ClpXP和ClpAP蛋白酶通过SsrA标记系统添加的羧基末端肽尾降解蛋白质

蛋白酶缺乏突变体的免疫

为了测试SsrA标记蛋白降解所需的细胞质蛋白酶，我们检测了已知或疑似表达λN-AA或λN-L1-AA蛋白的蛋白酶缺陷菌株的λ免疫增强情况。在插入突变的菌株中未观察到免疫变化clpB、，插入突变hflA、，删除隆，突变离子和clpQ，中国，或温度敏感突变高铁硼（未显示数据）。在ClpXP或ClpAP蛋白酶缺陷的细胞中观察到非常不同的结果。在含有蛋白酶亚基插入的菌株中(clpP公司)或调节亚单位(氯丙酸或clpX公司)，λN-AA或λN-L1-AA的表达导致对λc（c）17（图。​（图2），2)表明这些蛋白酶参与了SsrA标记蛋白质的降解。

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图2

 λN-AA和λN-L1-AA介导的免疫clp公司突变体。表达λN-AA或λN-L1-AA的等基因菌株在含有氨苄青霉素的胰蛋白酶肉汤中生长，并在顶部琼脂中的LB–Amp平板上平板。λ的十毫升系列稀释液c（c）我⁻或λc（c）17个噬菌体被发现，平板在32°C下培养过夜，并计算出相对于转化pBR322的野生型菌株SG22163平板的近似eop。大肠杆菌菌株：野生型（SG22163）；clpP（SG22174）；clpA（SG22176）；clpX SG22177）；和clpAclpX（SG22178）。在对照实验中，异种免疫噬菌体λ国际货币基金组织21c（c）一、 其运算符不受λ阻遏物氨基末端结构域变体的抑制，在所有含有λN-AA或λN-L1-AA的菌株和表达λN-DD或λN-L1-DDλ的野生型菌株上，都涂有1的eopc（c）我⁻和λc（c）17镀有10的eop⁻⁴在表达λN-DD或λN-L1-DD的野生型菌株上或更少。

在不同的clp公司突变体，λ无差异c（c）观察到17种免疫力，但对λ的免疫力存在明显差异c（c）我⁻很明显（图。​（图2）。2). λ的模式c（c）我⁻免疫表明，当ClpP缺陷或ClpX和ClpA均被突变失活时，SsrA标记的氨基结构域蛋白达到最高稳态水平。相比之下，在表达λN-AA的菌株中，ClpX单独失活导致对λ的免疫力非常低c（c）我⁻ClpA单独灭活可对λ产生部分免疫性（λN-L1-AA）或无免疫性（∧N-AA）c（c）我⁻（参见图。​图22用于免疫定量）。在对照实验中，我们发现对照标记的λN-DD或λN-L1-DD蛋白的表达提供了完全免疫[电镀效率（eop）10⁻⁴或更低]至λc（c）我⁻和λc（c）17，野生型和clp公司突变体。因此，Clp介导的噬菌体免疫增强依赖于λ氨基末端结构域蛋白的存在，其羧基末端带有野生型SsrA降解标签。我们将这些数据解释为，ClpXP或ClpAP均可降解，从而降低λN-AA和λN-L1-AA蛋白的细胞内水平。

体内蛋白质周转

通过阻断蛋白质合成并通过Western blotting测量蛋白质的消失，直接检测野生型和蛋白酶缺乏菌株中λN-AA或λN-L1-AA的降解。生长表达λN-AA或λN-L1-AA的转化细胞，通过添加IPTG诱导30分钟，并用大观霉素处理以阻止进一步的蛋白质合成。在随后的培养过程中取出样品，并通过Western blotting检测剩余的λN-AA或λN-L1-AA水平。图​图3A三A显示野生型细胞中λN-AA周转的Western blot，其中半衰期<10 minclpP公司半衰期超过1小时的突变细胞clpP公司宿主突变，结果与免疫实验一致。在平行实验中，λN-DD蛋白在野生型或clpP公司应变（未显示数据）。以前在不同的野生型菌株背景中已经证明λN-AA的快速转换和λN-DD的缓慢转换(Keiler等人，1996年).

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图3

 λN-AA和λN-L1-AA体内Clp-依赖性周转(A类)野生型（SG22163）或clpP公司大观霉素阻断蛋白质合成后的突变细胞（SG22175）。细胞在32°C下生长至中对数期，并在添加大观霉素之前用IPTG诱导30分钟。在所示时间将样品移入冷TCA中，沉淀并重新悬浮在15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。用抗λ-阻遏物抗体对凝胶进行印迹和探测。(B类)野生型和clp公司突变体。实验条件与A类除了使用10%-20%的三辛SDS-聚丙烯酰胺凝胶外，使用M2抗FLAG抗体进行Western blot检测，并使用鹰眼II凝胶成像系统进行定量。曲线和应变标记如图所示。​图22.

