跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
细胞死亡疾病。2011年6月；2（6）：e170。
2011年6月9日在线发布。 数字对象标识：10.1038/cddis.2011.52
预防性维修识别码：下午168994
PMID：21654828

大麻二酚通过内质网应激诱导的细胞凋亡机制导致活化的肝星状细胞死亡

M P Lim公司,1 L A Devi公司,1,*和R罗森菲尔德1,2,*
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

肝纤维化发展过程中的主要细胞事件是肝星状细胞（HSC）的激活。活化的HSC增殖并产生多余的胶原，导致瘢痕基质和肝纤维化的积聚。因此，诱导活化HSC死亡被认为是解决肝纤维化的一种手段。这里我们证明了大麻二酚（CBD），一种植物的主要非精神活性成分大麻，通过大麻素受体依赖机制诱导活化的HSC凋亡。CBD引发内质网（ER）应激反应，其特征是内质网形态的改变和RNA-依赖性蛋白激酶样ER激酶-、激活转录因子-6-和肌醇需要ER-核信号激酶-1（IRE1）介导的信号级联的启动。此外，CBD诱导促凋亡IRE1/ASK1/c-Jun N-末端激酶通路的下游激活，导致HSC死亡。重要的是，我们表明CBD诱导的内质网应激介导的凋亡机制对活化的HSC是特异的，正如它发生在活化的人和大鼠HSC细胞系中，以及在原代HSC中一样体内-激活小鼠HSC，但不在静止的HSC或大鼠原代肝细胞中。最后，我们提供证据表明，激活的HSC内质网应激的基础水平升高，在其对CBD促凋亡作用的易感性中起作用。我们认为CBD通过选择性诱导活化的HSC死亡，是治疗肝纤维化的潜在治疗剂。

关键词：肝纤维化，大麻素，大麻，未折叠蛋白反应，抗纤维化

肝纤维化是美国第十大死亡原因，影响了超过40万名患者。1作为肝脏损伤的常见创伤治疗反应，它是许多慢性肝病的结果，包括病毒性肝炎和自身免疫性肝炎、酒精性肝病和肥胖相关肝病。2由于纤维化导致的肝硬化和肝衰竭的发病率很高，因此确定能够阻止纤维化进展甚至逆转纤维化的药物治疗具有极其重要的临床意义。肝星状细胞（HSC）对肝损伤的反应被认为是肝纤维化发生的关键细胞事件。HSC激活是指静止的HSC转分化为增殖和收缩的肌纤维母细胞样细胞。这些活化的HSC分泌多余的细胞外基质（ECM）蛋白，主要是I型胶原，导致瘢痕基质积聚，最终导致肝纤维化。三由于HSC在纤维化形成中起着关键作用，通过细胞死亡消除活化的HSC被认为是减轻或逆转肝纤维化的机制。4因此，许多研究的目的是识别靶向活化HSC并导致HSC死亡的化合物。

最近的研究调查了大麻素在肝脏疾病中的作用，强调了内源性大麻素系统的作用（在Tam中综述等。5)内源性大麻素配体anandamide（AEA），一种I型/II型大麻素受体（CB）1R/CB公司2R） 激动剂已被证明能诱导活化的HSC坏死，尽管其浓度高达25μM到100μ米。6然而，因为CB1R在中枢神经系统中高度表达，AEA作为一种有效治疗剂的预期用途因其在如此高浓度下可能引起不良反应而减少。因此，在低浓度下有效诱导HSC死亡的替代大麻素的鉴定，同时显示出很少或没有受体活性，可能会提供更具吸引力的候选药物。

大麻酚（CBD）是主要的非精神活性植物源大麻素。近年来，《生物多样性公约》（CBD）已显示出其作用体内作为抗炎分子7,8作为抗氧化剂，9重要的是，作为一种抗增殖化合物，会导致许多肿瘤细胞株的生存能力下降。10,11,12鉴于CBD的抗增殖特性，我们假设该化合物可以通过阻止活化HSC的增殖，在肝纤维化的情况下显示出治疗潜力。在这里，我们发现CBD在活化的HSC中诱导凋亡，我们确定内质网应激是这一过程的分子机制。

结果

CBD以大麻素受体依赖的方式诱导活化的HSC凋亡

为了研究CBD和其他大麻素配体诱导活化HSC死亡的可能性，我们对培养的活化HSC进行处理，这些HSC是从喂食8个月乙醇的大鼠肝脏中分离出来的13（详见材料和方法），增加不同大麻素浓度8小时，并使用酸性磷酸酶测定法测定细胞活力。培养最多10个细胞μAM630（CB）中的M2R拮抗剂），JWH133（CB2R激动剂），PF514273（CB1R拮抗剂），AM251（CB1R拮抗剂）或ACEA（CB1R激动剂）几乎没有作用，而5μCBD或CP55940（CB）的M1R/CB公司2R激动剂）足以分别导致约60%和90%的生存能力丧失。与外源配体相反，20μM AEA（内源性CB1转/立方厘米2R激动剂）需要达到类似的效果，而2-花生酰甘油（2-AG，内源性CB1R/CB公司2R激动剂）治疗对这些细胞的存活率没有显著影响(图1a).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为cddis201152f1.jpg

CBD诱导活化的HSC凋亡。(一)在血清饥饿和用指定浓度的大麻素配体处理8小时后，用酸性磷酸酶测定活化大鼠HSC的细胞活力。细胞存活率表示为载体处理细胞中酸性磷酸酶活性的百分比，表示为平均值±S。三份实验的E.M。AM630，CB2R拮抗剂；JWH（JWH133）、CB2R激动剂；PF（PF514273），CB1R拮抗剂；AM251，CB1R拮抗剂；ACEA、CB1R激动剂；CP55940，CB1R/CB公司2R激动剂；AEA，内源性CB1R/CB公司2R激动剂；2-AG，内源性CB1R/CB公司2R激动剂。(b条)在无血清培养基中培养12小时后，在载体（DMSO）或5μM种指定的大麻素配体。PARP裂解表示为裂解PARP超过总PARP。(c（c）)PARP解理检测如下：(b条)在用CBD处理指定浓度和时间段的活化大鼠HSC中。Western blot代表了n个=三个实验。(d日)激活的大鼠HSC在无血清培养基中孵育，5μM CBD持续2、4和8小时，然后对FITC膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）进行染色。用流式细胞仪对细胞进行分类和分析。膜联蛋白V和/或PI呈阴性或阳性的细胞百分比显示在每个面板的适当象限中

