C/EBPs（CCAAT/增强子结合蛋白）是一个具有多种调节功能的转录因子家族。C/EBPα、β和δ在许多器官中以部分重叠的模式表达(曹等人，1991年;Williams等人，1991年)而C/EBPε仅限于髓系细胞(Yamanaka等人，1997年b). C/EBPγ（Ig/EBP）被认为具有抑制功能(Cooper等人，1995年)在大多数组织和细胞类型中低水平表达(Roman等人，1990年). 在细胞培养实验中，C/EBPα和C/EBPβ是肝细胞、脂肪细胞和髓细胞中细胞增殖和分化的有力调节器(约翰逊和威廉姆斯1994).
产生具有靶向破坏的小鼠c/ebp（电子商务平台）这些基因使人们对C/EBP蛋白的生物学功能有了更详细的了解。缺乏C/EBPα的小鼠出生后不久就会死亡，因为肝脏中的糖原储存减少(Wang等人，1995年)并显示粒细胞发育受损(Zhang等人，1997年). C/EBPε基因缺失的动物可以存活，但不能产生成熟的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，而年龄较大的小鼠会发展为骨髓发育不良(Yamanaka等人，1997年a). C/EBPβ缺陷小鼠表现出多重免疫缺陷(Screpanti等人，1995年;Tanaka等人，1995年)以及脂肪细胞分化缺陷(Tanaka等人，1997年). 此外，C/EBPβ-缺失的雌性不育，因为排卵受损，颗粒细胞分化受阻导致黄体缺失(Sterneck等人，1997年). 植入野生型卵巢可以恢复这些小鼠的生育能力。然而，它们的后代在出生后不久就死亡了，尽管幼崽的哺乳行为明显正常，但它们的胃中没有奶(Sterneck等人，1997年). 这些发现表明C/EBPβ突变也可能影响乳腺的发育或功能。
几个c/ebp（电子商务平台）乳腺中表达的基因在妊娠和哺乳期间受发育调控。C/EBPα和C/EBPβmRNA在处女动物的乳腺中表达。C/EBPα水平在妊娠和哺乳期间没有显著变化，而C/EBPβmRNA水平在妊娠期间被诱导，在哺乳中期略有下降，在复旧开始后48小时内再次升高。C/EBPδmRNA表达通常较低，但在退化开始时显著增加(Gigliotti和DeWille，1998年). C/EBPδ的表达也与培养中乳腺上皮细胞的生长停滞有关(O'Rourke等人，1997年).
乳腺的发育有不同的阶段(Imagawa等人，1994年)并受类固醇和肽类激素的相互作用控制(托珀和弗里曼1980). 虽然胚胎中形成了一个基本原基，但腺体的广泛形态发生始于青春期和卵巢类固醇激素的分泌。这一时期的特征是上皮管迅速伸长，穿透乳腺脂肪垫。在成熟的处女小鼠中，脂肪垫中充满了间隔均匀的初级导管，次级导管和较小的侧支从初级导管中发出。妊娠期间，在催乳素和胎盘激素的影响下，会进一步诱导乳房发育。在此期间，细胞迅速增殖，导致分泌性肺泡的形成，分泌性肺槽细胞的最终分化，以及大量乳蛋白的合成。乳蛋白的表达以特定的时间序列启动(Robinson等人，1995年). WDNM1是一种功能未知的分泌蛋白，首先产生，其mRNA在怀孕10天时很容易检测到。两天后，β-酪蛋白的mRNA变得可检测，而乳清酸蛋白（WAP）基因从第15天起以可检测的水平表达。因此，这些mRNA可作为上皮细胞分化状态的标记(Robinson等人，1995年).
