TrkB作为潜在的突触和行为标记

摘要

介绍

突触标记假说为L-LTP的突触特异性提供了令人信服的解释(弗雷和莫里斯，1997年;Govindarajan等人，2006年;莫里斯，2006). 强烈刺激可诱导体细胞或树突中塑性相关蛋白（PRP）的合成（局部合成）。然后，这些PRP在树突中随机运输。同时，刺激会产生“突触标签”，即捕获PRP的活性分子，它只会修改被刺激（激活）的突触。突触标记假说的石蕊试验是一项双通道实验，在该实验中，对同一神经元群的两个独立突触输入由两个刺激电极激活，而场EPSP（fEPSP）由CA1放射层中的一个记录电极监测（参见图5A类，​,66D类). 当强强直刺激激活特定CA1神经元群的一条传入通路（S1）时，施加在第二条独立通路（S2）上的弱强直刺激通常会诱导L-LTP，因为它会产生一个标签，捕获施加在S1上的强刺激所诱导的PRP(弗雷和莫里斯，1997年)（请参见图6D类).

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图5。

TrkB作为L-LTP的突触标记。A类，双通道记录方案。投射到同一CA1神经元的两条独立的Schafer侧支通路由位于记录电极两侧的两个刺激电极刺激。S1受强TBS（12TBS）刺激，而S2受弱TBS（4TBS）刺激。B类，两条Schafer侧支通路之间缺乏促进作用。上图，无论S1是否提前30毫秒被刺激，S2诱导的叠加红色和绿色fEPSP轨迹是相同的。底部，无论S2刺激如何，S1诱导的fEPSP都是相同的。C类，弱TBS（4TBS）未能诱导L-LTP。单用4TBS仅能诱导E-LTP（持续<2小时），但不能诱导L-LTP。D类，S2中的弱TBS在S1中的强TBS之前诱导L-LTP。在使用TrkB切片的典型“双通道”实验中^F616A型小鼠，12TBS至S1，4TBS至S2。12TBS的应用导致S1的L-LTP稳健。将4TBS应用于S2，通常只诱发E-LTP，现在诱发L-LTP。在4TBS前后使用载体（用黑条表示）治疗对TrkB中的L-LTP没有影响^F616A型片。E类，抑制TrkB激活阻止S2中E-LTP→L-LTP转换。“双通道”实验的完成方式与D类，除了1NMPP1（5μ米)应用了，而不是车辆（DMSO）。1NMPP1治疗可阻断S2的L-LTP，而不影响TrkB中S1的L-LT^F616A型片。F类，1NMPP1对野生型海马脑片中的L-LTP缺乏影响。在4TBS（黑条）前后将1NMPP1应用于C57BL/6小鼠海马脑片。12TBS在S1中诱导166±10%的增强，而4TBS在S2中诱导138±5%的增强。G公司，车辆对TrkB中的L-LTP缺乏影响^F616A型片。当在12TBS时施用溶媒时，S1（158±9%）和S2（135±10%）均诱导L-LTP。H（H），1NMPP1抑制S1中的L-LTP（104±5%），但在12TBS时使S2中的L-LTP保持不变（135±5%）。括号中显示了测试的切片数。每个实验至少测试三只动物。

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图6。

TrkB作为L-LTP突触标记的进一步证据。“双向”实验的方法与图5但在S1应用12TBS前40分钟（而不是60分钟）对S2应用4TBS。黑色条表示1NMPP1或车辆（DMSO）的应用。A类，用1NMPP1（5μ米)以TrkB为单位^F616A型切片阻断S2中的L-LTP，而不影响S1中的L-LTP。B类，L-LTP由S1中的12TBS和TrkB中S2中的4TBS诱导^F616A型4TBS前后用载体处理切片。C类在4TBS前后，用1NMPP1处理野生型（C57BL/6）切片，S1中的12TBS和S2中的4TBS诱导L-LTP。D类，Synaptic标记模型，用于双向录制。强刺激（12TBS）和弱刺激（4TBS）均可产生短寿命突触标记，而PRP只能由强刺激诱导产生。标记波和PRP波的重叠表明捕获了PRP，导致该特定途径中的L-LTP。