同时，我们通过检测细胞死亡标记物裂解聚（ADP核糖）聚合酶（PARP）的存在，研究了这些大麻素杀死活化的HSC的能力μM细胞处理。PARP裂解的western blot分析表明，在这些化合物中，只有AEA和CBD能够促进活化的HSC死亡(图1b)与细胞活力测定结果一致。在进一步的检查中，我们发现CBD以剂量和时间依赖性的方式诱导活化HSC死亡，在6小时后用5μM处理(图1c). 然后，我们使用FITC-Annexin V染色的流式细胞术分析证实了CBD诱导细胞凋亡(图1d).

为了描述CBD引起细胞凋亡的机制，我们首先研究了CBD是否通过大麻素受体CB发挥作用1R或CB2R.我们发现阻止CB1R或CB2R对CBD诱导的PARP裂解没有影响(图2a)和激活的HSC活性(图2b)与CP55940引起的死亡形成对比，CP55940-似乎至少部分由CB介导2R.与CB的共处理2R拮抗剂AM630将CP55940诱导的细胞死亡降低了50%以上（数据未显示）。这些结果支持大麻素受体对CBD诱导的细胞凋亡的依赖机制。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为cddis201152f2.jpg

CBD诱导内质网扩张和内质网应激标记物的表达。(一)在无血清培养基中用5μM CBD，无论是否存在1μM AM251或1μM AM630型。细胞裂解物进行western blot分析，并探测裂解的PARP以检测细胞死亡。**P（P）<0.01与控制（学生的t吨-测试）。的代表n个=三个独立实验。(b条)用5μM CBD有无1个μM AM251或1μ使用酸性磷酸酶测定法测定M AM630，如材料和方法中所述。(c（c）)车辆-或5μ经M CBD处理的活化大鼠HSC在处理4小时后通过20倍放大的光学显微镜观察。(d日)活化大鼠HSC中calnexin（绿色）的免疫荧光染色。活化的HSC在无血清培养基中与载体或5一起孵育μM指定时间段的CBD。如材料和方法中所述，对细胞进行固定和处理以进行免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。通过共焦显微镜在63倍放大率下观察细胞。(e（电子）)活化的大鼠HSC在无血清培养基中孵育，5μM CBD放置4小时，然后固定并进行电子显微镜处理。细胞在放大12000倍的条件下成像。白色箭头表示ER(（f）)将活化的大鼠HSC在无血清培养基中孵育0–24小时，并显示CBD浓度。细胞裂解物进行western blot分析，并检测CHOP和calnexin。的代表n个=三个独立实验

CBD通过内质网应激诱导活化HSC内质网形态的改变

在我们的实验过程中，我们注意到CBD处理的活化HSC的形态发生了显著变化。细胞核周围存在不同的结构，表明CBD对内质网的影响(图2c). ER伴侣calnexin的分布和定位发生了变化，一致的网状ER结构消失，核周空泡状结构形成，支持了这一观点(图2d). 电子显微镜进一步证实，CBD治疗导致内质网扩张(图2e). 内质网形态的这些变化表明，CBD诱导内质网应激。

我们通过检测calnexin和转录因子C/EBP（CCAAT/enhancer-binding protein）同源蛋白（CHOP）的表达变化，进一步研究了CBD对活化HSC内质网应激的影响，CHOP是内质网长期应激的主要标志物。Western blot分析表明，CBD治疗导致calnexin和CHOP的表达增加(图2f). 此外，CHOP是内质网应激后促凋亡信号的重要增强因子，其上调为内质网胁迫可能介导CBD诱导的活化HSC凋亡提供了证据。

CBD促进活化HSC的凋亡和内质网应激，但不影响对照HSC或原代肝细胞

为了评估CBD诱导凋亡和ER应激的特异性，我们检测了CBD对不同细胞系以及原代细胞中PARP、calnexin和CHOP表达的影响。我们首先比较了乙醇处理大鼠和对照大鼠的HSC。13与乙醇处理的大鼠HSC相比，对照组大鼠HSCs的激活状态显著降低，表现为α-平滑肌肌动蛋白表达降低20倍(αSMA；看见图3a，插图）。通过与5μ在这些细胞中，我们发现CBD并没有改变对照组HSC中PARP、calnexin和CHOP的表达，这表明CBD的促凋亡和ER应激效应与激活的HSC表型有关(图3a).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为cddis201152f3.jpg

CBD的促凋亡作用是激活的HSC特有的。(一)来自对照或乙醇喂养的大鼠的HSC(b条)初级鼠标体内-激活的HSC(c（c）)LX-2细胞（来自肝硬化患者的人HSC细胞系），以及(d日)原代大鼠肝细胞在无血清培养基中与5μM CBD 0–8 h。对细胞裂解液进行western blot分析，并检测PARP、calnexin和CHOP，以检测细胞死亡和ER应激。(e（电子）)在对照大鼠的HSC、乙醇喂养大鼠的HSC和原代大鼠肝细胞中用指示浓度的CBD处理8小时后，测量酸性磷酸酶活性以确定细胞活力。Inset，western blot分析α-对照组或乙醇喂养大鼠HSC中SMA的表达。Western blot和细胞存活分析是n个=三个独立实验

