从内质网到细胞核的应激反应途径需要哺乳动物细胞中一种新的双功能蛋白激酶/内核糖核酸酶（Ire1p）

hIRE1在所有组织中组成性表达

内源性表达hIRE1型通过Northern杂交研究³²P-标记的cDNA探针对应于hIre1p的管腔结构域或细胞质结构域。这两个探针的杂交模式是相同的（图。​（图2）。2).hIRE1型在所有检测的组织中，由一种在～8kb处迁移的mRNA检测到普遍低水平表达。基于内源性的大小hIRE1型mRNA及其预测翻译产物，我们建议hIRE1型mRNA包含一个长的、～4kb、3′-非翻译区。有趣的是hIRE1型mRNA在胰腺组织中最为丰富，提示hIre1p可能在这个特定器官中发挥重要作用。

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图2

hIRE1型在人体组织中广泛表达。poly（A）的Northern印迹分析⁺通过与³²对应于hIRE1型管腔域hIRE1型细胞质结构域或人类β-肌动蛋白cDNA。Ire1放射自显影的曝光时间是β-actin的24倍。

hIre1p显示下调其合成所需的激酶活性

为了检测hIre1p的生化特性，在用GST–hIre1p融合蛋白免疫的小鼠中产生抗体。尽管该多克隆抗体与它所针对的抗原发生反应，但该抗体在几个人类细胞系的免疫沉淀中没有检测到内源性Ire1p，这表明内源性hIre1p的水平极低（数据未显示）。为了获得足够数量的蛋白质用于表征，通过瞬时DNA转染表达载体pED中克隆的cDNA，在COS-1猴细胞中过度表达hIre1p(考夫曼等人，1991年). 此外，编码激酶缺陷的表达载体hIRE1型构建突变体，其中假定ATP结合位点中599残基的保守赖氨酸被丙氨酸（pED–hIRE1型K599A）(汉克斯和奎因1991). 通过免疫沉淀法监测这些蛋白的表达[³⁵S] 用α-hIre1p抗体标记蛋氨酸和半胱氨酸脉冲细胞。正如预期的那样，野生型和K599A突变型hIre1p均表达为110-kD蛋白（图。​（图3A）。三A） ●●●●。该蛋白产物未从模拟转染细胞或pED载体转染细胞中检测到（图。​（图3A；三A；数据未显示）。有趣的是，转染COS-1细胞中突变型K599A hIre1p的合成水平比野生型hIre1 p高约16倍。野生型和突变型hIre1p表达的差异不是由于转染效率的差异（由免疫荧光测定），两种质粒DNA的不同独立分离物产生了相似的结果。突变型hIre1p的合成增加可以解释稳定态水平的增加（图中约10倍）。​图3D），三D） ，表明降解速度没有显著差异。

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图3

 瞬时转染COS-1猴细胞中hIre1p的过度表达。(A类)转染COS-1细胞中hIre1p的表达。用或不用编码野生型hIre1p的表达质粒瞬时转染COS-1细胞（pED–hIRE1型)或其激酶缺陷突变体（pED–hIRE1型K599A）。将转染细胞脉冲标记为[³⁵S] -蛋氨酸和半胱氨酸15分钟。制备细胞提取物，用α-hIre1p抗体免疫沉淀等量，并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。(B类)共转染细胞中eIF-2α的表达。模拟转染COS-1细胞（lane1)或在pED存在的情况下与pED–eIF-2α共转染（车道2)，pED–hIRE1型（车道三)或pED–hIRE1型K599A（车道4). 细胞被脉冲标记为[³⁵S] 蛋氨酸和半胱氨酸处理15分钟。制备细胞提取物，并通过SDS-PAGE和放射自显影术直接分析放射性标记蛋白的等量cpm。(C类)功能性hIre1p限制hIRE1型mRNA。从转染pED、pED-的COS-1细胞中分离出总RNAhIRE1，或pED–hIRE1型K599A质粒，在存在（+）或不存在（−）环己酰亚胺的情况下处理。RNA样品（10μg）在甲醛-琼脂糖凝胶中溶解，印在尼龙膜上，并与³²P标记hIRE1型cDNA探针。（箭头）hIRE1转录本。(D类)hIre1p具有内在激酶活性。从瞬时转染的COS-1细胞中免疫沉淀野生型或K599A突变体hIre1p。（模拟）未接收质粒DNA的细胞。蛋白质在[γ]存在下在激酶缓冲液中培养-³²P] ATP在30°C下放置40分钟。通过SDS-PAGE将蛋白质分解并转移到硝化纤维素膜上。（顶部）合并[³²P] 放射自显影法测定磷酸化为hIre1p；(底部面板)通过使用α-hIre1p抗体和碱性磷酸酶染色的酯酶印迹分析测定Ire1p蛋白水平。凝胶上装载的K599A突变hIre1p的数量是车道上装载的免疫沉淀蛋白数量的三分之一1和2因此，稳态K599A突变体hIre1p的量比野生型hIre1 p大约10倍。