在本研究中，我们检测了C/EBPβ缺陷小鼠的乳腺发育，发现处女、怀孕和哺乳动物的腺体发育受损。我们还利用卵巢和乳腺移植实验来评估这些缺陷是否源于乳腺上皮或间质室，或卵巢激素信号改变的可能影响。这两种实验方法都模拟了独特的生理情况，并揭示了功能性乳腺发育需要乳腺上皮本身中存在C/EBPβ。我们的研究表明，乳腺上皮细胞需要C/EBPβ才能在乳腺发育过程中产生适当的增殖和形态发生反应，并在怀孕期间分化为分泌细胞，这一点可以通过C/EBP？缺陷乳腺中完全没有乳蛋白表达来证明。
结果
正常乳腺发育过程中C/EBPβ的表达
在乳腺发育的不同阶段测量了对应于不同C/EBP亚型的稳态mRNA水平（图。). C/EBPα的表达在处女状态下最高，在整个妊娠期间保持在略低的水平。相比之下，C/EBPβ的表达在处女中最低，在整个妊娠期增加。然而，C/EBPβ在培养的几种转化或永生的乳腺上皮细胞以及乳腺上皮肿瘤中均有表达(Raught等人，1995年,1996;O'Rourke等人，1997年)，其在脂肪组织发育和功能中的作用也很明显(Tanaka等人，1997年以及其中的参考）。因此，观察到的信号可能来自腺体的两个组件。亲环素信号用作加载控制。
乳腺发育过程中C/EBP RNA的表达谱。Northern blot分析处女和怀孕野生型小鼠在妊娠不同阶段乳腺的总RNA。将印迹与所示基因的探针顺序杂交。
C/EBPβ缺陷处女小鼠乳腺发育异常
乳腺的广泛发育始于小鼠进入青春期的三周大。在C/EBPβ缺陷小鼠中，早在3周龄时就观察到延迟的导管生长（图。). 从末端芽与乳腺淋巴结的相对位置可以最好地评估导管外生长的程度。淋巴结位于乳头的远端，乳头是乳腺导管树的起源。在三周龄的野生型和半合子小鼠中，导管在靠近淋巴结处拉长（图。A） ●●●●。相反，C/EBPβ缺陷小鼠的乳腺导管较短，并且没有到达淋巴结（图。B） ●●●●。末端芽为棒状上皮增厚，是生长导管远端细胞增殖和导管伸长最快的部位。它们具有独特的结构，中央体细胞被一层独特的帽状细胞包围。在对照组和C/EBPβ缺陷小鼠中，终末芽的组织学表现正常（数据未显示）。在成熟的野生型小鼠中，分支广泛的导管占据乳腺脂肪垫（图。G） ●●●●。相反，大多数成熟突变小鼠的导管形态发生受到严重干扰。导管扩张，几乎没有侧支。在2到6.5个月大的8只动物中，正常导管形态发生和分支的失败程度不同（图。C–E）。在C/EBPβ缺陷动物的脂肪积累和整体消瘦中也观察到表型外显率的这种变化(Tanaka等人，1997年).
处女小鼠导管形态发生的整体分析。在3周龄的雌性中已经检测到生长差异。野生型小鼠的导管树(A类)大于C/EBPβ缺乏小鼠(B类). 箭头指向乳头。(C类)2个月大C/EBPβ缺陷小鼠导管发育异常的一例。主管道看起来像大管道，缺少二级分支（→）(D类)一只3.5个月大的C/EBPβ缺陷小鼠，导管非常不规则。请注意星点所示的膨胀气球状导管(E类)一只5个月大的C/EBPβ缺陷小鼠，其初级导管几乎正常，次级分支稀疏。(F类)一只4个月大的C/EBPβ缺陷小鼠进行卵巢移植。卵巢激素诱导二级侧枝的形成。(G公司)一只3个月大的野生型小鼠，导管系统发育完全。放大倍数A–D，4×;E–G，13×. （ln）淋巴结。
携带野生型卵巢的C/EBPβ缺陷小鼠的乳腺发育