在主要体内-激活的小鼠HSC和LX-2细胞（来源于肝硬化患者的永生化人HSC系14)，CBD导致PARP裂解，calnexin上调，CHOP表达诱导，与我们在大鼠活化HSC中观察到的一致(图3b和c). 相反，CBD治疗并没有诱导原代大鼠肝细胞中PARP的裂解或calnexin和CHOP的上调(图3d)证实了CBD对活化HSC促凋亡作用的特异性。

为了进一步研究CBD对不同细胞类型的影响，我们比较了对照大鼠HSC、乙醇处理大鼠HSCs和原代大鼠肝细胞在0–20μCBD治疗的M范围。如前所示，5μM CBD足以导致乙醇处理大鼠HSC的存活率下降～60%，而对照大鼠HSCs的存活率没有下降，其中10μM CBD被要求导致严重损失，损失程度更小（减少约40%）。与HSC相比，原代大鼠肝细胞在高达20μM中央商务区(图3e). 总之，这些发现表明，CBD以剂量依赖性的方式特异性地靶向激活的HSC以导致死亡。

CBD诱导活化HSC中PERK-、ATF6-和IRE1-介导的内质网应激反应

我们进一步研究了CBD诱导内质网应激和凋亡的机制，通过描述CBD诱导的内质网胁迫信号主要介质的变化，如下所述。细胞通过一种称为未折叠蛋白反应（UPR）的保护机制对内质网应激作出反应，以恢复正常内质网功能。在应激刺激下，这种适应性反应是通过抑制三种ER跨膜蛋白的释放而启动的，即来自ER伴侣葡萄糖调节蛋白78 kDa（GRP78）的PRKR（RNA-dependent protein kinase）样ER激酶（PERK）、ATF6和肌醇需要ER-to-nucleus信号激酶-1（IRE1）。这些内质网应激传感器的随后激活引发一连串信号事件，导致对克服内质网胁迫至关重要的基因表达，包括转录因子和分子伴侣15,16(图4a).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为cddis201152f4.jpg

CBD诱导内质网应激反应。(一)内质网应激反应信号通路的示意图。在(b条)通过(e（电子）)，激活的大鼠HSC在无血清培养基中孵育μM中央商务区，除非另有说明，在指定的时间段内处理(b条和c（c）)蛋白印迹(d日)RT-PCR，或(e（电子）)内质网应激介质的qRT-PCR分析。(b条)对全细胞裂解物进行western blot分析，并探测磷酸化-PERK、磷酸化-eIF2α、磷酸-IRE1和P58IPK公司以检测ER应激反应的PERK和IRE1介导的臂。(c（c）)对细胞裂解物和核提取物进行western blot分析并探测ATF4、裂解ATF6α，和XBP1s，以检测细胞核中ER应激转录因子的存在。(d日)从细胞中提取总RNA并逆转录以获得用于PCR的cDNA，该cDNA带有XBP1特异性引物。琼脂糖凝胶电泳检测拼接XBP1。(e（电子）)使用ATF4、ATF6、CHOP和XBP1的基因特异性引物进行实时RT-PCR，以检测指定时间点的相对mRNA水平。结果归一化为GAPDH、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和RNA聚合酶II，并表示为相对于对照±S的倍数变化。E.M.公司(n个=三个独立实验，一式三份）。*P（P）<0.05;**P（P）<0.01;***P（P）<0.001与控制（学生的t吨-测试）

GRP78释放PERK可通过受体自身磷酸化激活PERK。激活的PERK可磷酸化并抑制真核生物翻译起始因子2α (电子标签2α)，增强eIF2α-激活转录因子（ATF）-4的独立翻译和核移位，以诱导伴侣和转录因子（如CHOP）的基因表达。在活化的HSC中，我们发现CBD在2小时时诱导PERK磷酸化，然后是eIF2磷酸化α4小时(图4b). 与此一致，我们还检测到ATF4在细胞核中的时间依赖性积累(图4c).

从GRP78释放后，ATF6被裂解并转移到细胞核以诱导CHOP和X盒结合蛋白-1（XBP1）的表达。Western blot分析表明，CBD诱导裂解ATF6的积累α在原子核中(图4c)表明ATF6介导的内质网应激反应激活。

UPR期间GRP78释放IRE1后，IRE1自动磷酸化和磷酸化IRE1介导从XBP1 mRNA中切除26-核苷酸内含子，促进剪接XBP1（XBP1s）蛋白的核移位，并诱导P58等基因的表达IPK公司.17活化HSC的CBD处理导致磷酸化IRE1增加，伴随着P58的轻微诱导IPK公司表达式(图4b). 我们还发现，CBD以时间和剂量依赖的方式诱导XBP1 mRNA的剪接(图4d). 此外，在治疗的2-8小时内检测到核XBP1s蛋白急剧增加(图4c)，支持CBD诱导的IRE1介导的内质网应激信号级联的激活。

UPR基因ATF4、ATF6、CHOP和XBP1的表达增加进一步证实了CBD诱导内质网应激反应。尽管2μM CBD治疗6小时后，ATF4、ATF6和CHOP的转录水平显著增加，5μM CBD在更早的时间点导致这些基因的更大上调(图4e).

总之，这些结果表明，CBD处理导致活化的HSC中ER应激反应的所有三个信号臂的诱导，导致UPR基因和转录因子的显著上调。我们观察到CBD导致活化HSC的凋亡，这为内质网应激作为介导CBD诱导凋亡反应的潜在机制提供了有力证据。