一些证据表明，脑源性神经营养因子（BDNF）是一种候选的PRP。首先，在L-LTP诱导的刺激下，CA1锥体神经元中BDNF表达增强(Patterson等人，1992年)可能通过启动子IV的活性依赖性激活增强BDNF转录介导(卢，2003;Greer和Greenberg，2008年). 其次，在BDNF表达减少的小鼠中，强烈的θ-脉冲刺激（12次脉冲，每4次脉冲以100 Hz或12TBS产生一个标记）未能诱导L-LTP，但应用成熟的BDNF（mBDNF）可缓解L-LTP缺陷(Patterson等人，2001年;Pang等人，2004年). 第三，BDNF可以通过弱TBS将E-LTP转化为L-LTP，这可以产生“突触标记”，但不能表达PRP（BDNF）(Pang等人，2004年). 在BDNF水平升高的VP16-CREB小鼠中，弱刺激能够诱导L-LTP，而这可以被BDNF清除剂TrkB-IgG逆转(Barco等人，2005年). 在海马体中BDNF基因缺失的小鼠中（或者更具体地说，在突触后CA1神经元中，可以产生PRP），在“双向”实验中，微弱的刺激不再能够捕获PRP来维持S2中的L-LTP(Barco等人，2005年). 最后，当L-LTP被蛋白质合成抑制剂阻断时，可以通过外源性BDNF的应用完全挽救它(Pang等人，2004年). 众所周知从头开始的L-LTP需要在刺激后70分钟内表达BDNF，但不能迟于刺激(Kang等人，1997年).

BDNF分泌后结合并激活其受体TrkB，TrkB定位于树突棘(Drake等人，1999年;Ji等人，2005年). 如果BDNF是一个PRP，那么TrkB显然是突触标记的候选者。理论上，突触标签必须满足几个标准(Martin和Kosik，2002年;Kelleher等人，2004年;Lu等人，2008)：（1）标签可被仅诱导E-LTP的微弱刺激激活；（2） 标签的寿命为～1～2h；（3） 标签的激活不需要蛋白质合成；（4） 标签以特定于输入的方式被诱导并且相对固定；以及（5）标签必须与L-LTP的PRP交互（并因此捕获）。

在本研究中，我们检验了TrkB作为L-LTP突触标记的假设在体外和LTM的行为标签体内我们证明，TrkB可以被弱TBS和强TBS以瞬时和蛋白质合成依赖的方式激活。根据我们的成像结果，激活是局部的和不活动的。此外，使用双路径协议和TrkB^F616A型TrkB可以通过基因修饰被可逆抑制的突变小鼠，我们证明TrkB对捕获L-LTP至关重要。最后，使用最近开发的行为标记范式，我们提供了证据，证明TrkB可能作为长期记忆巩固的行为标记体内我们的发现表明，TrkB是L-LTP和LTM突触特异性表达的潜在标记。

材料和方法

TrkB公司^F616A型敲入小鼠。

所有涉及动物的程序均由NIH动物护理和使用委员会批准。TrkB公司^F616A型敲除小鼠是通过将内源性TrkB的ATP结合囊替换为苯丙氨酸（F616）突变为丙氨酸（A）的囊来产生的。TrkB的酪氨酸激酶活性^F616A型可被膜渗透性小分子1NMPP1（Calbiochem）选择性抑制(Chen等人，2005年).

BDNF-结合珠的制备。

BDNF-bads的产生基于链霉亲和素和生物素之间的非共价但非常紧密的结合作用。为了在温和的生理条件下生物素化BDNF，使用FluoReporter Biotin-XX蛋白标记试剂盒（Invitrogen）。简单地说，50μg BDNF用200μl蒸馏水和20μl 1米碳酸氢钠（0.84 g NaHCO_三在10ml蒸馏水中；pH值8.4）。将两微升活性形式的生物素-XX和磺基琥珀酰亚胺酯钠盐添加到含有BDNF的碳酸氢盐溶液中的反应管中，并在室温下培养2小时。收集生物素化BDNF并通过旋转柱纯化。在柱纯化后，大约80-90%的生物素化BDNF被回收。BDNF-生物素的生物活性通过使用呋喃-2橙的钙成像进行评估。为了量化生物素化BDNF，我们通过使用纳米滴分光光度计（纳米滴技术）分析280nm处的吸光度来测量生物素标记BDNF的蛋白质浓度，因为生物素在280nm处不吸收。然后，使用生物素定量分析试剂盒（Invitrogen）测定蛋白质上生物素标签的数量。为了制作BDNF载体，用PBS将100μl链霉亲和素珠（1.25%w/v；Bangs Laboratories）用PBS冲洗三次，每1μl珠的生物素化结合物结合能力为7.5μmol，离心，并重新悬浮在100μl 0.1米PBS，pH 7.4。为此，添加30μg新制BDNF-生物素，并在4°C下在旋转振动筛上混合过夜（12-14小时）。将BDNF-载体离心并冲洗三次，以去除任何未结合的BDNF-生物素。将造粒BDNF底座重新悬浮在100μl（0.1μl）中米PBS并在4°C下储存，直至使用。单个珠子的直径为～40 nm。

