鳞状上皮癌变过程中炎性肥大细胞上调血管生成

肥大细胞的基质浸润伴随着血管生成的激活和发育异常

根据血管系统整体可视化显示的线索，我们利用氯乙酸酯酶（CAE）组织化学对分期肿瘤皮肤石蜡包埋切片进行组织化学研究，询问MC是否与不同的致癌阶段有关（图。​（图2）。2). CAE检测结缔组织MC中存在糜蛋白酶样丝氨酸酯酶（糜酶）(Leder 1979年;Caughey等人，1988年). 正常皮肤含有少量MC，分布在表皮基底膜远端的真皮内（图。​（图2A）。2A） ●●●●。MC数量在增生期增加，主要与真皮基质内的小血管有关（图。​（图2B）。2B） ●●●●。随着发育不良患者血管生成增强，早期（3个月大）和晚期（6个月大的）血管生成性病变的真皮结缔组织中MC密度显著增加（图。​（图2C、D、，2C、 D）。与血管生成性异型增生相比，M-PDSCs内的肿瘤基质基本上缺乏MC（图。​（图2E）。2E） ●●●●。然而，肿瘤侵袭前缘周围的基质含有丰富的MC，最常见的是毗邻毛细血管（图。​（图2F）。2F） ●●●●。在肿瘤进展的任何阶段，上皮细胞室中均未观察到MC。

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图2

血管生成激活期间肥大细胞浸润。用苏木精（蓝色）复染的5μm石蜡包埋组织切片上的氯乙酸酯酶组织化学（红色染色）确定了肿瘤进展过程中浸润MC的位置(A类)非转基因窝伴侣（-lm）耳部皮肤(B类)耳朵皮肤增生（hyp）(C类和D类)耳部皮肤发育不良(E类)胸部中心M-PDSC(F类)在躯干M-PDSC的侵入前端。箭头指示肿瘤扩展的方向。(克)具有发育不良躯干损伤的凝集素灌注转基因小鼠的整体显微镜观察。深染肥大细胞（箭头）似乎直接粘附在血管生成性发育不良中真皮毛细血管（c）周围的基底膜上。(H（H）)用甲苯胺蓝染色MC中的变色颗粒。脱粒肥大细胞（箭头）出现在发育不良病变中，与皮肤基底膜（bm）和真皮毛细血管（c，箭头）紧密并列。（d） 真皮，（e）表皮。棒材，44.6微米(A–D、F); 89微米(E类); 19.7微米(克); 12.9微米(H（H）).

利用组织MC的亲和素和甲苯胺蓝结合能力以高分辨率查看其位置(Befus等人，1982年;Tharp等人，1985年)，我们发现血管生成性发育不良中浸润的MC与内皮下和上皮基底膜密切相关（图。​（图2，2、G和H）。

我们通过对一组转基因小鼠进行全身抗生素治疗[磺胺甲恶唑（60 mg/片）、甲氧苄啶（10 mg/片，并通过培育第二个队列进入免疫缺陷Rag1/null背景(Mombaerts等人，1992年). 这些治疗并没有改变MC流入增生异常表皮下基质的情况（数据未显示）。因此，血管生成性发育不良中MC的存在似乎不是对体液免疫系统激活的反应。

血管生成性发育不良富含肥大细胞特异性丝氨酸蛋白酶

接下来，我们用选择性溶液分析法定量了每个肿瘤阶段组织提取物中MC特异性胰蛋白酶和糜蛋白酶（分别为胰蛋白酶和凝乳酶）的活性（图。​（图3A）。三A） ●●●●。尽管在正常阴性窝鼠对照组织中检测到糜蛋白酶样活性[n个 = 2; 每mg蛋白质62.5±17.5 nmoles pNA/min(s.e.m.公司。)]在增生组织中(n个 = 4; 39.8±13.5 nmoles的pNA/min每mg蛋白），血管生成性发育不良的活性显著增加(n个 = 6; 204±3.6 nmoles pNA/min/mg蛋白质；P（P） < 0.003). 此外，血管生成性发育不良的类糜酶活性水平高于SCC(n个 = 三；15.3±8.2 nmoles的pNA/min/mg蛋白）。提取物中的类糜酶活性被10μ米大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI），而不是100μg/ml抑肽酶，这是MC糜蛋白酶的特征(考基1995).

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图3

肿瘤皮肤中的淀粉酶和类胰蛋白酶。(A类)肿瘤皮肤中的糜烂和胰蛋白酶活性。这些值表示通过高离子强度萃取溶解的阴性窝鼠（N）、增生（H）、发育不良（D）和肿瘤（T）的耳部皮肤活检中的平均糜蛋白酶和类胰蛋白酶活性，归一化为萃取液中的蛋白质量±s.e.m.公司。); 每个组织样品用1 m培养5μl米糜烂或胰蛋白酶底物。图中显示了37°C下410 nm处吸光度的变化，单位表示每mg蛋白质每分钟裂解的底物μmoles。(B类)对发育不良耳朵mRNA中所有mMCP进行RT-PCR分析。显示的大小表示碱基对。对所有引物对进行对照RNA的特异性启动试验(C类)K14–HPV16小鼠耳mMCP-4纯化的SDS-PAGE。样品用二硫苏糖醇还原，并用考马斯亮蓝显示。（车道1), 2米K14-HPV小鼠耳NaCl提取物（5μg蛋白质）；（车道2) 2米氯化钠提取物SBTI-淀粉未结合部分（1μg蛋白质）；（车道三)，5μg纯mMCP-4，SBTI-海藻酸洗脱液。(D类)抗rat MCP-1 IgG与mMCP-4特异性反应。（车道1)耳朵粗高盐提取物（2μl）；（车道2)，2.5ng来自SBTI琼脂糖酸洗脱液的纯化的mMCP-4。(E类)K14–HPV16小鼠耳mMCP-6纯化的SDS-PAGE。样品用二硫苏糖醇还原，并用考马斯亮蓝显示。（车道1)来自的未绑定分数第页-氨基苯甲脒-琼脂糖色谱法，2μl；（车道2), 2米氯化钠提取物，未结合部分，2μl；（车道三)肝素-HPLC NaCl梯度洗脱的MMCP-6峰（240 ng）。分子质量以kD表示。