CBD通过激活激活的HSC中IRE1/ASK1/JNK通路促进内质网应激诱导的凋亡

为了将内质网应激诱导与CBD介导的细胞死亡联系起来，我们检测了UPR下游触发凋亡的信号事件。IRE1通过其Ser967残基的去磷酸化激活凋亡信号调节激酶1（ASK1）而被证明具有促凋亡作用。活化的ASK1导致c-Jun N末端激酶（JNK）磷酸化，然后促进一系列下游促凋亡事件。18,19,20如前所示(图4b)，我们发现CBD导致IRE1磷酸化。此外，CBD诱导ASK1去磷酸化（活化），随后JNK磷酸化（激活）增加。这种级联反应在LX-2细胞、培养的活化大鼠HSC和原代HSC中被激活体内-激活的小鼠HSC(图5a–c). 此外，显性阴性（DN）IRE1的过度表达α在激活的小鼠HSC中(图5d)阻止JNK磷酸化并保护细胞免受CBD诱导的凋亡(图5e). DN IRE1的表达α也导致DN IRE1中XBP1s mRNA的显著降低α-CBD治疗后表达活化的HSC(图5f)，证实IRE1活性降低α此外，我们发现JNK抑制剂保护活化的HSC免受CBD的凋亡作用，使PARP的分裂减少50%以上(图5g)并将细胞活力恢复到接近最大(图5h). 这些发现表明，CBD通过内质网应激介导的IRE1/ASK1/JNK通路激活触发细胞凋亡。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为cddis201152f5.jpg

CBD诱导的细胞死亡由IRE1/ASK1/JNK途径介导。通过western blot分析测定了磷酸化-ASK1、磷酸化JNK和JNK的表达水平(一)LX-2细胞(b条)来自乙醇喂养大鼠的HSC，以及(c（c）)初级鼠标体内-活化的HSC，在无血清培养基中用5μM中央商务区0-8小时(d日)DN IRE1的表达α在JS1细胞（小鼠活化的HSC）中，使用小鼠和人IRE1特异性引物通过RT-PCR进行评估α。使用野生型JS1和LX-2细胞作为对照。对凝胶纯化的PCR产物进行测序，以确认突变IRE1的存在α（K599A DN IRE1α). (e（电子）)表达DN IRE1的JS1细胞α在无血清培养基中用5μM CBD处理0–4 h。通过western blot分析测定PARP和磷酸化JNK的表达，表示为折叠载体±S。控制或DN IRE1的E.Mα-表达JS-1细胞，n个=三个独立实验。(（f）)表达DN IRE1的JS1细胞α被视为CBD(e（电子）)然后用XBP1特异性引物进行总RNA分离和RT-PCR。琼脂糖凝胶电泳检测拼接XBP1。(克)用CBD处理LX-2细胞(一)在10人在场或不在场的情况下μ使用M JNK抑制剂4 h。Western blot分析测定PARP和磷酸化c-Jun的表达。分离的PARP表示为折叠控制±S。E.M.用于n个=四个独立实验。(小时)在存在或不存在JNK抑制剂的情况下，用CBD处理LX-2细胞(克)用酸性磷酸酶测定法测定细胞活力，并用平均值±S表示。三份实验的E.M。***P（P）<0.001;**P（P）<0.01;*P（P）<0.05

阻断内质网应激对CBD诱导的活化HSC凋亡的保护作用

为了进一步研究内质网应激在CBD诱导的凋亡中的作用，我们下调激活的小鼠HSC中的ATF4，ATF4是一种通过激活UPR中的PERK而诱导的转录因子。这导致由CBD引起的CHOP诱导和细胞死亡显著减少(图6a)提示PERK介导的内质网应激反应臂在CBD促凋亡作用中的重要性。使用另一种阻断内质网应激反应的方法，我们在伊马替尼的存在下用CBD处理LX-2细胞，这已被证明可以减弱内质网胁迫。21伊马替尼导致由CBD诱导的CHOP诱导、JNK磷酸化和PARP裂解显著降低(图6b)并防止CBD介导的活化HSC死亡(图6c)，提供了强有力的证据表明CBD通过促进内质网应激引起细胞凋亡。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为cddis201152f6.jpg

抑制内质网应激反应可防止CBD诱导的细胞死亡。(一)用抗ATF4的siRNA转染JS1细胞。16小时后，将细胞与5μM CBD在无血清培养基中培养8h后，采用Western blot分析测定PARP、ATF4和CHOP的表达，以折叠对照±S表示。用于的E.Mn个=四个独立实验。(b条)LX-2细胞用5μM CBD在无血清培养基中放置8小时，有无10小时μ伊马替尼抑制内质网应激。通过western blot分析测定PARP、CHOP和磷酸化JNK的表达，并将其表示为折叠载体±S。E.M.用于n个=四个独立实验。(c（c）)酸性磷酸酶活性用于测量经CBD和伊马替尼治疗后LX-2细胞的活性(b条). 细胞活力表示为对照酸性磷酸酶活性±S的平均百分比。三份实验的E.M。***P（P）<0.001;**P（P）<0.05

内质网应激的基础水平决定CBD的凋亡效应

然后，我们通过检测CBD在内质网应激诱导剂衣霉素存在或不存在时的作用来评估内质网胁迫介导的细胞凋亡效应。我们发现，CBD和衣霉素协同作用，以剂量依赖的方式增加LX-2细胞死亡(图7a)支持我们的发现，CBD的凋亡作用是通过内质网应激机制介导的。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为cddis201152f7.jpg

基底内质网应力决定了对CBD的敏感性。(一)LX-2细胞在0–4无血清培养基中培养μM CBD在有或无衣霉素（1μg/mL）诱导内质网应激。通过裂解PARP的western blot分析检测细胞死亡，表达为折叠载体±S。E.M.用于n个=三个独立实验。(b条)从乙醇饲料或对照大鼠HSC的全细胞裂解液中提取总RNA，并将其反转录为cDNA。使用ATF4、ATF6和CHOP的基因特异性引物进行实时PCR，以确定相对的基础mRNA水平，归一化为GAPDH并表示为折叠对照。***P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。(c（c）)通过与指定浓度的衣霉素在5μM CBD在无血清培养基中培养6小时。通过PARP和CHOP表达的western blot分析检测细胞死亡和ER应激。裂解PARP表示为折叠对照±S。E.M.用于n个=三个独立实验。*P（P）<0.05;**P（P）<0.01