pTrkB染色和定量。

培养14天的海马神经元在体外(Ji等人，2005年)在BDNF珠孵育前1小时，用50 ng/ml的BDNF处理30分钟，其中BDNF在珠上结合，无论是否应用k252a。在室温下使用4%PFA仔细固定细胞20分钟，无任何干扰，并在室温下用0.1%Triton X-100渗透10分钟。用pH 7.4的PBS清洗样品三次，并用TrkB[TrkB（794）：sc-12；Santa Cruz Biotechnology]和pTrkB的相应一级抗体培养(Arévalo等人，2006年;Spencer-Segal等人，2011年)在4°C下使用1:2000稀释液过夜。用罗丹明结合二级抗体清洗和探测样品，并在室温下培养1 h。最后，用PBS再次清洗细胞三次，并使用与防臭试剂预先混合的Mowiol进行安装。在倒置蔡司共焦激光扫描显微镜（LSM-510-Meta系列）中，使用63倍物镜对载玻片进行成像。使用LSM Meta分析仪和ImageJ（NIH）对图像进行处理和分析。

对于海马脑片中的pTrkB染色，在脑片恢复后，用12TBS刺激Schaffer侧支（每个12TBS有4个100 Hz的脉冲，间隔200 ms）刺激CA1区。切片在4%PFA固定前在ACSF中再培养30分钟。切片在4%PFA中固定2小时后，在30%蔗糖中脱水过夜。切片在最佳切割温度复合物（OCT）下切除至40μm。切片在室温下在封闭缓冲液（3%驴血清+0.3%Triton X-100，PBS）中培养1h，并与兔抗pTrkB816抗体（1:500）培养(Arévalo等人，2006年)在4°C下过夜。使用的二级抗体是Alexa Flour 488驴抗兔IgG（1:500，Invitrogen）。切片在装裱前用DAPI（Sigma）培养3-5分钟。图像由尼康A1R共焦显微镜（4×或63×；尼康仪器）拍摄，并通过Image-Pro Plus 6.3（媒体控制论）进行分析。

急性海马脑片的制备。

根据NIH指南，从8至10周龄雄性小鼠制备冠状海马切片（400μm）。简单地说，在冰镇切片缓冲液（单位：m）中使用振动切片机（NVSLM1，WPI）切割海马切片米：127氯化钠，26氯化钠_三，1.2千赫₂人事军官₄，1.9氯化钾，1.1氯化钙₂，2 MgSO₄, 10d日-葡萄糖）以95%O起泡₂和5%CO₂然后将切片转移到含有含氧人工脑脊液（ACSF；单位：m米：127氯化钠，26氯化钠_三，1.2千赫₂人事军官₄，1.9氯化钾，2.2氯化钙₂，1 MgSO₄, 10d日-葡萄糖）在34°C下持续30分钟，在22°C下再持续30分钟以进行恢复，然后转移到用32°C充氧ACSF持续灌注的浸没记录室中（速率：2 ml/min）。记录前，在记录室中平衡切片至少15分钟。通过这种准备，在切片中获得了稳定的长记录（参见图4E类).

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图4。

TrkB激活在L-LTP的前40分钟内起关键作用，但在STP中不起关键作用。A类，1NMPP1阻断了12TBS诱导的TrkB在TrkB中的激活^F616A型老鼠。TrkB海马脑片CA1区^F616A型12TBS后1h对小鼠进行显微解剖。每个实验使用三只小鼠，每个条件使用四片CA1切片。同样的实验重复了五次(n个=5），每批新动物。1NMPP1（5μ米)而非载体控制（DMSO），阻止了12TBS诱导的TrkB中pTrkB的增加^F616A型老鼠(*第页<0.003；单向方差分析）。B类，通过在TrkB衍生的成年海马脑片中使用1NMPP1抑制TrkB激活来阻断12TBS诱导的L-LTP^F616A型老鼠。1NMPP1（5μ米)在整个实验过程中应用于切片，完全阻断了L-LTP（蓝色菱形），而车辆控制没有任何效果（黑色圆圈）。1NMPP1对对照小鼠（C57BL/6）（粉红色钻石）的L-LTP没有影响。C类12TBS后立即应用1NMPP1也阻断了TrkB中的L-LTP^F616A型片。D类，12TBS（红色）后0至40分钟内使用1NMPP1抑制L-LTP，而不是在TrkB 12TBS后45分钟^F616A型切片（黑色）。E类，在不进行任何治疗的情况下，在>4小时内获得稳定的基线记录。F类、1NMPP1和车用TrkB中无法区分的STP^F616A型片。2TBS诱导STP。在这两种情况下，fEPSP在2TBS后60分钟恢复到基线。