野生型和K599A突变型Ire1p蛋白在转染COS-1细胞中表达水平的差异（图。​（图3A）三A） 由此推测hIre1p可能会自动调节其表达。另外，野生型hIre1p的过度表达可能会抑制由一般毒性引起的瞬时转染细胞亚群中的一般表达。为了解决这种可能性，将COS-1细胞与编码真核翻译起始因子eIF-2α亚单位（pED–eIF-2 a）的另一个标记基因与pED–hIRE1型或pED–hIRE1型K599A。转染细胞经代谢脉冲标记[³⁵S] 通过SDS-PAGE分析总细胞提取物样品的蛋氨酸和半胱氨酸以及蛋白质合成。hIre1p或其突变体（K599A）的存在对eIF-2α的合成没有影响，表明野生型hIre1 p过度表达是无毒的，并且不会抑制转染细胞中的全局基因表达（图。​（图3B；三B；请参阅第3车道和第2、4车道）。

为了进一步研究野生型hIre1p表达减少的机制，我们分析了来源于质粒的水平hIRE1型COS-1转染细胞的mRNA。从用pED、pED–转染的COS-1细胞制备总RNAhIRE1型或pED–hIRE1型在收获RNA之前，K599A在有或无环己酰亚胺的条件下处理12小时hIRE1型K599A mRNA比野生型高10倍hIRE1型来自转染DNA的mRNA（图。​（图3C）。三C） ●●●●。环己酰胺对蛋白质合成的抑制对这些mRNA的稳态水平没有影响，这表明不需要持续的蛋白质合成来下调调节hIRE1型mRNA。综上所述，我们得出结论，功能性hIre1p在mRNA生成和/或稳定性水平下调其自身表达。

推导出的hIre1p氨基酸序列表明存在完整的催化Ser/Thr蛋白激酶结构域。为了证明激酶的功能活性，测量了自身磷酸化的能力，因为这种活性与酵母Ire1p的功能活性相关(Welihinda和Kaufman，1996年). 从转染COS-1细胞中免疫沉淀野生型和突变型K599A hIre1p，并用[γ³²P] ATP。然后通过SDS-PAGE将蛋白质溶解并转移到硝酸纤维素膜上，然后放射自显影并用α-hIre1p抗体进行检测。野生型hIre1p被有效地自动磷酸化（图。​（图3D）。三D） ●●●●。磷酸化导致蛋白质印迹测定的流动性稍慢。用丙氨酸替代假定的ATP结合囊中的保守赖氨酸残基显著降低了检测到的磷酸化，特别是当校正了大量免疫沉淀蛋白时（图。​（图3D，三D、 参见车道2和3）。该突变型Ire1p的低水平磷酸化可能是由于免疫沉淀反应中存在内源性COS-1细胞衍生Ire1p或其他激酶所致。综上所述，我们得出结论，hIre1p表现出固有的蛋白激酶活性。