因为C/EBPβ缺乏小鼠的卵巢功能被破坏(Sterneck等人，1997年)，我们询问是否可以通过野生型卵巢移植来挽救乳腺发育障碍。4只成年处女在3-4周龄时接受野生型卵巢，其导管形态发生部分恢复（图。F） ●●●●。外围导管的侧分支比中心导管多。这一结果表明，C/EBPβ-缺失处女小鼠乳腺发育受损的部分原因是缺乏正常的卵巢功能，并证实了卵巢类固醇在青春期乳腺发育中的重要性。
为了评估C/EBPβ是否只影响导管的形态发生或同时控制肺泡的发育，我们研究了怀孕小鼠的乳房结构（图。). 在受精后第18天，野生型腺体经历了广泛的小叶泡生长，充满了含有牛奶的扩大的肺泡（图。B、 D）。相反，具有野生型卵巢的C/EBPβ缺陷小鼠的乳腺发育（图。A、 C）类似于怀孕早期的野生型动物（未显示）。观察到两个明显的病变。脂肪垫中的肺泡密度受到严重抑制，在组织学水平上观察到很少或没有肺泡分化（图。A） ●●●●。具体来说，在野生型分泌细胞的细胞质中可以看到分泌小泡和脂肪球（图。D） 但在空白小鼠中不存在（图。C） ●●●●。这些结果表明，携带野生型卵巢移植的C/EBPβ缺陷孕鼠的肺泡发育和上皮细胞分化严重受损。
携带野生型卵巢移植的C/EBPβ缺陷小鼠肺泡发育。妊娠第18天C/EBPβ缺陷小鼠的乳腺(A类)稀疏充满发育不全的肺泡（→）。高倍镜下未见分泌分化迹象(C类). 野生型小鼠的乳腺(B类)充满分化的肺泡（→）。高倍镜下，扩张的腔（lu）和脂肪球可见(D类).
野生型宿主C/EBPβ缺陷乳腺上皮的发育
为了研究乳腺表型是否由上皮细胞受损或系统缺陷的间接影响引起，我们进行了乳腺上皮移植。三周大时，手术切除乳头和脂肪垫之间的区域，使脂肪垫不含内源性乳腺上皮。另一种同基因动物的一小块乳腺上皮可以被植入并发育。几周后，整个上皮树将从移植体中生长并穿透宿主脂肪垫(DeOme等人，1959年). 每只小鼠的一个脂肪垫接受一小块突变上皮，而对侧脂肪垫接受来自野生型或半合子动物的对照移植。因此，移植的上皮细胞在整个青春期和妊娠期都暴露在正常的循环激素水平和野生型基质中。在4周或8周后从11只小鼠身上获取移植物，并准备好完整的坐垫，以评估上皮外生长的形状和程度。在从野生型脂肪垫恢复的七个C/EBPβ缺陷上皮中，除了一个看起来正常外，其他所有上皮都产生了较厚的导管（图。B） 与野生型对照组相比（图。A） 只有三个人把脂肪垫填满了。这一结果表明，处女乳腺对C/EBPβ的需求是细胞自主的，C/EBPβ缺陷小鼠的上皮细胞即使在功能性卵巢的影响下在野生型宿主中发育，也能保持其异常生长特征。
野生型基质中C/EBPβ缺陷上皮的发育。半合子乳腺上皮(A、 C类)和C/EBPβ缺乏(B、 D类)将动物移植到3周龄野生型小鼠的脂肪垫中，8周后从处女小鼠中收获(A、 B类)或者在老鼠产仔后(C、 D类). 注意C/EBPβ缺陷移植处女期的粗初级导管（→）和不规则的侧支(B类). 足月时，C/EBPβ缺陷上皮(D类)小肺泡发育不全，而杂合子移植(C类)用发育完全的肺泡填充基质。(E类)腺体组织切片如所示C、。(F类)腺体组织切片如所示D。(G公司)足月通过宿主动物的内源性腺体切片。箭头指向肺泡。
为了分析上皮移植对妊娠激素的反应，对17个野生型宿主进行交配，并在动物产仔后12小时内采集其乳腺进行完整的坐骑和RNA分离。同样，C/EBPβ缺陷的足月鼠上皮的发育状态（图。D） 与怀孕早期的野生型动物相似（未显示）。与对照野生型动物或移植的野生型上皮细胞相比，C/EBPβ缺陷的肺泡发育不全（图。C） ●●●●。在组织学切片中，突变的肺泡看起来很小，管腔没有扩张，上皮细胞没有分泌活动的迹象（图。F） ，而在移植的半合子上皮中发现了完全分化的细胞（图。E） 和宿主的内源性腺体（图。G） ●●●●。总之，这些数据表明，C/EBPβ缺陷小鼠的上皮细胞即使嵌入野生型脂肪垫并在功能性卵巢的影响下在野生型宿主中发育，也保持其异常生长特征，这表明C/EBP？突变直接干扰上皮细胞。