为了进一步阐明CBD诱导的内质网应激作为细胞凋亡介质的作用，我们研究了这种情况在活化的HSC中发生的特异性的基础。我们首先检测了激活状态下的基础内质网应激水平与对照HSC，发现与未治疗大鼠的对照HSC相比，乙醇处理大鼠的活化HSC中ER应激反应基因ATF4、ATF6和CHOP的表达水平增加(图7b). 这使我们假设，活化HSC的基础内质网应激水平升高使这些细胞更容易受到内质网胁迫介导的CBD凋亡效应的影响。为了验证这一点，我们用衣霉素治疗对照组HSC，并在有无CBD的情况下检测CHOP的表达和PARP的裂解。有趣的是，我们发现，在对照组HSC中使用衣霉素增加内质网应激的基础水平会导致CBD诱导的CHOP表达增加和HSC死亡(图7c). 综上所述，这证明激活的HSC内质网应激基础水平的增加是一个潜在因素，决定了对CBD的敏感性及其对内质网胁迫介导的凋亡的诱导。

讨论

作为肝纤维化的中心效应器，活化的HSC一直是许多研究的重点，以探讨该疾病的潜在机制。活化HSC作为肝纤维化治疗靶点的概念22刺激了对促进HSC凋亡途径的研究，这被认为是促进疾病回归的一种手段。23尽管迄今为止已确定了一些抗纤维化药物，包括胶质毒素，24柳氮磺胺吡啶，25和构造素，26这些化合物在靶向活化的HSC时通常缺乏细胞型特异性。27,28

最近，内源性大麻素系统已被确定为HSC激活和肝纤维化的关键介质，29对各种大麻素配体的研究已经证明了这类分子的治疗潜力。30有趣的是，已经发现植物大麻素CBD通过涉及大麻素受体依赖或独立机制的多种过程导致增殖细胞死亡，例如癌细胞和活化淋巴细胞。31活化HSC的增殖特性促使我们研究CBD对这些细胞的影响。

值得注意的是，我们发现CBD通过凋亡诱导活化的HSC死亡，这一事件独立于大麻素受体发生。这使我们研究了CBD促凋亡作用的替代机制。内质网形态的改变，由钙连蛋白分布和内质网扩张的变化证明，表明CBD诱导内质网应激。PERK、ATF6和IRE1（内质网应激反应的三个主要介质）及其下游信号级联的激活证实了这一点。CHOP的诱导表明内质网应激和促凋亡信号延长，进一步支持CBD诱导的内质网胁迫反应与凋亡相关。促凋亡ASK1/JNK级联的下游激活，已知在严重内质网应激时激活，以及我们的发现，DN IRE1的表达αJNK的抑制均显著抑制了CBD的凋亡作用，证明CBD通过内质网应激介导机制导致ASK1/JNK诱导的活化HSC凋亡。

重要的是，CBD的凋亡作用是激活的HSC所特有的，可以在乙醇喂养大鼠的激活HSC系、人LX-2细胞以及原代HSC中看到体内-激活小鼠HSC。相反，这种作用在原代大鼠肝细胞中不存在，只有在高浓度CBD治疗后，在对照HSC中才能检测到。

由于HSC是肝脏中的主要成纤维细胞，因此其多余ECM蛋白的产生和分泌依赖于内质网的正常功能。与非增殖或非成纤维细胞类型相比，活化HSC的内质网在过度胶原生成过程中会承受压力，而维持体内平衡可能有助于适应性基础内质网应激反应。我们发现，与对照组HSC（对CBD无反应）相比，活化HSC中ATF4、ATF6和CHOP mRNA表达上调，支持活化HSC具有更高的ER应激基础水平。这可能解释了激活的HSC中CBD促凋亡作用的选择性，其中CBD加剧了先前存在的内质网应激反应，从而将信号从适应性转换为凋亡。与此相一致，在对照HSC中用膜霉素诱导ER应激导致这些细胞对CBD增敏。此外，未经治疗的活化HSC中ATF4的下调导致CHOP表达和凋亡降低，这表明阻断基础水平PERK介导的内质网应激反应降低了对CBD的敏感性，内质网胁迫决定了对CBD促凋亡作用的敏感性。这些观察提供了对内质网应激作为一种新的细胞内途径的见解，该途径可以通过选择性消除活化的HSC来达到抗纤维化的效果。

尽管内质网应激与许多病理生理过程有关，15我们的研究首次表明，它可能与活化的HSC表型有关，并且ER应激可以在肝纤维化的背景下被利用来特异性杀死促进纤维化的HSC。我们的发现是，与通过同源受体介导抗纤维化作用的传统大麻素配体相比，CBD导致独立于大麻素受体的活化HSC死亡，这进一步强调了本文提出的机制的新颖性。30有趣的是，其他大麻素配体如delta-9-四氢大麻酚已被证明通过涉及ER应激的机制在不同的癌症模型如神经胶质瘤细胞和胰腺肿瘤细胞中诱导细胞凋亡，32,33依赖于大麻素受体的激活。这让人想起CB的促凋亡作用2我们观察到R依赖性CP55940诱导HSC死亡，并表明CBD通过与大麻素受体激动剂不同的机制促进ER应激诱导活化HSC凋亡。

在本研究中，我们发现CBD通过之前未探索的内质网应激机制选择性地杀死活化的HSC。我们为CBD的作用提供了分子基础，并确定CBD是一种新型潜在的肝纤维化治疗剂。这些有希望的发现保证了对CBD抗纤维化作用的进一步研究体内CBD是一种非精神活性的小类药物分子，已在许多国家批准临床使用，这一事实使得CBD作为一种新型抗纤维化化合物的前景更加诱人。