hIre1p是一种双功能酶，具有酵母HAC1信使核糖核酸内切酶活性

Sidrauski和Walter（1997）最近证实，酵母Ire1p的细胞质域表现出能够裂解的位点特异性内核糖核酸酶活性HAC1类体外5′和3′剪接位点连接处的mRNA。RNase L的催化结构域与hIre1p的序列相似性大于酵母Ire1p。这导致了以下假设：hIre1p可能表现出类似的内核糖核酸酶活性，并可能能够催化与酵母Ire1p相同的特异RNA裂解。因为哺乳动物的身份HAC1类同源性未知，我们确定酵母HAC1类mRNA可以作为检测hIre1p内核糖核酸酶活性的底物。一种550核苷酸底物，来源于酿酒酵母HAC1体外合成了含有5′和3′剪接位点连接的mRNA。在GST-酵母Ire1p融合蛋白存在下培养该底物，同时切割HAC1类5′和3′剪接位点连接处的mRNA底物，如前所示Sidrauski和Walter（1997）切割产生了三种RNA产物（对应于一个224-核苷酸5′外显子、一个252-核苷酸内含子和一个74-核苷酸3′外显器）和两种中间产物（对应一个476-核苷酸5′内显子/内含子以及一个326-核苷酸内显子/3'外显子）（图。​（图4A，4A、 车道3、4）。在不存在GST–Ire1p或单独使用对照GST蛋白的情况下未观察到切割（图。​（图4A，4A、 车道1、2）。令人惊讶的是，通过免疫沉淀法从过度表达hIre1p的转染COS-1细胞中分离出的hIre1 p能够催化裂解；然而，在这个反应中只观察到两种RNA产物（图。​（图4A，4A、 车道8、9）。这两个产物的大小似乎与GST-酵母Ire1p介导的仅在5′剪接位点接合处的裂解产物相同（代表224-核苷酸5′外显子和326-核苷酸内含子/3′外显器）。将底物与hIre1p长时间孵育并没有产生内含子或3′外显子片段（数据未显示）。相反，当突变体K599A hIre1p取代hIre1 p时，未观察到卵裂（图。​（图4A，4A、 车道6、7）。总之，我们得出结论，hIre1p表现出内核糖核酸酶活性，其内在激酶活性是激发内核糖酶活性所必需的。

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图4

 hIre1p是一种位点特异性内核糖核酸酶。(A类)酵母的体外裂解HAC1类mRNA通过hIre1p。玻璃体内转录的³²P标记HAC1类mRNA与大肠杆菌-表达的GST或GST–Ire1p吸附到谷胱甘肽珠上，或COS-1细胞表达的hIre1p或hIre1 p K599A蛋白吸附到蛋白A–Sepharose珠上。在指定的时间段后，通过5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析裂解产物。关于左边描述预测的解理产物。数字位于正确的指出基于酵母的RNA产物的预测碱基对大小HAC1类酵母Ire1p对mRNA的切割(Sidrauski和Walter 1997年). (B类)hIre1p裂解酵母HAC1类残基G661处的mRNA。这个HAC1类RNA切割位点是通过在体外转录的HAC1类与GST、GST–Ire1p、hIre1p或hIre1 p K599A孵育后的mRNAA。通过使用补充基因内含子的寡核苷酸引物，利用上标II逆转录酶（Bethesda研究实验室）对产物进行逆转录HAC1类RNA。排序上的梯子左边代表HAC1类用同一引物测定DNA序列。（箭头）底漆延伸产品的位置。