C/EBPβ缺陷上皮中乳蛋白基因的表达
为了描述上皮细胞分化的状态，并开始在分子水平上识别突变上皮的缺陷，我们分析了几个乳蛋白基因的表达（图。). β-酪蛋白和WAP基因在怀孕第18天或哺乳第3天的野生型小鼠中高度表达。然而，在怀孕第18天，突变小鼠的乳腺组织中未检测到β-酪蛋白或WAP mRNA的表达（图。A） ●●●●。WDNM1的表达几乎无法检测到，至少比野生型小鼠低100倍（图。A） ●●●●。作为对上皮细胞对RNA样本贡献的对照，我们评估了上皮细胞特异性角蛋白18基因的表达(Singer等人，1986年)（图。A） ●●●●。当分析具有C/EBPβ缺陷上皮移植的野生型宿主的乳腺时，也获得了类似的结果（图。B） ●●●●。即使长时间暴露，也没有发现β-酪蛋白和WAP的表达（未显示）。因此，突变腺体的生化未分化表型与C/EBPβ缺陷肺泡的形态学未成熟外观一致。
妊娠和哺乳组织中的基因表达。(A类)半合子乳腺总RNA的Northern blot分析1)和C/EBPβ基因缺失的野生型卵巢小鼠（lane2)怀孕第18天。车道三代表哺乳第3天野生型小鼠的RNA。将印迹与所示基因的探针顺序杂交。(B类)Northern blot分析两种野生型寄主动物足月乳腺与半合子供体（lane）上皮移植的总RNA1)或C/EBPβ空供体（通道2). 车道三表示来自未运行的内源性腺体的RNA。按照中所述对印迹进行分析A。
我们还分析了在缺乏C/EBPβ的情况下C/EBPα的表达是否发生改变。野生型乳腺中C/EBPαmRNA水平显著低于C/EBPβ，并且在妊娠期间没有显著变化（图。;Gigliotti和DeWille 1998年). 大多数转录物可能来自脂肪组织(Tanaka等人1997). 在C/EBPβ缺陷妊娠小鼠的乳腺中，以及在野生型宿主的突变上皮的腺体中，C/EBPαmRNA很容易检测到，并且与对照组织中检测到的水平相当。在野生型和C/EBPβ缺陷腺体中也发现PPARγ2（脂肪细胞的标记基因）的类似表达水平（图。A、 B）。因此，C/EBPβ突变不会影响相关C/EBPα基因或基质特异性基因的表达。
C/EBPβ缺陷间质中野生型上皮的发育
脂肪细胞分化需要C/EBPβ(Tanaka等人，1997年)众所周知，乳腺上皮的发育依赖于与适当的间充质信号的相互作用(Robinson和Hennighausen 1997年). 因此，我们询问C/EBPβ缺陷脂肪垫是否与突变小鼠的乳腺表型有关。为此，将野生型上皮细胞移植到野生型或C/EBPβ缺陷动物的清除脂肪垫中。然后将含有上皮植入物的脂肪垫移植到野生型宿主中，以消除任何基因型特异性系统效应。在8周后收获的三分之三C/EBPβ缺陷脂肪垫中，野生型上皮的发育与野生型脂肪垫中的不明显（图。A、 B）。为了评估基质对肺泡发育的影响，四个宿主交配，分娩后立即分析乳腺组织。野生型和C/EBPβ缺陷型脂肪垫均出现野生型上皮广泛的小叶泡发育（图。C、 D）。从这些观察结果中，我们得出结论，基质室中C/EBPβ的缺失不会影响青春期或分泌上皮细胞终末分化期间导管的伸长和分支。
C/EBPβ缺陷间质中野生型上皮的发育。移植野生型上皮在处女期的发育(A、 B类)和在任期内(C、 D类)在野生型基质中也是如此(A、 C类)和C/EBPβ缺乏间质(B、 D类).