电生理学。

将ACSF填充玻璃电极（电阻<1 MΩ）放置在CA1区放射状地层中进行细胞外记录。每15秒用0.2毫秒脉冲刺激Schaffer侧支，诱发突触反应。对于双向记录，刺激电极放置在放射层记录电极的两侧。两条通路的独立性通过配对脉冲促进方案进行了测试（参见图5B类). 系统地增加刺激强度以确定最大fEPSP斜率，然后调整以产生40-60%的最大（fEPSP）斜率。最大fEPSP小于0.5 mV、大纤维截击或录音过程中纤维截击有实质性变化的实验被拒绝。

记录现场EPSP（AxoClamp 2B放大器、分子器件），在1 kHz下过滤，在10 kHz下数字化（Axon Digidata 1322A），并存储用于离线分析（Clampfit 9）。fEPSP的初始斜率表示为基线平均值的百分比。在总结图中，每个点代表4个连续回答的平均值。时间匹配的标准化数据在整个实验中求平均值，并表示为平均值±SEM，每个图中显示了测试切片的数量。

总TrkB和磷酸化TrkB的蛋白质印迹。

在刺激后的不同时间点从记录室取出切片。在冰上快速解剖CA1区域并将其储存在干冰上。在冰冷的RIPA裂解缓冲液中裂解每种条件下的四片CA1。将裂解产物与样品缓冲液混合进行SDS-PAGE。将样品煮沸5分钟，进行SDS-PAGE，并使用兔抗磷-TrkA（Tyr490）（1:1000，Neuromics）和兔抗TrkB[1:1000；TrkB（794）：sc-12；Santa Cruz Biotechnology]进行免疫印迹。使用Bio-Read的分子分析软件进行密度分析。相同的实验（具有多个时间点）重复至少六次(n个= 6).

行为任务。

我们使用了一种小鼠行为标记范式，该范式与之前通过蒙卡达和维奥拉（2007）对雄性小鼠（8-12周）进行盲法腹腔注射载体（DMSO）或1NMPP1（1m）的试验米，每只小鼠400μl）。实验前，小鼠在试验室中习惯化至少30分钟。抑制性回避（IA）任务在计算机控制的双子座回避系统（圣地亚哥仪器）中执行，该系统包含两个由断头台门隔开的相等腔室。在执行任务时，右腔室保持明亮，而左腔室保持黑暗。训练开始时，将鼠标放在明亮的腔室中，面朝关闭的断头台门。允许老鼠探索被照亮的房间2分钟。然后打开门，让老鼠探索被照明的房间和黑暗的房间5分钟。在探索期结束时，老鼠回到被照亮的房子后，门被关闭。两分钟后，门被打开了。进入暗室的延迟时间由计算机记录。进入暗室后，门被关闭，并发出2次微弱的脚电击（0.1 mA，100 ms，间隔1s）。十秒钟后，老鼠从黑暗的房间里被移走，放回了家里的笼子。在训练后60分钟或24小时，将鼠标放在背靠关闭的断头台门的照明室内，以评估记忆力。2分钟后，打开门，记录进入暗室的潜伏期，作为记忆测量。

在IA训练之前，通过将小鼠暴露在开阔场地（OF）进行行为标记实验。OF是一个尺寸为35厘米（宽）×35厘米（长）×35 cm（高）的塑料盒。四个物体被随机放置在竞技场中供老鼠探索。经过15分钟的探索，老鼠被从盒子里拿出来，放回笼子里1小时，然后接受IA训练。

使用热板镇痛仪（哥伦布仪器）进行热板试验。温度设定为55°C。用手记录舔前爪和后爪的潜伏期，以测量足部疼痛感。

使用环形平台进行高架零迷宫测试，该平台由两个由等长开口部分隔开的壁（白色树脂玻璃）部分组成。每只老鼠被放置在一个开放的部分，但直接面对一个有墙的部分。用摄像机记录活动5分钟，并使用Clever Systems TopScan（Clever Sys）分析开放部分的时间。