同样，在两个正常人中都检测到类胰蛋白酶活性(n个 = 2; 13±13 nmoles pNA/min/mg蛋白质）和增生(n个 = 4; 15.7±10.6 nmoles pNA/min/mg蛋白质）皮肤；同样，血管生成性发育不良具有显著的活性升高(n个 = 6; 每毫克蛋白质131±49.3 nmoles pNA/min；P（P） < 0.04），与前者和弗兰克癌相比(n个 = 三；30±12.6 nmoles pNA/min/mg蛋白质）。提取物中类胰蛋白酶活性被1.5 m抑制米苯甲脒是胰蛋白酶的一般抑制剂，但不受10%小鼠血浆的影响（数据未显示）。对血浆中丝氨酸蛋白酶抑制剂的耐药性是MC类胰蛋白酶的特性。

不同解剖位置和不同病理条件下的MC选择性表达不同的糜蛋白酶转录物[小鼠肥大细胞蛋白酶（mMCP）1、-2、-4和/或-5]和类胰蛋白酶转录物（mMCP-6和/或-7）(Reynolds等人，1990年;Stevens等人，1994年). 通过对从发育不良的耳部皮肤中分离的RNA进行RT-PCR分析，我们检测到仅代表mMCP-4（β-糜蛋白酶）和mMCP-6（类胰蛋白酶）的mRNA（图。​（图3B）。三B） ●●●●。我们通过肿瘤皮肤裂解物的免疫印迹分析确认了其编码基因产物的存在；用亲和纯化的抗大鼠MCP-1 IgG检测到～28 kD的mMCP-4（大鼠MCP-1是mMCP-4的直系同源物；考基1995)用亲和纯化的抗mMCP-6 IgG检测到约34 kD的mMCP-6IgG(Ghildyal等人，1996年)（未显示数据）。

从血管生成性异型增生中纯化的糜蛋白酶代表了装载到SBTI-淀粉柱上糜蛋白酶活性的99%。它的比活性为5.5μmole琥珀酰-我-通过SDS-PAGE（图。​（图3C），三C） ，并在免疫印迹中与抗大鼠MCP-1 IgG反应（图。​（图3D）。三D） ●●●●。纯化的糜蛋白酶的氨基末端序列为IIGGVESRP，与已发表的mMCP-4的氨基酸序列相同(Huang等人，1991年). 纯化的mMCP-4在1:100酶-抑制剂摩尔比下被SBTI完全抑制，但在500倍摩尔过量时仅被抑肽酶微弱抑制（数据未显示）。

mMCP-6通过高盐缓冲液提取从发育不良的K14-HPV16转基因小鼠耳朵中纯化，然后进行第页-氨基苯甲脒和肝素亲和层析。纯化的类胰蛋白酶在~34kD时作为单个蛋白带迁移（图。​（图3E），三E） ，并用抗mMCP-6抗体进行免疫印迹（数据未显示）。氨基末端序列为IVGGHEASES，与mMCP-6相同(Reynolds等人，1991年)与其他小鼠类胰蛋白酶mMCP-7不同。纯化的mMCP-6的比活性为每毫克56μmole水解的对甲苯基-赖氨酸-脯氨酸-4-硝基苯胺。该活性占装载到苯甲脒-淀粉柱上的高盐缓冲液中胰蛋白酶活性的99%（数据未显示）。MMCP-6被双（5-氨基-2-苯并咪唑基）甲烷（BABIM）以1:500摩尔比抑制，BABIM是肥大细胞类胰蛋白酶的有效抑制剂(Caughey等人，1993年)但在酶抑制剂摩尔比为1:75时，对抑肽酶的抑制具有抵抗力。

小鼠MCP-6是皮肤成纤维细胞的有丝分裂原

我们观察到，皮肤成纤维细胞的细胞数和胶原沉积到ECM中，如Masson三色染色所示（数据未显示），在早期肿瘤进展期间逐渐增加。值得注意的是，皮肤中的基质成纤维细胞，就像内皮细胞一样，通常是静止的(Gregoire和Lieubeau 1995). 在伤口愈合和肿瘤情况下，增殖的成纤维细胞是新合成的I型前胶原的来源，并负责促结缔组织增生表型(Vuorio和de Crombrugghe 1990年;Gregoire和Lieubeau 1995). 色氨酸酶是一种有丝分裂原(Hartmann等人，1992年)和强效刺激剂类型α1（I）前胶原mRNA合成(凯恩斯和威尔斯1997;Gruber等人，1997年)体外培养人成纤维细胞。类胰蛋白酶的这些活性可能通过与存在于成纤维细胞质膜上的蛋白酶激活受体-2（PAR-2）的相互作用来介导(Molino等人，1997年;Schechter等人，1998年).