为了精确绘制hIre1p解理位点HAC1类mRNA，引物延伸分析。一种与HAC1类内含子被用来反向转录HAC1类mRNA被大肠杆菌表达GST-酵母Ire1p或hIre1p，并从转染的COS-1细胞中进行免疫沉淀。同样的引物也被用来确定HAC1类基因（图。​（图4B）。4B） ●●●●。由HAC1类用GST–yIre1p和hIre1p切割的mRNA是相同的，这表明GST–酵母Ire1b和hIree1p都可以切割HAC1类mRNA位于预测的5′外显子/内含子连接处的相同位置（图。​（图4B，4B、 参见车道2和4）。这两个扩展产品与HAC1类DNA序列阶梯表明，它们都在鸟嘌呤残基661处终止。相比之下，在反转录反应中没有观察到这种引物延伸产物HAC1类mRNA与对照GST孵育大肠杆菌或使用来自pED的对照免疫沉淀蛋白-hIRE1型K599A或模拟转染细胞。

hIre1p是一种优先定位于核膜的内质网膜蛋白

未转运至高尔基复合体的ER驻留糖蛋白具有高甘露糖含量的低聚糖，对内切糖苷酶H的消化敏感。hIre1p氨基末端结构域中存在单一潜在的氨基糖基化位点，用于确定hIre1 p的亚细胞定位。与从未经处理的细胞中分离出的Ire1p相比，从代谢标记的转染细胞经衣霉素（一种抑制N-连接核心低聚糖添加的药物）处理后制备的提取物中免疫沉淀出的hIre1p分子量略有减少，表明不存在单N-连接的核心低聚糖（图。​（图5；5; 参见车道1和2）。用内切糖苷酶H处理免疫沉淀的hIre1p，使标记的hIr1p的分子量降低到与从衣霉素处理细胞中分离的未糖基化hIre1 p相当的水平（图。​（图5，5，参见车道2和4）。此外，羧基末端462氨基酸残基（假定的细胞溶质域）的缺失产生了一种含有N-连接低聚糖的蛋白质（数据未显示）。这些结果支持hIre1p在内质网中的定位，这与预测的内质网腔中具有氨基末端的hIre1 p的拓扑结构一致，类似于酵母Ire1p(Mori等人，1993年).

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图5

 hIre1p含有高甘露糖核心低聚糖。将过度表达hIre1p的转染COS-1细胞脉冲标记为[³⁵S] 蛋氨酸和半胱氨酸存在15分钟（lane2)或不在（车道1)制备了衣霉素和细胞提取物。同时，在收获细胞提取物之前，将在不存在膜霉素的情况下脉冲标记15分钟的细胞在含有过量未标记甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中孵育3小时。这个³⁵从细胞提取物中免疫沉淀标记的hIre1p，并通过SDS-PAGE进行分析。在SDS-PAGE之前，免疫沉淀的样品在不存在的情况下孵育（泳道1–3)或存在（车道4)内切糖苷酶H。

共聚焦激光扫描免疫荧光显微镜用于鉴定hIre1p亚细胞定位。COS-1细胞瞬时转染野生型hIRE1型表达质粒和细胞用hIre1p特异性小鼠抗体和ER驻留蛋白GRP94特异性兔抗体双重标记。分别用与异硫氰酸荧光素（FITC）或罗丹明偶联的二级抗体观察免疫复合物（图。​（图6A）。6A） ●●●●。可能是因为hIre1p的低表达水平，所以无法在未转染细胞中检测到hIre1蛋白的染色。相反，在转染细胞中检测到野生型hIre1p作为核周荧光，与内源性GRP94的荧光模式相似。尽管这两种蛋白的荧光模式相似，但对合并图像的分析表明，hIre1p优先定位在靠近核膜的位置。在转染了hIRE1型突变K599A表达质粒，与其较高的表达水平一致（图。​（图6B）。6B） ●●●●。突变的hIre1p蛋白也优先定位于核周区域，表明这种定位不需要激酶活性。为了确定hIre1p是否定位于核膜，将野生型hIre1 p的荧光模式与内源性RanGAP1蛋白的荧光模式进行比较，后者是核孔复合体的一种成分(Mahajan等人，1997年). 与hIre1p不同，后者定位于整个细胞质的内质网膜，RanGAP1蛋白显示出特定的核边缘荧光染色模式。有趣的是，当两个荧光图像合并时，hIre1p亚群与核孔复合物蛋白RanGAP1共定位（图。​（图6C）。6C） ●●●●。