结果

TrkB的瞬时、局部和蛋白质合成依赖性激活

作为受体，TrkB自然符合上述突触标记的第五个标准。为了研究TrkB是否符合其他标准，我们检测了强或弱刺激后TrkB的激活（磷酸化）水平。根据先前的研究结果，BDNF对TBS诱导的L-LTP至关重要(Patterson等人，2001年;Pang等人，2004年). 用12TBS或4TBS刺激CA1的Schaffer侧支区（12或4次脉冲，每4次脉冲频率为100 Hz）。在刺激后的不同时间点，在冰上快速解剖CA1区域并在干冰中冷冻。对收集的组织进行蛋白质印迹以检测磷酸化的TrkB（pTrkB），并且TrkB磷酸化表达为pTrkB与总TrkB水平的比率。在每个实验中，pTrkB/TrkB比值均根据未刺激切片的对照条件进行标准化。在强TBS（12TBS）和弱TBS（4TBS）后，TrkB磷酸化显著增加(图1A类). pTrkB水平迅速升高，在30分钟左右达到峰值，并在TBS刺激后约2小时逐渐降至基线水平(图1B类). TrkB的瞬时激活不受蛋白质合成抑制的影响（40μ米茴香霉素）(Fonseca等人，2006年)，无论交付的TBS是弱TBS还是强TBS(图1B类，C类). 此外，TrkB磷酸化的程度不依赖于刺激强度（12TBS vs 4TBS）(图1A类). 因此，神经元可能不使用TrkB磷酸化作为辨别突触刺激强度的方法，而是辨别突触是否受到刺激。相反，刺激强度更可能通过钙的含量来辨别²⁺流入，流入(Malenka和Siegelbaum，2001年;Dan和Poo，2006年). 因此，TrkB似乎满足前面介绍中描述的突触标记的前三个标准。

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图1。

TBS对TrkB的瞬时和非蛋白合成激活。用12TBS或4TBS刺激Schaffer侧支，刺激CA1区，在TBS后的不同时间点快速解剖，并进行Western blotting。对于每个单独的时间点，pTrkB信号与TrkB总信号的比值根据同一实验的控制条件进行标准化。每个实验使用三只小鼠进行多个时间点的实验，每个时间点包含来自四个海马切片的CA1。相同的实验重复了至少六次(n个=6）英寸A类和B类，每一批都有新的动物。A类12TBS和4TBS诱导海马脑片TrkB激活的例子。TrkB的激活模式无明显差异。B类，量化4TBS在添加和不添加蛋白质合成抑制剂茴香霉素（40μ米). 包括由12TBS诱导的pTrkB时间进程以进行比较。C类，在12TBS后1小时测量TrkB活化的蛋白质合成独立性。示例（顶部）和定量（底部，n个=4）。茴香霉素（40μ米)不能阻止TBS诱导的pTrkB增加(*第页<0.05，单因素方差分析；“12TBS”组和“12TBS+茴香霉素”组之间无差异）。

为了检验第四个标准，即TrkB磷酸化是否局限于BDNF释放和物理不动的部位，我们首先使用海马培养物。为了用外源性BDNF刺激树枝晶的单个斑点，而不是均匀地刺激整个树枝晶，我们用小珠（40 nm）偶联BDNF。将BDNF缀合的荧光珠（绿色）应用于培养的海马神经元，图2E类). BDNF-bad应用30分钟后，细胞固定用于pTrkB染色(Bath等人，2008年). 如所示图2A类，一些BDNF-bads与神经元树突结合，而其他则没有。BDNF-bads特异性诱导pTrkB染色而不影响总TrkB信号(图2G–I型). 值得注意的是，TrkB磷酸化（红色斑点）似乎局限于与树突膜接触的BDNF珠附近，pTrkB染色在与BDNF珠并置的树突斑点中最强(图2A类). 在未与BDNF基底接触的树突中，pTrkB信号水平很低(图2A类). 由于存在多个珠子聚集的情况，我们仅量化了珠子未聚集的情况。荧光斑点的定量分析表明，在距离BDNF-基底接触点5-10μm的树突状区域，pTrkB信号显著减少，而在BDNF-基接触点以外20μm处，pTrkB染色减少到接近基线水平(图2F类). 在BDNF基底非常接近但实际上没有接触树突的情况下，pTrkB信号极低（“BDNF w/o touch”in图2F类). 当BDNF-bads接触同一神经元的一个单独分支时，在不含BDNF-bad的树突状分支上几乎检测不到TrkB磷酸化(图2F类).