因此，我们测试了mMCP-6类胰蛋白酶和mMCP-4糜蛋白酶在没有外源性生长因子的情况下，刺激静止的缺血清亚流原代小鼠皮肤成纤维细胞（PMDFs）和静止的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）DNA合成的能力。MMCP-6以浓度依赖的方式选择性刺激成纤维细胞DNA合成，但不影响HUVEC的增殖。（图。​（图4A、B）。4A、 B）。相反，mMCP-4在任何测试浓度下都不会刺激任何细胞群的DNA合成（图。​（图4A、B）。4A、 B）。这些结果表明，mMCP-6类胰蛋白酶具有细胞类型特异的有丝分裂潜能。

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图4

类胰蛋白酶对皮肤成纤维细胞的影响。MCPs对HUVEC增殖的影响(A类)以及对PMDF增殖的影响(B类). 将激动剂添加到缺乏血清的亚流培养物中（VEGF，1和10 ng/ml；bFGF，1和10ng/ml，mMCP-6，1和10-n）米; mMCP-4、2和20 n米; 肝素浓度分别为74和740 ng/ml），持续16小时[^三H] 然后测定胸腺嘧啶掺入量。显示的结果表明平均值（±s.e.m.公司。;n个 = 3). (C–E类)来自(C类)阴性窝交配（-lm）正常皮肤(D类)增生性（hyp）皮肤，以及(E类)用（α1）I前胶原反义mRNA探针杂交异型增生（dys）皮肤。箭头指向基质中表达前胶原的细胞。（e） 表皮；（d） 真皮，（c）中耳软骨。棒材，44.6微米(C–E类).

在体内，我们观察到正常皮肤呈片状表达α1（I）前胶原毛细血管旁基质中的mRNA（图。​（图4C），4C） 而在靠近毛细血管和上皮的增生性病变中，mRNA表达逐渐上调（图。​（图4D）。4D） ●●●●。在严重浸润MCs的血管生成性发育不良中，类型α1（I）前胶原mRNA在基质中广泛表达（图。​（图4E），4E） 与高水平的类胰蛋白酶相一致，真皮成纤维细胞的细胞数增加，胶原蛋白沉积增加。

MMCP-4通过直接和间接机制诱导ECM重塑和血管生成

细胞增殖试验表明类胰蛋白酶在激活静止的成纤维细胞成为反应性肿瘤基质的增殖成分方面发挥作用；同样的实验表明，在成纤维细胞或内皮细胞上没有糜蛋白酶的促有丝分裂活性。因此，我们询问了糜蛋白酶是否以其他方式改变组织微环境。有趣的是，已知犬和人MCα-糜蛋白酶能激活潜在的细胞外蛋白酶前果胶酶B（proMMP-9）(Fang等人，1996年 1997). 明胶酶B是基质金属蛋白酶（MMP）家族的成员，参与ECM重塑(Coussens and Werb 1996年)以及血管生成的调节(Vu等人，1998年).

因此，我们假设，mMCP-4通过激活前果胶酶B诱导ECM重塑，从而有助于激活血管生成。为了解决这个问题，我们首先利用明胶-底物酶谱法评估代表不同肿瘤阶段的组织裂解物中明胶酶B的相对活性（图​（图5A）。5A） ●●●●。在正常皮肤中未检测到丙二醇酶B，但在增生、异常增生和肿瘤组织中逐渐上调；然而，活性明胶酶B仅在增生异常和肿瘤裂解物中出现。此外，该分析揭示了另一个MMP家族成员的活性特征，即前和活性明胶酶A（MMP-2），其活性在不同的肿瘤阶段仅略有变化。异型增生病变中活化明胶酶B的出现与MC显著浸润和mMCP-4糜蛋白酶活性升高有关。

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图5

mMCP-4对增生组织中存在的前天门冬氨酸酶B的影响以及mMCP-2和明胶酶B在体内的定位。(A类)正常（N）、增生（H）、增生异常（D）和癌（T）活检组织裂解物（2μl）中的胶溶活性。电泳后用1,10菲咯啉（MMPs抑制剂）而非PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）培养明胶酶谱，完全消除了68、72、80和90-kD条带（数据未显示）。(B类)明胶酶B活性的体外重建。两微升增生（H）裂解物或2微升增生裂解物与40 ng纯化mMCP-4在37°C下孵育30分钟。分子质量以kD表示。(C–D类)在发育不良皮肤的上皮（e）和毛细血管（c）附近的基底膜（bm，箭头）处，mMCP-4（红色染色）和层粘连蛋白（棕色染色）的免疫定位。(E类)明胶酶B（蓝色染色）在异型增生皮肤中的免疫定位位于真皮中靠近上皮（e，闭合箭头）和毛细血管（c，开放箭头）的基底膜（bm）。(F类)使用对照兔IgG控制非特异性结合；背景染色可以忽略不计。棒材，44.6微米(C–F).