C/EBPβ缺乏的乳腺上皮细胞增殖减少
C/EBPβ缺陷上皮细胞的发育受损，特别是乳腺脂肪垫密度降低，可能是增殖率降低和/或凋亡率增加的结果。为了区分这些可能性，我们在怀孕的不同阶段向携带上皮移植的野生型小鼠注射BrdU。在妊娠第6、9、11、14和16天测定BrdU掺入作为上皮细胞增殖的一种测量方法（图。A） ●●●●。整个妊娠期C/EBPβ缺陷上皮细胞增殖较低。妊娠第6天时，其发病率显著降低，仅为野生型小鼠的40%。直到第14天，它一直较低，第16天又显著降低。相邻切片用于TUNEL分析，以确定凋亡细胞的数量。尽管没有统计学意义，但C/EBPβ缺陷小鼠妊娠早期的乳腺上皮细胞凋亡指数低于对照组，但从第11天开始增加（图。B） 。这些结果表明，在缺乏C/EBPβ的情况下，妊娠早期上皮细胞增殖增加和妊娠晚期增殖增加的诱导作用受到损害。
妊娠期C/EBPβ缺陷乳腺上皮细胞增殖和凋亡率。在指定的妊娠期，将携带对侧C/EBPβ缺陷和对照乳腺上皮移植的小鼠注射BrdU，2小时后处死。免疫染色检测BrdU标记细胞核，TUNEL染色检测凋亡细胞核。计数6000到9000个细胞核，并测定标记细胞的百分比。通过T检验计算平均值±标准偏差并进行比较。（*）AP（P）值<0.001。野生型（开放栅）和C/EBPβ缺陷型（填充栅）移植。
讨论
青春期、妊娠期和哺乳期的乳腺发育受到女性内分泌系统、乳腺上皮和间质复杂相互作用的调节。不同的基因通路与功能性乳腺发育的相关性已经在这些通路基因发生靶向突变的小鼠中得到了说明（有关综述，请参阅亨尼豪森和罗宾逊1998). 使用这种小鼠模型，可以将特定蛋白质的功能与出生后乳腺发育的不同阶段联系起来。而一些基因产物，如催乳素受体（PRLR）(Ormandy等人，1997年)，Stat5a转录因子(Liu等人，1997年)或LAR磷酸酶(Schaapveld等人，1997年)，控制妊娠期间肺泡的晚期增殖和分化，其他如孕酮受体（PR）(Lydon等人，1995年;Humphreys等人，1997年)和雌激素受体α（ER）(Boccinfuso和Korach 1997;Cunha等人，1997年)在青春期和怀孕早期需要。除了类固醇和肽受体外，细胞周期调节器和转录因子还控制肺泡发育。细胞周期蛋白D1的缺失(Fantl等人，1995年;Sicinski等人，1995年)和a-myb(Toscani等人，1997年)导致足月时肺泡严重发育不足，其组织学类似于C/EBPβ缺陷小鼠的缺陷。C/EBPβ现已成为控制增殖和早期分化的关键成分。对C/EBPβ的需求是上皮细胞自主性的，在缺乏C/EBP的情况下，上皮细胞只会发生有限的增殖，并且不会执行导致功能性腺体的分化程序（图。). 因此，我们提出C/EBPβ参与激素信号级联，其终点是哺乳期乳腺。
移植结果总结。C/EBPβ缺陷的乳腺在处女腺中显示出不规则的导管发育。相反，在野生型处女中，脂肪垫与带有小侧枝的规则导管交织在一起。足月时，野生型腺体充满分泌乳汁的小泡（开放的白色圆圈）。当C/EBPβ缺陷小鼠接受卵巢移植时，处女的导管形态发生更像野生型表型。然而，长期来看，C/EBPβ缺乏腺体稀疏地充满了发育不全的小肺泡，无法产奶（黑色圆圈）。野生型脂肪垫中C/EBPβ缺陷上皮的发育受到抑制，无法被野生型基质挽救。野生型上皮也能在C/EBPβ缺乏的基质中形成功能性肺泡。C/EBPβ缺陷上皮（红色）、C/EBPβ缺陷间质（粉红色）、野生型上皮（黑色）、野生型间质（黄色）。