图​图3B三B显示了一组等基因中λN-L1-AA降解的时间过程clp公司突变体。正如免疫结果所预期的那样，在含有功能性ClpAP和ClpXP的野生型菌株中，λN-L1-AA的降解速度最快。在ClpA缺陷菌株中观察到半衰期略有增加，而在缺乏ClpP、ClpA和ClpX或ClpX的菌株中，半衰期相对较长。我们注意到，在不同的实验中clpX公司突变宿主有点可变，通常表现出比图中观察到的更少的稳定性​图3B；三B类；我们目前对这种变异性没有任何解释。中的突变离子、clpB、hflA，或fhflB型在这些实验条件下，对λN-L1-AA周转没有可检测的影响（数据未显示）。因此，λN-AA和λN-L1-AA蛋白的高周转率与免疫测试完全一致。更重要的是，周转实验表明，ClpAP缺陷株或ClpXP-缺陷株中噬菌体免疫性的增强以及λN-AA和λN-L1-AA稳态水平的增加主要是由于降解速率的降低。

体外蛋白质降解

为了直接测试Clp蛋白酶对SsrA标记的蛋白质的降解，³⁵纯化S标记的λN-L1-AA和λN-L 1-DD，并与纯化的ClpAP或ClpXP孵育。如图所示​图4A，4A、 这两种Clp蛋白酶都能有效降解SsrA-taggedλN-L1-AA蛋白，但降解对照标记的λN-L1-DD蛋白的速率仅为λN-L2-AA的5%至10%（图。​（图4A）。4A） ●●●●。降解需要ClpP和ClpX或ClpA，在任何情况下都需要ATP（未显示数据）。这些结果表明，ClpXP和ClpAP都可以通过羧基末端SsrA降解肽降解蛋白质。

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图4

 ClpAP和ClpXP对SsrA标记底物的体外降解。(A类)已净化³⁵S标记的λN-L1-AA或λN-L.1-DD蛋白与纯化的ClpAP或ClpXP在30°C的ATP存在下孵育，如材料和方法中所述。显示了TCA可溶计数的时间依赖性释放。(B类)³⁵使用与答：。(C类)通过圆二色性变化监测的λN-L1-AA和λN-L.1-DD蛋白的变性在热稳定性方面没有差异。归一化CD椭圆度计算为（ε₂₅−ε)/(ε₂₅-ε93）式中，e是各温度下230 nm处的椭圆度，ε₂₅和ε₉₃分别是25°C和93°C下230 nm处的椭圆度。

如图所示​图4B，4B、 λN-L1-AA和λN-L2-DD对糜蛋白酶（一种相对非特异性蛋白酶）的降解同样敏感(Benyon and Bond 1989年)，表明SsrA标签不会增加其所附蛋白质的一般蛋白酶敏感性。纯化后的λN-L1-AA和λN-L2-DD在热变性实验中也具有重叠的CD光谱（数据未显示）和相同的熔融轮廓，通过圆二色性的变化进行监测（图。​（图4C）。4C） 。这些数据表明，λN-L1-AA对ClpXP和ClpAP降解的敏感性不是由该标记蛋白的结构或稳定性的重大变化引起的。总之，这些结果支持SsrA标签被ClpXP或ClpAP直接识别的模型，并与标签破坏底物稳定性的模型相抗争，使蛋白酶能够识别变性状态下暴露的氨基酸序列。

体内SsrA标记后的降解

上述实验使用氨基末端结构域变体，其中SsrA肽标签由λN-AA或λN-L1-AA蛋白质的基因编码。使用λN–trpAt系统Keiler等人（1996年），我们还检测了通过SsrA介导的标记系统共翻译添加羧基末端降解肽的蛋白质在体内的周转。如图所示​图1，1，λN–trpAt的基因编码来自trpAt公司转录终止子。在这个序列中没有翻译终止密码子。因此，当阅读此信息时，翻译会停止，不会终止并释放生长的多肽。Keiler等人（1996年）证明在这些情况下，SsrA在标记中具有重要作用，并允许停滞多肽的释放。λN-L2-AA和λN-L2-DD蛋白质包含来自trpAt终止区的相同氨基酸，但与λN–trpAt不同，其SsrA标签或控制标签编码在基因中（图。​（图1），1)，因此与SsrA无关。