为了测试mMCP-4是否能激活前天门冬氨酸酶B，类似于犬或人的α-淀粉酶，在底物酶谱分析之前，将增生性皮肤（主要含有明胶酶B的原形式）的裂解物与纯化的mMCP-4.孵育。用mMCP-4培养裂解产物导致活化明胶酶B的数量急剧增加，而明胶酶a的前形式和活性形式都没有改变（图。​（图5B）。5B） ●●●●。添加ecotin（mMCP-4的抑制剂，但不是尿激酶）完全消除了mMCP-4-诱导的明胶酶B的活化，而添加1m的ecotin后，明胶酶B的活性下降米阿米洛利（尿激酶抑制剂）没有效果（数据未显示）。此外，mMCP-4的免疫定位（红色染色；图。​图5C、D）5C、 D）和明胶酶B（蓝色染色；图。​图5E）5E） 在异型增生组织切片中，层粘连蛋白-β1的免疫定位显示，上皮和内皮下基底膜附近的两种酶共定位（棕色染色，图。​图5C，5C、 D）。因此，mMCP-4与早期肿瘤组织中的前果胶酶B共定位并诱导其活化，而不是前果胶蛋白酶A。

接下来，我们询问mMCP-4糜蛋白酶、mMCP-6类胰蛋白酶或明胶酶B是否可以利用体外血管生成生物测试将非血管生成组织转化为血管生成组织（图。​（图6）。6). 将来自1个月大转基因小鼠的高塑性耳朵皮肤在单独的培养基或含有mMCP-4、mMCP-6或明胶酶B的培养基中孵育。随后，将增生的皮肤包埋在单独的胶原凝胶或含有随机分散的牛毛细血管内皮细胞（BCE）的胶原凝胶中。将对照组和蛋白酶处理过的超塑性皮肤片放入缺乏BCE的胶原蛋白凝胶中。他们显示，活组织检查中的细胞迁移微不足道（数据未显示）。BCE仍随机分布在未经治疗的增生性皮肤周围（图。​（图6A）。6A） ●●●●。用mMCP-6处理皮肤也没有产生反应（图。​（图6B），6B） ，尽管人类类胰蛋白酶是一种已知的EC形态发生素(Blair等人，1997年). 相反，经mMCP-4处理的皮肤诱发了BCE的剧烈反应，其径向排列、增殖、迁移和管形成朝向皮肤片的真皮表面，没有证据表明沿表皮方向迁移或管形成（图。​（图6C、D）。6C、 D）。明胶酶B处理的增生性皮肤显示出与mMCP-4观察到的类似反应（数据未显示）。直接添加到胶原蛋白凝胶中BCE的mMCP-4和明胶酶B均未引起反应（数据未显示），表明这些活动是由皮肤碎片释放隔离活性直接引起的。因此，mMCP-4和明胶酶B均诱导增生组织的ECM重塑，直接导致隔离血管生成活性的释放。

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图6

mMCP-4对癌前组织中隔离血管生成活性的影响。将1个月大的K14–HPV16小鼠的耳部皮肤（S）在37°C有无酶的条件下培养48小时，然后植入胶原蛋白凝胶中与EC共培养。培养维持3周，共培养12天后拍摄试管长入的照片。(A类)未经处理的耳部皮肤植入EC胶原凝胶；(B类)mMCP-6处理（10 n米)耳部皮肤植入EC胶原凝胶；(C类和D类)mMCP-4处理（20 n米)耳部皮肤植入EC胶原凝胶后显示出血管生成反应，并形成广泛的EC管。低放大倍数(D类)显示了管状结构朝向真皮（d）表面的极化方向，而不是皮肤的表皮（e）表面。小箭头(A类和B类)表示EC的无次序随机增长，而粗箭头(C类和D类)表示径向排列的小管向皮肤生长。（h） 头发。棒材：58μm(A–C); 116微米(D类).

炎症、肥大细胞和血管生成：肿瘤早期进展的参数

成年生物体中的血管生成通常仅限于组织修复/重塑的情况，如月经期间、乳腺退化、伤口愈合、炎症和肿瘤形成(萨拉蒙森和伍利1996;哈纳汉和福克曼1996). 血管生成涉及内皮细胞的激活、增殖和迁移，以及ECM的局部蛋白水解修饰(Ingber和Folkman 1989年). ECM的蛋白水解促进内皮细胞迁移和增殖，从隔离的潜在储备中释放储存的血管生成信号分子(梅宁格1995;Brown等人，1997年;Friedl等人，1997年;Poltarek等人，1997年)以及放松基质环境以促进迁移(Coussens and Werb 1996年). 在皮肤器官中，组织损伤后几秒钟内，血管生成激活和炎症细胞浸润基质。这意味着皮肤含有调节机制，既可以维持血管静止，也可以启动快速新生血管反应。如何实现这一点？

MC释放多种已知的因子来增强血管生成表型，包括肝素、肝素酶、组胺、金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，以及各种多肽生长因子，包括bFGF[b条专用集成电路(（f）成纤维细胞克生长因子）]和VEGF/VPF(v（v）血管的e（电子）内皮的克罗思（f）演员/v（v）血管的第页渗透性（f）演员）(Bashkin等人，1990年;Vlodavsky等人，1992年;梅宁格1995;Reed等人，1995年;Grutzkau等人，1998年). 因此，MCs为成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞提供直接的有丝分裂原，以及多种酶活性。K14-HPV16转基因小鼠血管生成的激活与MC对真皮基质的显著浸润一致。MC聚集在毛细血管周围以及上皮基底膜下，在那里MC产品的脱颗粒和释放很明显。引人注目的是，MC在实体肿瘤基质中基本上不存在，但在肿瘤-宿主界面上表现突出。从肿瘤中排除MC揭示了核心肿瘤微环境与与癌前进展和癌细胞侵袭正常组织相关的微环境之间的区别。