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图2。

BDNF对TrkB的局部激活。用BDNF-beads（绿色）处理海马神经元30分钟，并用磷酸化TrkB（pTrkB，红色）抗体染色。局部pTrkB免疫反应性在BDNF珠接触的树突中显著增加（箭头）。A类，优先激活与BDNF基底接触的树突上的TrkB。蓝色框突出显示的区域被放大并显示在右下角。注意与BDNF底座（绿色）相关的强pTrkB信号（红色），如箭头所示。B类，通过k252a阻断BDNF载体诱导的TrkB活化。用k252a和BDNF-beads（绿色）处理的神经元，即使树突被BDNF-boads接触，也显示出很少的pTrkB免疫反应性（箭头所示）。C类，仅用珠子触摸不会激活TrkB。用不含BDNF的非偶联珠（绿色）处理神经元。即使珠子接触树突，树突沿线也检测到少量pTrkB免疫反应（箭头所示）。D类，培养海马神经元中基础TrkB激活水平低。在没有BDNF珠（星号）的树突中检测到少量pTrkB免疫反应。E类，沿着培养的海马神经元树突有丰富的TrkB免疫反应性（红色）。箭头显示BDNF基底接触树枝晶的位置。F类，不同条件下pTrkB免疫反应的定量。通过ImageJ对沿着树突的单个pTrkB免疫荧光斑点的强度进行量化。将BDNF微球接触点（0-5μm，5-10μm，20-50μm）的所有斑点的强度相加，并表示为任意单位（AU）。pTrkB信号从BDNF-基底接触点开始沿树枝晶逐渐减少。请注意，尽管BDNF-bead接触了其他分支，但BDNF-boad未接触的树枝状分支上几乎没有pTrkB信号。测量的感兴趣区域显示为“n个“针对每个条件***第页< 0.001; Newman–Keuls分析遵循单向方差分析。G–I型，培养海马神经元树突TrkB总免疫反应性（红色）的共焦图像(H（H）)或不带(G公司)BDNF偶联珠，以及定量(我). 注意，BDNF-载体处理的总TrkB水平与不含BDNF-结合珠的对照相当。

进行了一系列对照实验，以表明pTrkB染色是特异性的和BDNF依赖性的：（1）在没有BDNF的情况下，pTrkB的基线信号非常低(图2D类); （2） BDNF-β诱导的TrkB磷酸化被trk激酶抑制剂k252a完全阻断(图2B类)（200牛顿米k252a单独对pTrkB无影响，数据未显示）；和（3）未与BDNF缀合的珠对TrkB磷酸化没有影响(图2C类).

接下来，我们研究了TBS刺激海马脑片（可能导致局部BDNF分泌）是否可以诱导局部TrkB磷酸化。对成年海马脑片CA1锥体神经元远端的Shaffer侧支进行一系列高频刺激（12TBS）。30分钟后，将切片固定、切片，并进行pTrkB免疫组织化学染色。在CA1神经元的近端（黄色框）或远端（红色框）进行仔细的共焦显微镜检查(图3A类). 我们发现12TBS诱导远端pTrkB免疫反应性显著增加(图3D类，E类)但不是近端区域(图3B类，C类)CA1区域。Image Pro Plus对pTrkB阳性荧光点的定量分析显示，仅在TBS刺激的（远端）神经突附近区域，阳性点的数量增加了2.3倍(图3F类，G公司). 因此，可以想象，TBS诱导局部BDNF分泌，进而激活位于树突5-10μm内的TrkB，在受刺激部位或附近产生标签(Lu等人，2008).

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图3。

12TBS诱导海马脑片CA1树突状区TrkB活化。A类海马切片pTrkBY816（绿色）和DAPI（蓝色）双重染色。海马CA1神经元的近端和远端分别用黄色和红色方框突出显示。刺激电极的位置由白色圆圈表示。B类，C类，对有或无12TBS的细胞体近端区域的pTrkBY816（绿色）和DAPI（蓝色）进行双重染色。注意，DAPI染色的CA1神经元细胞体位于图像的上部。D类，E类在有或无12TBS的情况下，对细胞体远端的pTrkBY816和DAPI进行双重染色。注意12TBS后pTrkB染色显著增加。F类，G公司，分别量化CA1神经元胞体近端和远端pTrkB阳性点的数量(*第页< 0.001,t吨测试）。

TrkB作为LTM的行为标签

确定TrkB是否也作为突触标记来调节长期记忆（LTM）的形成体内，我们进行了行为标记实验，这是一种新开发的行为范式，被认为是突触标记的类似物(蒙卡达和维奥拉，2007年). 简言之，弱IA训练诱导的短时记忆（STM）可以通过探索新的环境巩固为LTM。我们使用了一个单次IA测试任务。该仪器包含两个腔室，一个照明，一个黑暗，由断头台门隔开。在训练过程中，老鼠最初被放在发光的房间里。一旦小鼠进入暗室，每隔1s进行两次微弱的足部电击（0.1 mA，100 ms）。在60分钟或24小时后的测试中，通过测量进入暗室的潜伏期来评估记忆力。我们调整了脚冲击，使弱训练任务在野生型（C57BL/6）和TrkB中都能诱发STM，而不是LTM^F616A型(图7A类，C类)老鼠。当TrkB中注射1NMPP1阻断TrkB激活时，这种STM完好无损^F616A型老鼠(图8A类).