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图6

 COS-1细胞表达hIre1p的共焦激光扫描荧光显微镜。用小鼠α-hIre1p免疫荧光法测定转染COS-1细胞中hIre1p的亚细胞定位。(A类)野生型转染COS-1细胞，或(B类)K599A突变体爱尔兰共和国1表达质粒用小鼠α-hIre1p和兔α-GRP94双重标记。(C类)野生型转染COS-1细胞爱尔兰共和国1表达质粒用小鼠α-hIre1p和豚鼠α-RanGAP1双重标记。使用的二级抗体是罗丹明结合的山羊α-兔子或罗丹明与山羊α-豚鼠（红色），同时存在荧光素结合山羊α-小鼠（绿色）。合并图像时，共定位显示为黄色。用Bio-Rad共焦荧光显微镜观察细胞并进行数字拍照。棒材，25μm。

定点突变

激酶亚结构域II中599位的保守赖氨酸残基通过基于PCR的方法通过使用通风孔DNA聚合酶（新英格兰生物实验室）。这个Mst公司我和Pvu公司来自pED的I片段–hIRE1型替换为含有突变序列（AAG→GCG）的同源片段，以产生pED–hIRE1型K599A。DNA测序证实了突变。

抗体生产

利用引物168G（5′-CGGAATTCATCACCTACCCCTGAGCATG-3′）、169G（5’-CGGATATTCAGAGGGGCGTCA-3′）和通风孔DNA聚合酶（新英格兰生物实验室）。为了制备GST-hIre1p融合蛋白，将PCR产物插入pGEX–1γT（Pharmacia）中生态RI站点，然后转换为大肠杆菌DH5α。融合蛋白的生产和纯化如下所述弗兰吉奥尼和内尔（1993）但诱导是在30°C下进行的。将纯化的GST–细胞质hIre1p融合蛋白重复注射到小鼠体内，如哈洛和莱恩（1988）从尾出血中收集的血清用于通过Western blot分析测定滴度。当获得最佳滴度后，将肉瘤细胞系S180注射给小鼠，以诱导直接使用的腹水(哈洛和莱恩1988).

瞬时DNA转染和分析

如前所述转染COS-1猴细胞(考夫曼1997). 简单地说，细胞在转染前一天被电镀。用2μg/ml pED-转染细胞hIRE1型或pED–hIRE1型K599A质粒DNA采用二乙氨基乙基葡聚糖法培养6小时。转染后36小时，用新鲜培养基培养细胞。转染后60小时，使用NP-40裂解缓冲液（1%NP-40，50 m）从转染细胞中制备总细胞提取物米pH值为7.5、150 m的三氯化氢米NaCl，0.05%十二烷基硫酸钠）补充1 m米PMSF、40μg/ml抑肽酶和20μg/ml亮氨酸肽。对于代谢标记（除非另有规定），转染细胞标记有[³⁵S] 甲硫氨酸和半胱氨酸（1000 Ci/mmol，Amersham Corp.）混合15分钟，然后收获细胞。对于免疫沉淀，细胞提取物与蛋白A Sepharose预吸附。随后将预分离的裂解物与α-hIre1p在4°C下孵育14小时，然后与兔α-小鼠IgG抗体孵育1小时。免疫复合物用蛋白A Sepharose吸附，并依次用含有Triton X-100的PBS（1%、0.1%和0.05%）洗涤。样品在还原条件下通过SDS-PAGE和放射自显影进行分析。通过NIH Image 1.55b程序对谱带强度进行量化。

Northern印迹分析

聚乙烯（A）⁺将从各种人类组织（Clontech）中分离的RNA与³²P-标签，1.5-kbNsi公司I–Pvu公司I片段hIRE1型对应于hIre1p管腔结构域的cDNA，即0.9-kb生态RI插入pBluescript-9-1的片段，对应于hIre1p或2-kb人类β-actin cDNA（Clontech）的细胞质域。根据制造商的说明（Clontech），在ExpressHyb杂交缓冲液中进行杂交。

通过使用TRIzol试剂（贝塞斯达研究实验室）制备转染COS-1细胞的总RNA。RNA（10μg）在1%甲醛琼脂糖凝胶中溶解并印在Hybond尼龙膜（Amersham）上。印迹与杂交³²P标记的0.9-kb生态hIRE-1 pBluescript-9-1的RI片段如所述(Sambrook等人，1989年).