未来的一个明确目标是识别MC炎症征集的信号。由于HPV表达的皮肤很早就开始角化过度，因此皮肤屏障功能丧失产生的信号是可能的。其中一个效应器可能是激活体液免疫以应对继发感染。然而，当K14–HPV16转基因小鼠接受抗生素治疗或培育成Rag1/null背景时，它们在空间/时间上有类似的MC对异型增生的浸润，反对将感染作为刺激。相反，信号可能来自早期的表皮肿瘤本身，也可能是对受影响皮肤的其他继发性异常的反应。

在血管生成性发育不良中发现了两种中性MC-特异性丝氨酸蛋白水解活性，即mMCP-4和mMCP-6。小鼠MCP-4是一种β-糜蛋白酶，是血管生成性发育不良的主要糜蛋白酶。免疫定位表明，mMCP-4酶的有限扩散性表明体内底物同样位于基底膜附近。事实上，我们的数据显示，mMCP-4激活前果胶酶B，此外，可以将非血管生成组织转换为血管生成表型，正如血管生成的内皮共培养分析所揭示的那样。我们认为，mMCP-4通过其激活前果胶酶B的能力，直接或间接地从肿瘤皮肤中释放隔离的血管生成因子，如VEGF/VPF和a/bFGF，从而影响血管生成的诱导。血管生成因子隔离/释放机制的支持来自Whitlock等人（1996年）他证明，基质溶素-1、胶原酶-3和肝素酶都能降解ECM成分珍珠糖，从而释放结合的bFGF。明胶酶B对生成血管生成信号很重要的直接证据来自对明胶酶B-敲除小鼠骨生长板的研究，该研究显示血管生成延迟(Vu等人，1998年). 明胶酶B和/或皮肤ECM中mMCP-4释放的血管生成生长因子的特性尚待确定。

我们关于MCP-6的数据表明，这种丝氨酸蛋白酶并不直接影响EC生长，而是激活皮肤成纤维细胞，从而有助于诱导α1（I）前胶原合成，支持类胰蛋白酶在与新生血管相关的基质生成和基质重塑中的作用。

对MC-缺陷小鼠增生阶段的分析证明了早期MC-炎症反应的重要性。值得注意的是，在年龄匹配的MC-proficient HPV小鼠中，血管密度和结构比观察到的典型增生上皮下的静态血管更具特征性。我们推测，血管反应受损是由于缺乏血管生成生长因子（例如bFGF和VEGF/VPF）和MC正常传递的MC蛋白，因为它们在血管床和表皮基底膜周围局部脱粒。

肥大细胞的普遍性与肿瘤

1891年，威斯特伐尔首次报道肿瘤边缘存在MC(威斯特伐尔1891). 随后，许多研究人员证实，两种实验诱导的啮齿动物肿瘤的外围均存在MC(诺尔比和伍利1993;梅宁格1995)以及各种人类肿瘤(Aaltomaa等人，1993年;Shea和Prieto 1994年;Duncan等人，1998年; J.M.McKerrow、V.Bhargava、E.Hansell、T.Kuwahara、M.Matley、L.Coussens和R.Warren，准备中）；因此，肿瘤部位MC的招募似乎是HPV16非依赖性的。有趣的是，三种最具侵袭性的人类癌症，恶性黑色素瘤、乳腺癌和结直肠癌，通常与由各种炎症细胞组成的显著宿主反应有关，尤其是肿瘤周围的MCs(诺尔比和伍利1993).

MC仅仅是一把确凿的证据吗？我们对MC-缺乏背景下的肿瘤进展的分析表明，尽管只有一只老鼠，但MC-远不止是被动的旁观者。更有可能的是，MC及其产物在肿瘤组织中被破坏，并在功能上协助跳跃性血管生成，从而充当肿瘤形成的关键外部调节剂。另外两项研究同样支持MCs在肿瘤发生中的因果作用：MC-defient配套元件^W公司/配套元件^Wv公司实验证明小鼠肿瘤相关血管生成减少(Starkey等人，1988年); 并且，用一种抑制MC脱颗粒的化合物（FPL 55618）治疗大鼠，使乳腺腺癌的生长减少70%(Dabbous等人，1991年).