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图7。

TrkB作为LTM的行为标记。在IA任务中训练小鼠，每1s进行两次微弱的足部电击（0.1 mA，100 ms）。记录从照明室到暗室穿过门的延迟时间，作为记忆测量。数据绘制为平均值±SEM，在单因素方差分析后进行Newman–Keuls分析。每列显示了受试小鼠的数量。A类，C类用不同组的野生型小鼠或TrkB评估STM（60分钟）和LTM（24小时）^F616A型小鼠。弱IA训练只诱发STM，不诱发LTM。B类在新环境（四个物体的开放场，OF）中的探索将弱IA诱导的STM合并为LTM。1NMPP1没有阻止野生型小鼠的固结。D类、TrkB中新奇推广的LTM^F616A型腹腔注射1NMPP1阻断小鼠。

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图8。

1NMPP1抑制TrkB后，短期记忆、疼痛感、情绪状态和运动正常。A类，1NMPP1抑制TrkB后短期记忆正常。在腹腔注射1NMPP1或载体后10分钟，用两次微弱的足电击（0.1 mA，100 ms）以1s的间隔对小鼠进行IA任务训练。记录从照明室到暗室穿过门的延迟时间，作为记忆测量值，并绘制为平均值±SEM。B类，1NMPP1抑制TrkB后疼痛感觉正常。在55°C下进行热板试验。舔前爪和后爪的延迟绘制为平均值±SEM。C–E类，1NMPP1抑制TrkB后的正常情绪状态和运动。使用环形平台进行高架零迷宫测试，该平台由两个由等长开口部分隔开的壁（白色树脂玻璃）部分组成。记录每只小鼠的活动5分钟。注射1NMPP1的小鼠在张开双臂中的时间与注射溶媒的小鼠相似(C类). 此外，1NMPP1不影响小鼠进入开放臂的次数(D类)以及老鼠在迷宫中行走的总距离(E类).

当小鼠在IA训练前1小时被引入一个新的环境（开放场或有4个物体的OF）中15分钟时，弱训练任务诱导的STM巩固为LTM，24小时后的一次测试中潜伏期增加证明了这一点(图7B类，D类). 另一方面，训练期间的潜伏期在图7，A类和B类(第页=0.36，单向方差分析）。接下来，我们测试了由弱训练诱导的TrkB标签抑制是否可以阻止STM向LTM的新激活转换。给TrkB注射1NMPP1^F616A型或野生型小鼠在IA训练前10分钟(图7B类，顶部）。值得注意的是，以已知浓度一次性腹腔注射1NMPP1可阻断TrkB活化(Johnson等人，2008年)TrkB中的LTM严重受损^F616A型老鼠(图7D类)但不是野生型小鼠(图7B类). 因此，在标准行为标记范式中，抑制TrkB可以阻止STM向LTM的新颖诱导转换，进一步支持TrkB可能充当突触标记的概念体内.

排除1NMPP1抑制TrkB降低TrkB痛阈的可能性^F616A型小鼠、注射1NMPP1的小鼠进行热板试验。记录了舔前爪和后爪的潜伏期，在1NMPP1组和载体组之间没有区别(图8B类). TrkB中1NMPP1的管理^F616A型小鼠可能改变了他们的情绪状态，导致记忆障碍。为了解决这个问题，进行了高架零迷宫实验。注射1NMPP1的小鼠与注射载体的小鼠在张开双臂上的时间相似(图8C类)参加公开募捐的次数相当(图8D类). 此外，注射1NMPP1的小鼠和运载工具的小鼠在迷宫中的总行走距离无法区分(图8E类). 总之，我们的研究结果表明，TrkB是突触标签，也是某些形式LTM的行为标签。

讨论

“突触标记假说”自诞生以来，就启发了许多人寻找突触标记。然而，很少有分子被推荐为候选分子(弗雷和弗雷，2008年). PRP和突触标签的性质和身份正在进行深入研究(弗雷和弗雷，2008年). 两个通路实验表明，阻断蛋白激酶A（PKA）或其与A激酶锚定蛋白（AKAP）的相互作用可以阻止突触捕获，这表明PKA或其锚定在活性突触上可能是L-LTP的突触标记(Huang等人，2006年;Young等人，2006年). 钙/钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）也被认为是L-LTP特异性标记(Sajikumar等人，2007年). 迄今为止的研究都是基于药物抑制剂在双向实验中的使用。然而，有必要证明这些标签是通过弱刺激以蛋白质合成依赖的方式瞬时和局部激活的。在最近的一项研究中，Homer-1a的NMDA依赖性、输入特定的“脊椎条目”被建议作为L-LTP标签(Okada等人，2009年). 然而，L-LTP和LTM中是否需要Homer-1a尚待确定。使用遗传、药理和生物化学相结合的方法，我们现在表明TrkB符合Kelleher等人（2004），对于L-LTP标签。第五个标准是已知的，因为TrkB是一种结合BDNF的天然受体。应该指出的是，尽管在“双向”实验中强烈暗示为PRP(Barco等人，2005年)BDNF可能在标记过程中扮演更复杂的角色（见下文）。最重要的是，我们表明TrkB参与了行为标记体内.