材料和方法

材料

本研究使用了以下主要抗体：兔单克隆抗磷酸化JNK、兔多克隆抗JNK，抗PARP、抗P58IKP、抗eIF2α、抗磷酸-PERK、小鼠单克隆抗CHOP（Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）、多克隆抗calnexin、单克隆抗-β-肌动蛋白（西格玛，密苏里州圣路易斯，美国），兔多克隆抗ATF4，抗ATF6，抗XBP1，抗pASK1，磷酸化-c-Jun，抗CHOP（圣克鲁斯生物技术，圣克鲁斯，加利福尼亚州，美国）-α-SMA（美国马萨诸塞州坎布里奇市Abcam）和多克隆抗磷酸-IRE1（美国科罗拉多州利特尔顿市Novus Biological）。本研究中使用了以下二级抗体：IRDye 680标记的抗兔抗体和IRDyde 800标记的抗鼠和抗羊抗体（Rockland Immunochemicals，Gilbertsville，PA，USA）。本研究中使用了以下化合物：CBD、AM630、JWH133、PF514273、AM251、ACEA、AEA、2-AG、CP55940、突尼斯霉素（Tocris Bioscience，Ellisville，MO，USA）、JNK抑制剂2（Calbiochem，Gibbstown，NJ，USA。

细胞培养

HSC维持在DMEM/F12 50%v/v+10%FBS.LX-2细胞中14是斯科特·弗里德曼博士送的礼物。乙醇处理和对照大鼠的HSC13,34是Natalia Nieto医生的礼物。慢性给予CCl的小鼠JS1细胞（小鼠激活的HSC）和初级HSC4斯科特·弗里德曼（Scott Friedman）博士、弗吉尼亚·埃尔南德斯·盖亚（Virginia Hernandez-Gea）和扎赫拉·吉亚西·内贾德（Zahra Ghiassi-Nejad）博士送了一份为期一个月的礼物。原代大鼠肝细胞取自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA），并按照制造商的方案进行维护。

细胞活力测定

如前所述，使用酸性磷酸酶测定法测定细胞活力。35简单地说，用载体（DMSO）、CBD或指示的配体和药物处理细胞指定时间，然后用PBS清洗。将10 mM双（对硝基苯基）磷酸盐（底物）放入165 mM醋酸钠缓冲液中，pH 5.5，含有0.1%Triton X-100，添加到细胞中，并在室温下培养16–24h.通过添加1N NaOH终止反应，并使用分光光度计测量410 nM时的吸光度，以测定酸性磷酸酶活性。

蛋白质印迹

如前所述进行Western blot分析。36简单地说，用CBD或指定的化合物处理饥饿16小时的细胞。根据制造商的方案，在RIPA缓冲液中裂解细胞，并对裂解物进行蛋白质印迹分析，并使用特异性抗体探测指示的蛋白质。使用奥德赛成像系统（LI-COR，Lincoln，NE，USA）进行吸墨和成像均遵循制造商的协议。

流式细胞术

根据制造商的协议，细胞用载体或CBD处理指定时间，并用FITC-AnnexinV和碘化丙啶染色（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）。使用DiVa软件（BD Biosciences）对三激光LSRII进行流式细胞术分析。使用FlowJo软件（Tree Star Inc.，美国俄勒冈州阿什兰）对数据进行分析。

电子显微镜

用3%戊二醛（pH 7.4）固定细胞。然后用0.2M碳酸钠中的1%四氧化锇处理样品1小时，然后通过环氧丙烷分级步骤进行乙醇脱水，然后嵌入Embed 812（美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德市电子显微镜科学）。图像是在日立H7000透射电子显微镜上采集的（日本东京日立）。

免疫荧光和共焦显微镜

这是按照描述进行的。36使用徕卡TCS SP5共焦显微镜（德国海德堡徕卡微系统公司）对载玻片进行可视化。使用x63/1.32 PL APO物镜（Leica Microsystems）采集图像，并在顺序扫描模式下进行分析。

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

细胞用载体（DMSO）或CBD处理指定时间，然后用PBS洗涤。使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN，Valencia，CA，USA）分离总RNA，并使用高容量RNA-to-cDNA Kit（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，US）逆转录。来自活化HSC的cDNA经标准PCR和Taq聚合酶（Invitrogen）检测剪接，或经实时PCR和SYBR Green（Applied Biosystems）检测相对mRNA水平。对于通过标准PCR检测拼接Xbp1，每只大鼠500 nM Xbp1特异性引物，37使用5′-AAAACAGAGAGAGACAGACTGC-3′和5′-TCCTTCGGTAGACCGCGCGCGC-3′反义序列，程序如下：（1）94℃4 min，（2）94℃35个循环45 s，63℃30 s，72℃30 s和（3）72℃10 min。用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，以解析473bp（未拼接）和428bp（拼接）扩增子。使用以下引物进行实时PCR（500nM）大鼠：ATF4的5′-TATGGATGTGGTCAGTG-3′和反义5′-CTCATCTGGCATTCC-3′ATF6的5′-GATTGACTGCTTGGAGTC-3′和逆义5′-GGACCAGAGAGAGACA-3′CHOP的5′-CACACTGAAGCAGAAAAC-3′及反义5’-CACTGTCAAAGGCGAG-3′XBP15′-AGATGTTCTGGGGGAGGTGAC-3′甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）正义5′-TCAAGAGGTGGTGAAGCAG-3′和反义5′-AGGTGGAAGAGTGTG-3′RNA聚合酶II正义5′-GAAAGAGAGTGCTCAG-3’和反义5'-ATCCGCAGAGTTACAGG-3′次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶正义5′-CCCAAAATGTAAGTGC-3′和逆义5′-TCAMAGCATCACAC-3′。使用ΔΔC进行定量分析T型方法和REST软件(http://www.gene-quantitation.de).38