免疫组织化学

转基因动物的组织块要么在OCT冷冻培养基（Sakura）中快速冷冻并储存在−80°C下，要么浸没在3.75%多聚甲醛和磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后通过分级醇和二甲苯脱水，并嵌入石蜡中。使用设置在−20°C的Hacker低温恒温器切割OCT切片（10-μm厚）。在使用之前，将切下的冰冻切片在室温下干燥，然后在冰镇丙酮中固定10分钟。或者，使用徕卡2135切片机切下5μm厚的石蜡切片。如前所述，将切片脱蜡并进行免疫组织化学染色(Coussens等人，1996年). 兔抗鼠MCP-1（识别mMCP-4；Moredun研究所）的一级抗体稀释度为1:200，兔抗鼠明胶酶B的一级血清稀释度为1:100(Behrendtsen等人，1992年)在含有PBS（pH 7.4）、2.5%山羊血清和1%牛血清白蛋白（BSA）的封闭溶液中，大鼠抗鼠层粘连蛋白-β1（Upstate Biotechnology，Inc.）为1:100，大鼠抗鼠CD31（Pharmingen）为1:100,兔抗鼠Ki-67（Dianova）为1:50。在室温下与一级抗体孵育4小时。在室温下与生物素化二级抗体（山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG，1:200，Pierce Chemical）孵育30分钟后，用含有左旋咪唑（载体）的3,3′-二氨基联苯胺（DAB；Sigma）或碱性磷酸酶底物（载体）显示抗原。切片在1%甲基绿中复染（1分钟），在分级酒精（70%、95%、100%乙醇）中脱水，安装在Cytoseal 60（Stephens Scientific）中，并用Nomarski光学进行可视化。所有免疫定位实验在多个组织切片上重复三次，包括阴性对照，以测定可忽略不计的背景染色。

灌注固定和凝集素结合

为了原位显示血管床，凝集素灌注和结合凝集素的可视化基本上如前所述(Tharp等人，1985年;瑟斯顿等人，1996年). 简单地说，通过腹腔注射用50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉动物，然后通过升主动脉用固定剂[1%多聚甲醛（PFA），0.5%戊二醛，在pH 7.4]的PBS中灌注5分钟，压力130 mmHg。固定后灌注（1）50 ml PBS（1分钟）；（2） 25 ml PBS，1%BSA（80秒）；（3） 50 ml 5-μg/ml生物素化番茄红PBS中的凝集素（载体），1%BSA（80秒）；（4） 25毫升PBS、1%牛血清白蛋白（80秒）。然后取出组织，将其浸泡在4%PFA的PBS中过夜。随后在旋转平台上室温下在PBS（0.3%Triton X-100）中通宵渗透。为了定位凝集素结合，组织在旋转平台上用1:200稀释的亲和素过氧化物酶复合物（Vector）培养48小时，用50 m冲洗2小时米Tris，pH 7.4，1%Triton X-100，暴露于0.5 mg/ml DAB（西格玛）中10分钟，50 m米pH 7.4，0.01%H下的Tris₂O（运行）₂在室温下。染色后，用H洗涤组织₂O并通过分级醇（50%、70%、95%和100%乙醇）脱水。然后将组织在两个玻璃载玻片之间用100%乙醇压平过夜，在甲苯中清除，然后安装在Cytoseal 60中（Stephens Scientific）。用Nomarski光学系统对整个组织进行可视化。

酶组织化学

在10μm OCT包埋的丙酮固定切片或5μm石蜡包埋的组织切片中观察到MC，石蜡在二甲苯中脱蜡，通过分级醇（100%、95%、70%、50%乙醇）水合，并在H中平衡₂如前所述，进行氯乙酸酯酶组织化学染色，以揭示MC的糜蛋白酶样丝氨酸酯酶活性(Leder 1979年;Caughey等人，1988年). 然后将载玻片在水中广泛清洗，在Gills苏木精#3中复染（3秒），在100%酒精中脱水，并将其安装在100%甘油的盖玻片下。所示数据代表了对至少10只不同的K14–HPV16转基因动物的组织进行检查后获得的结果，每只动物代表不同的肿瘤进展阶段。

RNA分离和RT-PCR分析

根据制造商的规范，使用Trizol试剂（GIBCO–BRL）从K14–HPV16转基因小鼠的对照组织（辅助淋巴结和肠道）或代表不同组织学阶段的片段中分离出总细胞RNA，并通过260 nm的紫外线吸收率进行量化。根据制造商的规范，使用寡核苷酸（dT）引物和上标II RT（GIBCO–BRL）对总RNA（1–5μg）进行逆转录。然后在热循环器（Perkin-Elmer/Cetus）中扩增等体积的cDNA，最终体积为50μl，含50 m米KCl，10米米pH值8.3时的Tris，4 m米氯化镁₂, 200 μ米所有四个dNTP中的每个，0.4μ米5′和3′寡核苷酸引物，0.6单位塔克聚合酶（Perkin-Elmer公司）。样品首先在95°C下变性5分钟，然后放大30个周期（1个周期：在95°C:1分钟变性，在55°C下退火30秒，在72°C下延伸1分钟），最后在72°C:5分钟延伸。然后取出样品并在5%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。

酸引子

PCR反应中使用的引物为mMCP-1(Wastling等人，1997年)5′-CAGCTGGGGGAGAATGGGG-3′，反义5′-GAGCTCTCTTGGTACTCTTG-3′（100 bp）；mMCP-2型(Xia等人，1996年)正义5′-ACTGGCAAAATGCAGGCC-3′，反义5′-CATCATCACACATGTG-3′（910 bp）；mMCP-4型(Jippo等人，1994年)有义5′-GGAGACTGGAGGACCTCT-3′、反义5′-ACAGGGAACAGTCCATCATC-3′（336bp）；mMCP-5型(McNeil等人，1991年)正5′-ACTCTGGAGCTTTTGCCAG-3′，反义5′-CAGTCGACAATCTGTGTCT-3′（200 bp）；mMCP-6型(亨特等人，1996年)有义5′-GCACACATCAAAAGCCCACAGC-3′反义5′-TAGACAGGGGAGACAAGGAC-3′（700bp）；mMCP-7型(亨特等人，1996年)正义5′-GCACTACTCTCACTGTG-3′，反义5′-CGCATTTTATTAGGCATAGAGA-3′（1003 bp）。