虽然多个分子可能参与突触标记过程，但TrkB作为突触标记具有几个有趣的特征。首先，与先前提出的标签（主要是细胞溶质分子）相比，TrkB是一种相对固定的膜蛋白，因此更可能以局部和突触特异性的方式被激活。事实上，我们使用海马神经元培养物和急性切片进行的成像实验表明，TrkB激活仅限于高频突触活动诱导的局部BDNF分泌部位附近的树突状斑点。BDNF是一种带正电荷的分子，分泌后往往与细胞表面膜结合，扩散非常有限(Nagappan等人，2009年). 因此可以想象，刺激后突触前向突触间隙分泌BDNF可以激活受刺激突触附近的TrkB标签。第二，TrkB贩运和信号传递的活动调控可能提供TrkB与其他假想标签和L-LTP中PRP之间的联系。例如，突触活动增加，Ca²⁺通过钙的流入²⁺通道和NMDA受体以及CaMKII的激活已被证明有助于TrkB在海马神经元中的膜插入(Du等人，2000年). 突触活性通过BDNF的局部分泌和细胞内cAMP的升高，也增强了TrkB向含PSD95的树突棘的募集(铃木等人，2004年;Ji等人，2005年;吉井和君士坦丁-普顿，2007年). 此外，当cAMP–PKA通路被阻断时，TrkB磷酸化显著减弱，表明cAMP-PKA调控TrkB信号(Ji等人，2005年). 这些结果表明，CaMKII和cAMP–PKA可能作用于上游以促进TrkB标记。相反，BDNF–TrkB信号转导已被证明能增强海马中Homer-1a的表达，使其位于TrkB下游(Sato等人，2001年;Rosenblum等人，2002年;Schratt等人，2004年). 此外，不同神经元隔室中不同形式的突触可塑性（例如LTP和LTD）可能会招募不同的分子来进行突触标记(Sajikumar等人，2007年). 由于我们的研究重点是BDNF–TrkB在TBS诱导的海马CA1区顶树突LTP突触标记过程中的作用，因此确定它们是否也参与其他区域或其他可塑性形式的标记过程将是一件有趣的事情。

总之，本研究支持了BDNF/TrkB参与Schaffer旁系CA1突触突触标记过程的模型：突触刺激可能会在突触前或突触后触发含BDNF的囊泡分泌BDNF，从而激活突触后TrkB。从这个意义上说，预先存在的BDNF和TrkB都应该被视为初始标记的一部分。此外，局部突触活动/cAMP–PKA/BDNF向树突棘招募更多TrkB(Ji等人，2005年)以及促进TrkB信号(Du等人，2000年，2003;铃木等人，2004年). 因此，这种最初的突触刺激-TrkB激活可导致受刺激突触处TrkB的进一步瞬时积累（<2小时）(Nagappan和Lu，2005年). 同时，强烈的刺激会引发随后的一波从头开始的合成PRP（BDNF）。这种突触后衍生的BDNF被转运到顶端树突，分泌并被TrkB“捕获”，TrkB积聚在受刺激的突触上。因此，想象突触刺激诱导的两波BDNF可能会有所帮助。第一种是BDNF的活性依赖性分泌，它有助于局部标记（TrkB）的产生（积累）。突触刺激也会触发体细胞或树突中BDNF的合成。新合成的BDNF结合并作用于先前刺激的突触累积的TrkB，从而确保突触特异性。第二波BDNF不符合PRP的传统观点，因为BDNF–TrkB信号在传入刺激后仅需要约45分钟的短暂时间(图6D类). TrkB下游信号事件和效应器的激活可能负责L-LTP和LTM的维持。如果弱刺激在强刺激之前或之后的短时间内，TrkB标记也可以通过在不同突触上的弱刺激来创建，以捕获新合成的BDNF，导致E-LTP转化为L-LTP。我们的行为研究揭示了TrkB是一个潜在的行为标签，暗示了STM到LTM合并的类似场景。TrkB作为潜在的突触标记和行为标记的识别为进一步研究LTP和LTM的维持阶段提供了机会。

脚注

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