λN–trpAt和λN-L2-AA的周转试验如图所示​图5。5λN–trpAt蛋白，用固态继电器A突变体，在凝胶中迁移更快（正如未标记蛋白质所预期的那样），并且在蛋白水解方面是稳定的（图。​（图5A；5A；另请参阅Keiler等人，1996年). 在固态继电器A⁺宿主，只有大约一半的λN–trpAt蛋白被标记，但该物种在clpP公司⁺拉伤，半衰期更长clpP公司⁻突变体（图。​（图5A）。5A） ●●●●。中较短的λN–trpAt蛋白固态继电器A⁺根据电泳迁移率，宿主似乎没有标记，并且比标记的蛋白质寿命更长。λN-L2-AA与标记的λN–trpAt具有基本相同的序列，于年被迅速翻转clpP公司⁺并在clpP中显著稳定⁻突变体（图。​（图5B）。5B） ●●●●。这些结果表明，SsrA-标记的λN–trpAt和λN-L2-AA在clpP公司-依赖时尚。然而，我们注意到，SsrA-标记的λN–trpAt在这两种情况下的降解速度都快于λN-L2-AAclpP公司⁺和clpP公司⁻应变（图。​（图5C），5C） 表明λN–trpAt的共翻译、SsrA依赖性标记可能导致标记的蛋白质除了作为ClpAP和ClpXP的底物外，还暴露于其他蛋白酶或对其他蛋白酶更敏感。

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图5

 体内λN-trpAt和λN-L2-AA的降解。(A类)年大观霉素治疗后λN–trpAt转换的蛋白质印迹固态继电器A⁺ clp公司⁺（SG22163），固态继电器A⁺ clpP:：kan（SG22175），固态继电器A：：猫clp公司⁺（SG22183）和ssrA:：猫clpP:：kan（SG22184）菌株。注意，在固态继电器A⁺菌株。标有星号的车道是来自固态继电器A⁻宿主在与相同的凝胶上运行固态继电器A⁺用于比较电泳迁移率的样品。实验程序如图所示。​图3；三; 使用10%-20%梯度三嗪凝胶（Novex）进行电泳。(B类)λN-L2-AA营业额的Western blots。应变和条件与答：。在对照实验中，野生型菌株（SG22163）中表达的λN-L2-DD在1小时内没有明显的转换（数据未显示）。(C类)SsrA-标记的λN–trpAt蛋白降解的时间进程（A类)和λN-L2-AA英寸固态继电器A⁺ clp公司⁺（SG22163）和固态继电器A⁺ clpP:：kan（SG22175）菌株。这些数据是通过扫描如图所示的凝胶获得的A类和B。

体内稳态表达和降解

通过测量对重叠感染λ噬菌体的免疫力，对反映这些蛋白质合成和降解速率之间平衡的不同氨基末端结构域变体的细胞内水平进行了检测。含有高水平λ阻遏物氨基末端结构域的细胞是免疫的，而那些含有低水平的细胞对噬菌体感染敏感。在含有维生素B1、麦芽糖、0.01米硫酸镁₄和氨苄西林（100μg/ml）在32°C至后期对数阶段。将细胞草坪置于LB或LB-Amp平板上的顶部琼脂中，用λ的稀释液点缀c（c）我⁻, λc（c）17, λvir，和λ国际货币基金组织21c（c）I噬菌体，并在32°C下培养，除非另有说明。据报道，电镀效率与仅含载体或不含质粒的细胞的生长有关；两个对照菌株给出了相同的结果。这个国际货币基金组织21c（c）噬菌体在所有宿主上的效率为1.0。λ病毒，根据其对正常λ溶原的粘附能力被定义为具有毒性，可粘附于所有宿主，尽管在某些情况下，eop较低或斑块较小。λc（c）我⁻是我们测试抗扰度的标准；它不能固定在正常的λ溶原上。λc（c）17是一个弱清晰突变体，之所以在这里使用，是因为它对λ阻遏物氨基末端结构域的中间水平敏感。λc（c）17携带野生型c（c）I基因，但在右操纵子中有9 bp的重复，这创造了一个新的、组成性表达的右启动子，允许λ复制蛋白的合成，并导致阻遏物的复制和滴定(Sly和Rabideau 1969年;Rosenberg等人，1978年). 在这些测试中，λc17很可能是一个弱清晰突变，因为即使细胞内存在较低水平的内源性抑制，P_远程管理将导致野生型的合成c（c）I（稳定且能够寡聚）来自c（c）17噬菌体，阻止噬菌体进一步生长和释放噬菌体爆发。