蛋白质提取

采集不同年龄和肿瘤进展阶段的K14–HPV转基因和非转基因野生型FVB/n小鼠的耳朵和胸部皮肤，并在−80°C下冷冻。在仍然冷冻的情况下，将样品切碎并在液态氮下研磨₂制成细粉，然后称重并在10 m内重新悬浮米pH 6.1（低盐缓冲液），浓度为10μl/mg组织。涡流3分钟后，将悬浮液在16000下离心5分钟克.上清液被保存；将颗粒重新悬浮在含有2的上述缓冲液中米NaCl（高盐缓冲液）浓度为10μl/mg组织，然后按上述方法进行涡流和离心。保存回收的上清液进行分析。

蛋白酶溶液分析

通过向含有1m的分析缓冲液中添加5μl等分样品来测量类糜酶活性米琥珀酰-我-Ala-Ala-Pro-Phe-4-硝基苯胺（Sigma），1.8米氯化钠和0.45中9%的二甲基亚砜米三氯化氢（pH 8.0）。通过向含有0.1 mmole tosyl-Gly的分析缓冲液中添加5μl等分样品来测量类胰蛋白酶活性-我-50m内的Pro-Lys-4-硝基苯胺（Sigma）米pH值7.6，120 m的三氯化氢米NaCl，30μg/ml牛肺肝素。在37°C下用分光光度法监测410nm处吸光度的变化。使用8800的游离4-硝基苯胺的消光系数来估计裂解底物的数量/米每厘米。

免疫印迹法

蛋白质样品的高盐提取物在二硫苏糖醇的存在下在12.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后电印迹到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，该膜在室温下在0.3%吐温-20和0.5的溶液中封闭30分钟米50 m内的NaCl米Tris-HCl（pH 7.2），然后用1:1000稀释的兔抗血清或纯化兔抗体在同一缓冲液中培养1小时。用上述Tris/NaCl/Tween-20缓冲液清洗印迹液三次，每次5分钟。用山羊抗兔IgG-碱性磷酸酶抗体和快速红TR/萘酚AS-MX磷酸盐（Sigma）检测结合一级抗体。Richard Stevens（马萨诸塞州剑桥哈佛大学）提供了mMCP-6的兔抗血清。

小鼠MCP-4纯化

血管生成性异型增生中的MC糜酶是通过修改以下描述的人类皮肤糜酶纯化方法来纯化的Schechter等人（1986年）将6个月大的K14–HPV16转基因小鼠的耳朵（总共840 mg）按上述顺序在低盐和高盐缓冲液中提取。将高盐提取物应用于用高盐缓冲液平衡的1ml SBTI琼脂糖（Sigma）柱。首先用高盐缓冲液清洗柱，然后用H₂O、 直到洗脱液在280nm处的吸光度达到基线，之后1 m米在色谱柱中加入HCl。立即用五分之一体积的0.5中和洗脱的部分米三氯化氢（pH 8.0）。洗脱组分中的蛋白质通过SDS-PAGE分离，并通过考马斯蓝染色显示。使用蛋白质分析试剂（Bio-Rad）以BSA为标准测定组分中的蛋白质浓度。利用理论摩尔消光系数33760测定纯化的糜蛋白酶蛋白浓度/米280nm处每厘米，根据推导的氨基酸序列通过以下方法计算克里顿（1984）.

小鼠MCP-6纯化

从5至6个月大的K14–HPV16转基因小鼠耳朵中提取35毫升高盐提取物，用于4毫升第页-氨基苯甲脒-淀粉柱（Sigma）在10 m内平衡米双三氯化氢（pH 6.1），含2米NaCl（高盐缓冲液）。未结合组分中未检测到类胰蛋白酶活性。柱用150 m洗脱米高盐缓冲液中的苯甲脒。然后用10 m将洗脱液稀释三倍米双三甲基氯化钠（pH 6.1），并应用于7.5×75-mm肝素5PW HPLC柱（Toso-Haas），与0.7进行平衡米氯化钠，10米米双三氯化氢（pH 6.1）。使用0.7的线性梯度洗脱活性mMCP-6米氯化钠至2米1.4时NaCl超过15 ml米氯化钠。氨基酸序列测定、SDS-PAGE分析和抗mMCP-6多克隆抗血清的免疫印迹证实了洗脱活性的一致性和纯度。用理论摩尔消光系数68860测定纯化的mMCP-6蛋白浓度/米280nm处每厘米，根据推导的氨基酸序列通过以下方法计算克里顿（1984）.