DN IRE1α转染

用编码DN IRE1的Addgene质粒20745（Addgene，Cambridge，MA，USA）转染JS1细胞（小鼠激活的HSC）α（K599A，显性负激酶突变体），由Fumihiko Urano博士产生，39使用Lipofectamine（Invitrogen）。通过嘌呤霉素筛选和抗性细胞克隆生长建立稳定系。三个不同的克隆也观察到类似的结果。DN IRE1α用人/小鼠IRE1特异性引物、5′-CTCTATGCTCCCTCAATG-3′和反义5′-AAGTCCTGCTCCACATC-3′（跨越突变位点）RT-PCR验证了其在JS1野生型细胞中的表达，JS1细胞表达DN IRE1α和LX-2细胞，根据上述RT-PCR方法。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，然后使用IRE1反义引物进行测序。同时使用人类（感觉5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，反义5′-GAGATGGTGATGATTC-3′）或小鼠（感觉5’-TGAAGGTGGTGTGAACG-3′，逆义5′-CAATCTCCACTTGCCACTG-3′）的GAPDH特异性引物作为内部对照。

siATF4转染

用隐形RNAi-siRNA转染六孔板中的JS1细胞至ATF4（Invitrogen），使用脂质体（Invit罗gen）转染6 h。转染后，细胞被血清饥饿16小时，然后用CBD处理指定时间。

统计分析

统计显著性和P（P）-值由学生的t吨-在比较两组时进行测试，或在比较多组时使用GraphPad Prism软件（GraphPad-software，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）通过单向方差分析和Bonferroni事后测试。P（P）-价值(*P（P）<0.05;**P（P）<0.01;***P（P）<0.001）（共<0.05）被认为具有统计学意义。

致谢

我们感谢斯科特·弗里德曼博士的建设性讨论、评论和LX-2细胞的礼物，感谢弗吉尼亚·埃尔南德斯·盖亚博士和扎赫拉·吉亚西·奈贾德博士对小鼠原代HSC和JS1细胞的捐赠，感谢娜塔莉亚·尼托博士对大鼠HSC的捐赠，以及斯琳娜·阿瓦扬博士对流式细胞术的帮助。这项工作得到了NIH拨款DA08863、LAD拨款DA019521、RR拨款AA017067、MSSM-Micropy共享资源设施拨款R24 CA095823的支持。

词汇表

2克2-花生酰甘油
航空航天局花生四烯酸乙醇胺
ASK1凋亡信号调节激酶1
α座椅模块组件α-平滑肌肌动蛋白
自动变速箱4激活转录因子4
ATF6型激活转录因子6
CB（断路器）1R（右）I型大麻素受体
CB（断路器）2R（右）II型大麻素受体
中央商务区大麻二酚
DN（公称直径）显性阴性
发动机控制模块细胞外基质
电子标签2α真核生物翻译起始因子2α
急诊室内质网
CHOP公司C/EBP（CCAAT/增强子结合蛋白）同源蛋白
GAPDH公司3-磷酸甘油醛脱氢酶
GRP78级葡萄糖调节蛋白78 kDa
HSC公司肝星状细胞
爱尔兰共和国1α肌醇需要ER-核信号激酶-1α
JNK公司c-Jun N-末端激酶
帕普聚（ADP核糖）聚合酶
PERK公司PRKR（RNA-依赖性蛋白激酶）样ER激酶
UPR（不间断电源）未折叠蛋白反应
XBP-1型X盒结合蛋白-1