添加大观霉素阻止蛋白质合成后，通过Western blotting检测氨基末端结构域变体在体内的降解。细胞在32°C的胰蛋白酶肉汤加氨苄西林（100μg/ml）中生长至A类₆₀₀0.3，用IPTG诱导30分钟（最终浓度0.02%）。去除零时间样品，并将大观霉素添加至最终浓度100μg/ml，以阻止进一步的蛋白质合成。定期将1ml样品移入装有110μl 50%TCA的试管中。离心后，用80%丙酮清洗颗粒，干燥，并在三辛凝胶加载缓冲液中重新悬浮。等量的蛋白质提取物在15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶或10%–20%三嗪-十二烷基磺酸钠-聚丙烯腈凝胶（见图图例）上分离，并转移至硝化纤维过滤器。过滤器与多克隆抗λ-阻遏物抗体、Jeffrey Roberts（纽约州伊萨卡市康奈尔大学）的礼物或M2单克隆抗FLAG抗体（伊士曼柯达）一起培养。使用HPR-结合的山羊抗兔或抗鼠抗体开发免疫印迹，然后使用增强化学发光（Amersham）。通过鹰眼II凝胶成像仪（Stratagene）扫描胶片对斑点进行定量。

净化³⁵S标记底物蛋白

λN-L1-AA和λN-L1-DD蛋白在大肠杆菌用pER130或pER132转化的菌株X90。细胞在37°C的M9最小培养基中生长至中对数期，该培养基缺乏半胱氨酸和蛋氨酸，通过添加异丙基-1-硫代-β诱导蛋白表达-d日-吡喃半乳糖苷200μg/ml。诱导20分钟后[³⁵S] 添加蛋氨酸（40μCi/ml培养基）。37°C下1小时后，通过离心收集细胞，并在−80°C下冷冻。冷冻细胞解冻，重新悬浮在缓冲液A[6米盐酸胍，0.1米不₂人事军官₄, 0.01米Tris（pH 8.0）]，含10m米咪唑（40μl/ml培养基），在4°C下摇晃1小时，使其溶解。在此之后，在20000下离心去除细胞碎片克，添加Ni–NTA琼脂糖（Qiagen）（75μl/ml上清液），将样品放在摇杆上15分钟。用含有10 m的缓冲液a清洗树脂三次米咪唑和λN-L1-AA或λN-L.1-DD蛋白用含有400 m的缓冲液A洗脱米咪唑。对样品进行透析，以对抗三次含有50 m缓冲液的变化米HEPES/NaOH（pH 7.5）和100 m米氯化钠。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯蓝染色检测，纯化蛋白纯度大于90%。

蛋白质

纯化ClpP和6个His-tagged ClpX是Igor Levchenko和Tania Baker（麻省理工学院，剑桥，马萨诸塞州）赠送的礼物；纯化的ClpA是Sue Wickner（NIH，Bethesda，MD）送的礼物。TLCK处理的牛胰腺α-糜蛋白酶（60 U/mg蛋白质）购自Sigma。根据Qiagen方案，通过变性镍NTA色谱纯化未标记的λN-L1-AA或λN-L2-DD，并进行少量修改。

体外蛋白质水解试验

在含有25 m的缓冲液中以20μl的总体积进行蛋白质水解消化米HEPES/NaOH（pH 7.5），25 m米醋酸钾，5 m米氯化镁₂10%甘油和0.02%NP-40。完整的ClpAP或ClpXP消化液也含有5 m米ATP，0.1 mg/ml肌酸激酶，10 m米磷酸肌酸，10摩尔³⁵S标记蛋白底物（λN-L1-AA或λN-L2-DD）、3.5 pmoles的ClpP亚基和3 pmoles ClpA或3.5 pmole的ClpX亚基。完整的糜蛋白酶消化物包含10个蛋白底物和200 ngα-糜蛋白酶。消化液在30°C下培养不同时间，通过添加10%的TCA停止反应，并将试管置于冰上。至少30分钟后，样品在20000下离心10分钟克和4°C，通过Ready-Safe液体闪烁鸡尾酒（Beckman）中的闪烁计数测定TCA可溶性计数。缺少ClpX或ClpA、ClpP或ATP的对照2小时消化物的平均值为总量的3%–4%³⁵TCA沉淀后上清液中的S计数。从含有ClpAP/ATP或ClpXP/ATP的完全消化样品中减去这些平均值作为背景。

我们感谢Ken Keiler和Patrick Waller提供的菌株和质粒；Igor Levchenko、Tania Baker和Sue Wickner用于纯化蛋白质；针对λ阻遏物抗体的Jeffrey Roberts；C.赫尔曼（C.Hermann）和R.D'Ari（R.D'Ari），针对菌株和未发表结果的交流；以及Tania Baker和Michael Maurizi对手稿进行了有益的讨论和评论。这项工作得到了国家癌症研究所内部项目和国家卫生研究院AI-16897赠款的部分支持。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。