蛋白质测序

氨基末端序列分析由旧金山加利福尼亚大学生物分子资源中心进行。纯化的mMCP-4和mMCP-6（2.5-μg蛋白质）分别施加到PVDF膜盘上，并在带有在线120A PTH分析仪（applied Biosystems）的470A气相测序器中进行Edman降解。

底物酶谱

通过对邻近皮肤石蜡包埋切片的组织学分析证实，代表肿瘤进展的不同组织学阶段的组织样品称重，然后在含有50μ米三氯化氢（pH 8.0），150 m米氯化钠、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸盐和0.1%十二烷基硫酸钠。通过离心分离可溶性和不溶性提取物，然后在−20°C下储存。通过明胶酶谱分析等量的可溶性提取物(Herron等人，1986年a,b条)在样品缓冲液（10%SDS，0.25）中与基质（1 mg/ml明胶）共聚的10%SDS–聚丙烯酰胺凝胶上米三重HCl和0.1%溴酚蓝（pH 6.8）。电泳后，将凝胶在2.5%Triton X-100中清洗两次15分钟，并在37°C下50 m内培养16小时米三氯化氢，10 m米氯化钙₂（pH 7.6），然后在0.5%考马斯蓝中染色，并在50%甲醇中去污。阴性染色表示活性蛋白酶带的位置。在凝胶分离过程中，组织提取物中的原酶暴露于SDS会导致激活，而不会发生蛋白水解断裂(Talhouk等人，1991年). 为了抑制蛋白水解活性，底物凝胶在底物缓冲液中培养米1,10-菲罗啉（Sigma），5米米PMSF（Sigma）或10μg/ml重组ecotin(McGrath等人，1991年; 由加州大学旧金山分校Charles Craik提供）(Adler等人，1990年). 所示数据代表了对K14–HPV16转基因小鼠中代表不同肿瘤进展阶段的91块组织进行检查后获得的结果。

细胞培养

通过以下方法从FVB/n小鼠中分离出PMDFsBossy-Watzel等人（1992年）并在37°C、5%CO、含4.5 g/L葡萄糖的DMEM中以亚流状态保存，并补充10%胎牛血清（GIBCO-BRL）、50 U/ml青霉素、50μg/ml链霉素₂HUVEC（Clonetics）保存在补充有5%胎牛血清的EBM完全培养基（Clonetic）中。BCE是Judah Folkman（马萨诸塞州波士顿哈佛大学）实验室的礼物，保存在含有10%热灭活小牛血清的DMEM中。

DNA合成分析

通过放射性标记胸腺嘧啶掺入法测定PMDFs或HUVEC亚融合培养物中DNA合成的刺激。细胞以2500个细胞/厘米的速度进行电镀²在含有添加胎牛血清的生长培养基的多孔板中[PMDFs，10%；HUVECs，5%（GIBCO-BRL）]；在培养HUVEC之前，用1.5%的明胶在PBS中预涂培养皿。24小时后，用PBS洗涤细胞三次，并用含有0.5%牛血清白蛋白（GIBCO-BRL）的无血清DMEM（GIBCO-BRL）覆盖细胞。额外24小时后，用激动剂[小鼠bFGF，1和10 ng/ml，（GIBCO-BRL）；人VEGF，1和10ng/ml（Sigma）；纯化的mMCP-4，2和20 n]培养细胞16小时米50米米pH 8.0下的三氯化氢；纯化的mMCP-6、1和10 n米10米米pH值6.1，0.7时的双螺纹米NaCl、225μg/ml肝素（西格玛）；肝素浓度为74和740 ng/ml]，然后添加[甲基-^三H] 胸腺嘧啶（2 mCi/ml，NEN）再维持6小时。三氯乙酸可吸收物质在0.3中溶解n个NaOH和液体闪烁计数评估了合并的放射性。每种测定条件一式三份；两个独立实验的结果具有代表性。

原位杂交

如前所述，对5μm石蜡包埋的正常和转基因皮肤进行原位杂交分析(Coussens等人，1996年). 用于检测的核糖探针α1（I）胶原蛋白（pmCol1–129）mRNA由Paul Bornstein（华盛顿大学，西雅图）提供。

内皮管形成试验

用10%小牛血清对BCE进行胰蛋白酶化并在DMEM中重新悬浮。电池（4×10⁵/ml）与冷冻胶原蛋白溶液（Vitrogen 100；collagen Corp.）在含有0.1%NaHCO的MEM培养基中以1:1的比例混合_三，2米米谷氨酰胺和10 m米HEPES公司。从1个月大的转基因小鼠身上取下皮肤活检组织，在PBS中清洗，并切成<1 mm²然后在37°C和5%CO中培养24小时₂DMEM中的平衡空气培养箱，含有0.5%BSA和10m米mMCP-6，20米米mMCP-4，1 ng/μl明胶酶B（钙生物化学），或仅培养基/BSA。24小时后，取出培养基，更换含有适当激动剂的新鲜培养基，并让其再孵育24小时。用移液管将等分（250μl）的胶原蛋白-细胞混合物移到48周的组织培养板中，并在37°C下使溶液凝胶之前将皮片添加到每个孔中。培养板在10%CO中培养₂平衡空气气氛，在2周内观察内皮细胞生长、迁移和管形成。此外，10米米mMCP-6，20米米将mMCP-4和1 ng/μl明胶酶B（Calbiochem）分别添加到胶原蛋白-EC混合物中，并在1周内监测试管形成。

我们感谢唐纳德·麦克唐纳（Donald McDonald）、加文·瑟斯顿（Gavin Thurston）和汤姆·墨菲（Tom Murphy，和迪伦·丹尼尔进行了有价值的讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院（HL24136，G.H.C；CA72006，Z.W.）的资助，美国国家癌症研究所（D.H.）、美国社会健康协会/辉瑞性传播疾病研究基金（L.M.C.）和霍华德·休斯医学院转基因动物研究基金（G.H.C.）的资助

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