全身与乳腺的内在影响
在C/EBPβ缺陷小鼠中观察到的乳腺缺陷提出了两种不同机制的可能性。一方面，导管的形态发生依赖于乳腺组织中C/EBPβ的存在。另一方面，导管的发育依赖于内分泌组织中C/EBPβ缺乏而中断的次级系统信号。由于C/EBPβ缺陷小鼠的生殖功能严重受损(Sterneck等人，1997年)有必要将C/EBPβ在乳腺内的作用与通过卵巢或其他信号间接施加的作用分开。通过卵巢移植，以恢复生理激素水平为目的，我们可以证明成熟处女中观察到的导管形态发生缺陷部分是继发性的，是由无功能卵巢引起的。在雌激素缺乏的小鼠中也观察到了受损的导管外生长和分支(Boccinfuso和Korach 1997)或孕酮受体(Lydon等人，1995年;Humphreys等人，1997年). 这证实了C/EBPβ缺陷的卵巢成分。尽管野生型卵巢移植可以使不育突变女性怀孕，但乳腺的发育仍然严重受损，生长受限，完全没有产奶能力。因此，C/EBPβ缺陷雌性无法在产后养育幼崽主要是由乳腺缺陷引起的，而不仅仅是母体行为或幼崽发育受损。然而，C/EBPβ也在其他器官中表达，如肾上腺（E.Sterneck，unpubl.）、胎盘(Chen等人，1995年)可能还有垂体(Wegner等人，1992年)对泌乳乳腺的发育很重要。因此，我们不能排除突变体的其他激素缺陷在一定程度上是乳腺发育受损的原因。
乳腺的发育依赖于上皮细胞和基质细胞之间的协调通讯(Daniel and Silberstein 1987年). 因为C/EBPβ对脂肪组织的发育和分化至关重要(Tanaka等人1997)，重要的是要解决突变基质对乳腺表型的贡献。我们的移植实验表明，突变的乳腺脂肪垫可以支持野生型乳腺上皮的正常发育和分化（图。). 因此，我们排除了基质成分是C/EBPβ突变小鼠乳腺发育缺陷的主要原因。所有这些数据都证明上皮细胞中C/EBPβ缺陷是C/EBP？突变小鼠乳腺发育受损的原因。移植实验证实，乳腺上皮细胞本身需要功能性C/EBPβ。总之，我们的数据表明上皮细胞C/EBPβ缺乏是乳腺发育不稳定的主要原因。
推测的C/EBPβ信号通路
来自多种细胞培养系统的实验证据导致了C/EBPβ参与细胞对多种不同细胞外信号的反应（有关综述，请参阅约翰逊和威廉姆斯1994). 乳腺的发育受系统性类固醇激素雌激素和孕酮、系统性肽类激素，包括EGF和催乳素（Prl）以及旁分泌生长调节剂的控制(托珀和弗里曼1980;亨尼豪森和罗宾逊1998). 因此，我们认为上皮细胞需要C/EBPβ来识别激素信号和/或执行由细胞外信号启动的程序。C/EBPβ很可能是任何单个信号通路的介体或多个通路的漏斗。未来，上皮细胞的培养和对各种信号反应的分析可能有助于深入了解乳腺表型的特定分子机制。