笔记

作者声明没有利益冲突。

脚注

M Piacentini编辑

工具书类

  • 新罕布什尔州阿夫达尔Schuppan D。肝硬化。柳叶刀。2008;371:838–851. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 疾病机制：肝纤维化的机制和治疗意义。Nat Clin Pract胃肠道肝素。2004;1:98–105.[公共医学][谷歌学者]
  • Friedman SL。肝星状细胞：肝脏的蛋白质、多功能和神秘细胞。生理学评论。2008;88:125–172. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Friedman SL，Bansal MB。肝纤维化的逆转——事实还是幻想。肝病学。2006;43：S82–S88。[公共医学][谷歌学者]
  • Tam J，Liu J，Mukhopadhyay B，Cinar R，Godlewski G，Kunos G.肝病中的内源性大麻素。肝病学。2011;53:346–355. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Siegmund SV、Uchinami H、Osawa Y、Brenner DA、Schwabe RF。阿南达胺诱导原代肝星状细胞坏死。肝病学。2005;41:1085–1095.[公共医学][谷歌学者]
  • Mafait AM、Galliy R、Sumariwalla PF、Malik AS、Andreakos E、Mechoulam R等。非精神活性大麻成分大麻二酚是一种口服抗关节炎药物，用于治疗小鼠胶原蛋白诱导的关节炎。美国国家科学院程序。2000;97:9561–9566. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Weiss L、Zeira M、Reich S、Har-Noy M、Mechoulam R、Slavin S等。Cannabidiol降低非肥胖糖尿病小鼠的糖尿病发病率。自身免疫。2006;39:143–151.[公共医学][谷歌学者]
  • Hampson AJ、Grimaldi M、Axelrod J、Wink D.大麻酚和（−）Delta9-四氢大麻酚是神经保护抗氧化剂。美国国家科学院程序。1998;95:8268–8273. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ligresti A、Moriello AS、Starowicz K、Matias I、Pisanti S、De Petrocellis L等。植物大麻素的抗肿瘤活性，重点在于大麻素对人类乳腺癌的影响。药理学实验与治疗杂志。2006;318:1375–1387.[公共医学][谷歌学者]
  • McAllister SD、Christian RT、Horowitz MP、Garcia A、Desprez PY。Cannabidiol作为侵袭性乳腺癌细胞中Id-1基因表达的新型抑制剂。摩尔癌症治疗。2007;6:2921–2927.[公共医学][谷歌学者]
  • Vaccani A、Massi P、Colombo A、Rubino T、Parolaro D。大麻二醇通过大麻素受体依赖机制抑制人脑胶质瘤细胞迁移。英国药理学杂志。2005;144:1032–1036. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cubero FJ，Nieto N.乙醇和花生四烯酸协同激活Kupffer细胞，并通过肿瘤坏死因子α、还原型谷胱甘肽和转化生长因子β依赖机制调节成纤维反应。肝病学。2008;48:2027–2039. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Xu L，Hui AY，Albanis E，Arthur MJ，O'Byrne SM，Blaner WS，等。人类肝星状细胞系，LX-1和LX-2：肝纤维化分析的新工具。肠子。2005;54:142–151. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kim I、Xu W、Reed JC。细胞死亡和内质网应激：疾病相关性和治疗机会。Nat Rev药物发现。2008;7:1013–1030.[公共医学][谷歌学者]
  • Szegezdi E，Logue SE，Gorman AM，Samali A.内质网应激诱导凋亡的介体。EMBO代表。2006;7:880–885. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yan W，Frank CL，Korth MJ，Sopher BL，Novoa I，Ron D等。内质网应激诱导的分子伴侣P58IPK对PERK eIF2α激酶活性的控制。美国国家科学院程序。2002;99:15920–15925. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Urano F，Wang X，Bertolotti A，Zhang Y，Chung P，Harding HP，等。通过跨膜蛋白激酶IRE1将内质网应激与JNK蛋白激酶激活耦合。科学。2000;287:664–666.[公共医学][谷歌学者]
  • Nishitoh H、Matsuzawa A、Tobiume K、Saegusa K、Takeda K、Inoue K等。ASK1对于内质网应激诱导的神经元细胞死亡（由扩大的聚谷氨酰胺重复序列触发）至关重要。基因发育。2002;16:1345–1355. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yang W、Tiffany-Castiglioni E、Koh HC、Son IH。百草枯激活与人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡相关的IRE1/ASK1/JNK级联。毒理学快报。2009;191:203–210.[公共医学][谷歌学者]
  • Han MS、Chung KW、Cheon HG、Rhee SD、Yoon CH、Lee MK等。甲磺酸伊马替尼减轻db/db小鼠内质网应激并诱导糖尿病缓解。糖尿病。2009;58:329–336. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bataller R，Brenner DA。肝星状细胞作为肝纤维化治疗的靶点。塞米恩肝病。2001;21:437–451.[公共医学][谷歌学者]
  • Iredale JP、Benyon RC、Pickering J、McCullen M、Northrop M、Pawley S等。大鼠肝纤维化自发消退的机制。肝星状细胞凋亡和金属蛋白酶抑制剂在肝脏的表达降低。临床投资杂志。1998;102:538–549. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wright MC、Issa R、Smart DE、Trim N、Murray GI、Primrose JN等。胶质毒素刺激人和大鼠肝星状细胞的凋亡，并增强大鼠肝纤维化的解决。胃肠病学。2001;121:685–698.[公共医学][谷歌学者]
  • Oakley F、Meso M、Iredale JP、Green K、Marek CJ、Zhou X等。抑制κB激酶抑制剂可刺激肝星状细胞凋亡并加速大鼠肝纤维化的恢复。胃肠病学。2005;128:108–120.[公共医学][谷歌学者]
  • 吴建华、王毅、黄伟业、谭锐。构造素对肝星状细胞的抗增殖和促凋亡作用。世界胃肠病杂志。16:3911–3918. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Anselmi K、Stolz DB、Nalesnik M、Watkins SC、Kamath R、Gandhi CR。胶质毒素导致大鼠Kupffer细胞凋亡和坏死在体外和体内在没有氧化应激的情况下：caspase和丝氨酸蛋白酶抑制加重。肝素杂志。2007;47:103–113. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hagens WI、Olinga P、Meijer DK、Groothuis GM、Beljaars L、Poelstra K、Gliotoxin在纤维化和正常肝脏中非选择性诱导凋亡。肝脏Int。2006;26:232–239.[公共医学][谷歌学者]
  • Teixeira-Clerc F、Julien B、Grenard P、Tran Van Nhieu J、Deveaux V、Li L等。CB1大麻素受体拮抗：治疗肝纤维化的新策略。自然医学。2006;12:671–676.[公共医学][谷歌学者]
  • Mallat A，Lotersztajn S.大麻素受体作为肝病治疗靶点。药物新闻透视。2008;21:363–368.[公共医学][谷歌学者]
  • Mechoulam R、Peters M、Murillo-Rodriguez E、Hanus LO。大麻二酚——最新进展。化学生物多样性。2007;4:1678–1692.[公共医学][谷歌学者]
  • Carracedo A、Lorente M、Egia A、Blazquez C、Garcia S、Giroux V等。应激调节蛋白p8介导大麻素诱导的肿瘤细胞凋亡。癌细胞。2006;9:301–312.[公共医学][谷歌学者]
  • Carracedo A、Gironella M、Lorente M、Garcia S、Guzman M、Velasco G等。大麻素通过内质网应激相关基因诱导胰腺癌细胞凋亡。癌症研究。2006;66:6748–6755.[公共医学][谷歌学者]
  • Urtasun R、Cubero FJ、Vera M、Nieto N。活性氮通过诱导MMP1和TNFalpha启动早期细胞外基质重塑。胃肠病学。2009;136:1410–1422. e1411–e1414。[公共医学][谷歌学者]
  • Fricker AD、Rios C、Devi LA、Gomes I.血清素受体激活导致神经突起生长和神经元存活。大脑研究摩尔大脑研究。2005;138:228–235.[公共医学][谷歌学者]
  • Rozenfeld R，Devi LA。适配器蛋白AP-3对CB1大麻素受体贩运的调节。法赛布·J。2008;22:2311–2322. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Calfon M、Zeng H、Urano F、Till JH、Hubbard SR、Harding HP等。IRE1通过处理XBP-1 mRNA将内质网负荷与分泌能力耦合。自然。2002;415:92–96.[公共医学][谷歌学者]
  • Pfaffl MW、Horgan GW、Dempfle L.Relative expression software tool（REST），用于实时PCR中相对表达结果的分组比较和统计分析。核酸研究。2002;30：e36。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lipson KL，Ghosh R，Urano F.IRE1α在胰腺β细胞胰岛素mRNA降解中的作用。公共科学图书馆一号。2008;三：e1648。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
来自的文章细胞死亡与疾病由以下人员提供自然出版集团