体外磷酸化和蛋白质印迹

来自转染COS-1细胞的免疫沉淀蛋白在激酶缓冲液}50 m中培养米pH值为7.4150 m的三氯化氢米氯化钠，1米米氯化锰₂，1米米氯化镁₂，1米米纳₂哞₄，2米米氟化钠，1米米二硫苏糖醇和10μCi[γ³²P] ATP（6000 Ci/mmole，Amersham Corp.）}在30°C下放置40分钟。蛋白质样品通过SDS–10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到硝化纤维素膜上。用小鼠α-hIre1p抗体和山羊α-小鼠抗体结合碱性磷酸酶检测膜。通过放射自显影术定量磷酸化。

共焦免疫荧光显微镜

免疫荧光染色如下所述Paterson等人（1995年）简单地说，COS-1细胞被镀到盖玻片上并转染pED–hIRE1型如上所述的质粒。转染后60小时，用小鼠α–GST–染色转染的细胞hIre1p以及兔子α-GRP94（由密苏里州圣路易斯大学迈克尔·格林博士慷慨提供）或豚鼠α-RanGAP1（由加利福尼亚州圣地亚哥斯克里普斯研究所弗劳克·梅尔基奥博士慷慨提供。然后用二级抗体（山羊α-鼠IgG与异硫氰酸荧光素偶联，山羊α-兔或山羊α-豚鼠与罗丹明偶联）（Boehringer Mannheim）孵育细胞，清洗，并用Prolong安装（分子探针）将其安装在载玻片上。用共焦激光扫描荧光显微镜（Bio-Rad MRC 600）检查荧光图像。

HAC1 mRNA的体外切割

前面描述了所遵循的程序Sidrauski和Walter（1997）简单地说，一个550 bp的片段HAC1类内含子区域两侧的DNA片段(Mori等人，1996年)PCR扩增自酿酒酵母基因组DNA并亚克隆到pBluescript II SK（−）质粒（Stratagene）中Pst（磅/平方英尺）我和Xho公司I站点（pBluescript–HAC1类).HAC1类mRNA在体外转录自Xho公司我消化了pBluescript–HAC1类在[α³²P] UTP（3000 Ci/mmole，Amersham Corp.）。RNA在5%变性聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳分离³²P标记HAC1类如前所述纯化mRNA(Sidrauski和Walter 1997年)并溶解于核酸内切酶缓冲液（20 m米HEPES，1米米DTT，10米米氧化镁，50 m米KOAc和2 m米ATP）。纯化RNA（3×10⁴将cpm）添加到免疫沉淀的hIre1p、hIre1 p K599A或0.5μg GST-细胞质Ire1p中(Welihinda和Kaufman，1996年)最终体积为100μl的反应。在30°C下孵育指定时间后，用苯酚/氯仿萃取终止反应，用乙醇沉淀，并在5%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析。凝胶在放射自显影前干燥。

底漆延长件

程序如下所述Sambrook等人（1989）.

我们感谢克里斯·爱德华兹（Chris Edwards）和乔·诺瓦克（Joe Nowak）在共焦显微镜下的协助，感谢迈克尔·格林（Michael Green）和弗劳克·梅尔基奥（Frauke Melchior）博士提供抗体。我们感谢Michael Uhler博士对手稿进行了批判性审查，并感谢Joseph Nowak在编写过程中提供的帮助。W.T.得到了泰国科学、技术和环境部的支持。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。