或者，Smad信号传导在这里可能不能被活性ERK有效抑制。
Smad依赖性TGFβ信号转导：TGFβ可以激活MAP激酶激酶家族成员TAK1，这种激活与TGFβ快速激活p38 MAP激酶有关(Yamaguchi等人，1995年;Hanafusa等人，1999年). 此外，TGFβ仍然能够在缺乏功能性Smad4的肿瘤细胞系中诱导纤维连接蛋白的表达增加，尽管不是PAI-1(Hocevar等人，1999年)：这涉及依赖JNK的机制。虽然目前尚不清楚TGFβ的促侵袭作用是否需要JNK或p38活性，但诱导MDCK细胞失巢凋亡并不需要这些途径(Khwaja和Downward 1997). 对于Smad依赖性信号是否可以解释TGFβ的Raf耐药效应的不确定性，导致我们重新审视了ERK对Smad2和Smad3信号的抑制。令人惊讶的是，我们没有发现有效的Raf激活对TGFβ诱导Smad2、Smad3或Smad4核易位的能力有任何抑制作用；Smad3和Smad4的DNA结合能力；或Smad2和Smad4构建的报告者表达的事务激活。最近也有报道称，活化MEK的表达对HaCaT细胞中Smad3的核移位和DNA结合能力缺乏影响(Hu等人，1999年).
目前尚不清楚为什么Raf–ERK通路的激活不会阻止TGFβ向MDCK细胞中Smad2和Smad3的信号传导。细胞类型的差异可能解释了这一点，尽管我们也没有看到EpRas细胞的影响，这是Kretzschmar等人在研究中使用的一种细胞系（数据未显示）。
Raf、TGFβ与癌症
这里的数据表明，TGFβ信号通路可以与Ras–Raf–ERK通路协同作用，促进正常上皮细胞转化为具有间充质表型的高度恶性细胞。在MDCK细胞中，Raf的激活选择性地阻断了TGFβ对细胞生长的负面影响，而不是正面影响。抑制TGFβ对细胞凋亡和细胞周期退出的影响很可能位于TGFβ特异性途径的下游，Smad介导的信号仍能充分发挥作用。这与文献中关于某些肿瘤衍生细胞对TGFβ的反应性普遍丧失的许多报道形成对比。然而，有理由相信肿瘤中TGFβ信号的完全丢失可能仅限于某些类型的癌症，总体上相对罕见(Riggins等人，1997年).
TGFβ-受体II型在人类结肠癌细胞系中突变，这些细胞系具有高比率的微卫星不稳定性，这些细胞系来自DNA修复（RER）遗传缺陷家族，导致遗传性非息肉病性结肠癌。此外，RER家族的家族性胃癌也存在类似突变。进一步分析发现，在微卫星稳定结肠癌中偶尔出现TGFβ受体II型突变，在人宫颈癌中偶尔出现转化生长因子β受体I型突变。总的来说，人类肿瘤中TGFβ受体突变的频率很低。此外，很明显，发现的一些突变可能不会阻断TGFβ受体信号的所有方面。例如，无微卫星不稳定的遗传性非息肉病性结直肠癌家族中TGFβ受体II型突变选择性阻断TGFβ至p15的信号传导INK4B（墨水4B）表达而非PAI-1表达（有关审查，请参阅Kim等人，2000年). 相反，在两个RER阳性结直肠癌细胞系中，该受体的纯合突变不能抑制细胞对TGFβ的生长抑制反应(伊利亚斯等人，1999年).
肿瘤中TGFβ信号失活的另一个主要机制是Smad4（也称为Dpc4或Madh4）功能的丧失。Smad4失活是胰腺导管腺癌常见的基因改变。约50%的胰腺癌发生Smad4失活；它在其他类型的肿瘤中相对罕见，尽管它确实发生在其他器官的一小部分癌症中，尤其是结肠，以及乳腺癌、卵巢癌和胆道癌(Thiagalingam等人，1996年;Hahn等人，1998年)癌症。Smad4基因的种系突变也与青少年息肉病有关（综述见Weinstein等人，2000年). TGFβ信号被受体或Smads突变失活的肿瘤数量相对较少，这可能反映了TGFβ途径既可以促进恶性肿瘤，也可以抑制恶性肿瘤。在肿瘤进展的过程中，预计将有很强的选择性，以失去TGFβ的生长抑制作用，同时保持TGFβ反应的显著方面。这可以通过使TGFβ特异性信号事件下游的TGFβ的生长停滞和凋亡反应失活来实现。同样，从这里的数据来看，我们认为Ras–MAP激酶途径抑制Smads下游TGFβ的抑制作用，而不是通过全面抑制TGFβ反应。
材料和方法
表达式向量
前面描述了pBabe-puro中EGFP标记的ΔRaf-1–hbER（DD）（Raf–ER）cDNA(Woods等人，1997年).爪蟾pEF中的Fast-1–标志，爪蟾pEF–myc中的Smad2和pFTX5 pEF-lacZ在豪厄尔和希尔（1997）将人Smad3（hSmad3）亚克隆到pFTX5中。pGL3中的ARE–Luc构造与前面描述的ARE-CAT构造等效(Germain等人，2000年)荧光素酶替代CAT。
细胞培养与逆转录病毒感染
MDCK细胞在添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM中培养。逆转录病毒载体pBabe-puro-EGFP-ΔRaf-1-hbER（DD）包装在GP+E细胞中，用于感染表达生态逆转录病毒受体的MDCK细胞。用2.5μg/mL的嘌呤霉素（Sigma）进行筛选后，将细胞合并，并用FACS对Raf–ER表达细胞进行两次分选，以获得EGFP表达。前面已经描述过稳定表达V12Ras的MDCK细胞系(Khwaja等人，1997年).