目前，在体内没有发现真正的C/EBPβ上游信号或下游靶点。然而，对C/EBPβ-缺失小鼠乳腺组织的形态和生化特征与其他工程小鼠突变体的比较已经为推测的疑点提供了一些线索。禁用Prl和JAK2/Stat5a通路会使乳腺发育的晚期失活，无法获得最终分化(Liu等人，1997年;Ormandy等人，1997年). 然而，广泛的肺泡结构部分填满脂肪垫，β-酪蛋白基因的表达接近正常水平(Liu等人，1997年). 同样，抑制素βB基因的失活会抑制功能性上皮分化的晚期，但β-酪蛋白的表达不受影响(Robinson和Hennighausen 1997年). 因此，我们认为C/EBPβ参与PRL或抑制素βB需求之前的阶段，其功能独立于JAK2/Stat5a途径。雌激素和孕酮受体的缺失对乳腺发育有更深远的影响。ER缺乏导致导管发育严重受损，PR-null小鼠肺泡发育迟缓(Boccinfuso和Korach 1997;Cunha等人，1997年). 研究表明，C/EBPβ通过介导白细胞介素-6启动子在乳腺癌MCF-7细胞中的阻遏作用，参与雌激素信号传导(Stein和Yang 1995年;Galien等人，1996年). 因此，雌激素反应受损可能是C/EBPβ缺陷乳腺上皮细胞观察到的表型的部分原因。
在C/EBPβ突变小鼠中，WAP、WDNM1或β-酪蛋白基因的长期表达几乎无法检测到，这表明它们是C/EBP？的靶点。我们认为β-酪蛋白基因是直接靶点，WAP基因是间接控制的。β-酪蛋白基因是一种主要的乳蛋白，其启动子包含四个C/EBP结合位点，这四个位点是组织培养中启动子的基础激活和激素依赖性激活所必需的(Doppler等人，1995年;Raught等人，1995年). 我们的体内结果证实了细胞培养结果。根据序列分析，在WAP基因启动子序列的4kb中没有发现C/EBP结合位点，C/EBPβ缺陷可能导致上皮细胞分化早期受阻，这反过来可以解释WAP和WDNM1缺乏表达的原因。然而，由于C/EBP蛋白的序列特异性较低，需要对WAP和WDNM1启动子进行直接分析，以确定C/EBP蛋白质在这些基因激活中的作用。
传递C/EBPβ转录信号的真正靶基因仍然难以捉摸。我们已经证明，早在妊娠第6天，乳腺上皮细胞的增殖潜能就降低了。足月乳腺组织中上皮细胞数量减少是由于细胞增殖总体减少，特别是在妊娠早期，即生长最快的阶段，以及妊娠后半期细胞凋亡率略有升高。这一观察可能反映了C/EBPβ缺陷上皮对上述同源物介导的信号无有效反应。许多细胞培养模型已将C/EBP家族成员与增殖、生长停滞或凋亡联系起来（有关综述，请参阅约翰逊和威廉姆斯1994). 这种观点提出了一种可能性，即C/EBPβ-缺乏会对上皮细胞分化造成早期阻滞，从而永远无法达到乳蛋白基因表达的阶段，而产奶不足只是突变的间接影响。这个问题可以在未来通过开发一种在妊娠不同阶段靶向条件缺失C/EBPβ基因的小鼠突变体来解决。
材料和方法
老鼠
先前已经描述过通过同源重组产生的C/EBPβ缺陷小鼠(Sterneck等人，1997年). 实验采用混合遗传株背景（129/Sv×C57BL/6）或纯129/Sv株背景的小鼠。未发现菌株特异性差异。因此，结果中不再进一步规定应变背景。纯合子突变体和对照受试者是来自交叉半合子父母的同卵双胞胎。这些小鼠被饲养在一个特定的无致病性设施中，从早上7点开始进行12小时的光循环，并随意进食和饮水。手术按照国家癌症研究所动物研究委员会和国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所的指南进行。在乳腺妊娠期，对小鼠进行交配，并在早上检查是否存在阴道塞。阴道塞出现的那一天被视为怀孕的第0天。
整体坐骑和组织学
第一个腹股沟腺在指定的发育时间被解剖，并铺在玻璃片上。如前所述，在Carnoy固定剂中固定2-4小时后，组织被水合并在胭脂红明矾中染色过夜(Robinson等人，1995年). 它们被脱水，在二甲苯中清除，然后装好。在立体显微镜上拍摄照片后，将样品嵌入石蜡中，在5μm处切片，并按照标准程序用苏木精和曙红染色。
乳房移植
如前所述，将乳腺上皮移植到清除的乳腺脂肪垫中(Robinson和Hennighausen 1997年). 对于混合遗传背景的供体，宿主动物为F1129/Sv和C57BL/6双亲的杂交后代。为了清除内源性乳腺上皮，从3周龄雌性小鼠的乳头和淋巴结之间切除组织，并将来自成熟处女供体的乳腺组织植入剩余脂肪垫的中心。移植的乳腺在手术后4或8周从处女小鼠身上获取。为了在足月时获得移植组织，宿主在接受移植8周后进行交配，并在分娩后第二天早上采集乳腺。如前所述，使用3周龄的小鼠进行整个脂肪垫的移植(Robinson和Hennighausen 1997年). 移除野生型小鼠的内源性腹股沟脂肪垫。将野生型和C/EBPβ缺陷小鼠的脂肪垫与野生型小鼠的上皮移植体植入对侧，并通过缝合线连接到腹膜。移植物是在8周后从处女小鼠或上述足月动物中获得的。
卵巢移植
按照说明进行卵巢移植(Sterneck等人，1997年). 简单地说，3到4周大的供体和受体室友被阿维汀麻醉。卵巢脂肪垫通过皮肤上的一个小切口向外移动。囊的一端被打开，卵巢被挑出并放置在37°C的PBS中。用镊子将囊打开，将替代卵巢推入囊中。然后将卵巢、输卵管和子宫放回体腔，确保卵巢完全插入囊内。用9mm伤口夹闭合皮肤切口，并对小鼠进行适当的术后护理。手术后两周，对小鼠进行交配。
RNA分离和Northern印迹
用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法从第一腹股沟腺制备RNA(Chomczynski和Sacchi 1987年)或根据制造商的协议使用RNA STAT-60试剂（TEL-TEST“B”，Friendswood，TX）。在1.5%甲醛凝胶中分离20微克总RNA，并将其印在GeneScreen膜上。如前所述，使用特定寡核苷酸分析牛奶蛋白RNA的表达(Robinson等人，1996年). 用大鼠C/EBPβ基因3′UTR的DNA探针分析C/EBP基因的表达(Sterneck等人，1997年)和850亿英镑Sma公司I–Hin公司dII片段代表小鼠C/EBPα基因的3′UTR。角蛋白18的探针为1.1 kb生态RI cDNA片段(Singer等人，1986年). PPARγ2通过1.5-kb囊跨越PPARγ2 cDNA编码区的I片段[由俄克拉荷马大学Jeffrey Gimble善意提供(Gimble等人，1996年)]. 寡核苷酸在55℃下杂交，cDNA探针在65℃下杂交。
细胞增殖和细胞死亡分析
在处死前2小时，向小鼠注射20μl/g体重的细胞标记试剂（Amersham细胞增殖试剂盒）。制备乳腺并将其固定在Tellyesniczky溶液中4小时。将组织包埋在石蜡中。为了检测掺入的BrdU，根据制造商的说明（Amersham Life Science）处理5μm切片。在来自相同样品的相邻切片上，通过TUNEL测定检测凋亡细胞，如Humphreys等人所述(Humphreys等人，1996年). 从样品的六到八个不同部分中计数6000到9000个细胞，并计算平均值。