胶原蛋白凝胶培养
电池（3×10三)悬浮于大鼠I型胶原蛋白（协同医疗产品）中，并覆盖含有5%FCS、5 ng/mL TGFα（研发系统）和0.04 IE/mL胰岛素（诺和诺德）的DMEM。中和TGFβ抗体（100 ng/mL鸡抗TGFβ1【研发系统】和20μg/mL小鼠抗TGFβ1, 2, 3【基因酶】）。培养基每隔一天更换一次。
共焦荧光显微镜
抗体来自：E-cadherin（转导实验室）；波形蛋白V3B（Boehringer Mannheim）；ZO-1（Zymed）；Cy3-标记羊抗兔IgG（Amersham）；Cy5标记的驴抗鼠IgG H+L（Jackson）。细胞角蛋白兔抗血清已在前面描述过(Reichmann等人，1992年). 将生长在24 mm Falcon细胞培养插入物（0.4μm孔径；Becton Dickinson）上的细胞固定在甲醇/丙酮（1:1）中，并按照前面所述进行免疫染色(Oft等人，1996年). 样品用蔡司LSM510共焦显微镜进行检查。
抗体、Western blotting和ELISA
抗体来自：ERK2/p42MAPK pan ERK（转导实验室）；雌激素受体MC20（Santa Cruz）；转化生长因子β1鸡；尿激酶型纤溶酶原激活物Ab-1（Neo标记物）；活化半胱天冬酶-8 C20、细胞周期蛋白A H432、Smad4 B8（圣克鲁斯）；Smad2（与Smad3交叉反应；转导实验室）。抗PCNA抗体（PC10）来自ICRF杂交瘤单元。如前所述，制备SDS样品缓冲液中的总细胞提取物和核提取物(Wong等人，1999年). 如前所述，在1%Triton X-100缓冲液中制备裂解液(Khwaja等人，1996年). 通过SDS-PAGE将每个样品中等量的蛋白质分解并转移到PVDF膜（Millipore）上，通过ECL（Amersham）观察免疫反应蛋白。活性半胱天冬酶的亲和标记如马丁斯（1997）使用0.5μM Z-EK（生物）D-aomk肽（大阪肽研究所）。根据制造商的说明，通过ELISA（Promega）测定细胞培养上清液中TGFβ1的分泌。
细胞凋亡测定
胰蛋白酶化后，将细胞固定在PBS中3.7%的甲醛中，并在室温下保持30分钟，用1μg/mL Hoechst 33258（分子探针）染色10分钟，并在紫外线照射下通过荧光显微镜检查。每个样本至少有500个细胞进行凋亡表型评分。
细胞周期分析
为了检测细胞周期分布，将细胞固定在70%乙醇中，在室温下用核糖核酸酶（100μg/mL）处理5min，用50μg/mL碘化丙啶（Becton Dickinson）染色5min，并用488nm激发流式细胞术进行分析。
核提取物和EMSA
核提取物的制备如前所述(Wong等人，1999年). 这个32P标记的c-jun寡核苷酸探针是在[α-32P] dCTP和[α-32P] dATP。EMSA反应如前所述进行(Germain等人，2000年)含有10-15μg核提取物。对于超位移实验，在添加探针之前，将以下抗体和竞争肽添加到核提取物中，并在室温下孵育5分钟：1μL小鼠抗Smad4（B8；Santa Cruz）、1μL不含或含0.5μL竞争肽的抗Smad3(Nakao等人，1997年)、0.5μL抗Smad2（转导实验室）或1μL抗-Smad2（SED；Nakao等人，1997年).
转染和荧光素酶测定
使用脂质体转染MDCK-Raf–ER细胞（GIBCO BRL），并将ARE-Luc报告子、XFAST-1表达载体和lacZ作为转染效率的内部控制。根据供应商（Promega）推荐的程序进行萤光素酶测定。以氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷（Calbiochem）为底物进行β-半乳糖甙酶测定，并在595nm处进行光度定量。所有转染均归一化为β-半乳糖苷酶活性。
