裂变酵母SPB组分Cut12将双极纺锤体的形成与有丝分裂控制联系起来

切割的克隆和序列分析12⁺基因

杂合子的构建剪切12⁺/切割12.1二倍体表明切割12.1是隐性突变（数据未显示）。这个剪切12⁺因此，该基因是通过补充温度敏感缺陷而克隆的（图。​（图2a）。2a） ●●●●。这个剪切12⁺该基因编码一个62kD的548氨基酸蛋白质，与已知蛋白质没有整体同源性（图。​（图2b）。2b） ●●●●。该蛋白具有相对亲水性和碱性（pI为9.4）。根据Lupas等人（1991年）氨基酸61-64代表p34的潜在磷酸化靶点^cdc2激酶（TPLK；Nigg 1993年)也与两个提议的MPM2激酶共识位点（LTPLK；Westendorf等人，1994年). 还鉴定了氨基酸73-76（LKTP）和516-519（LKSP）的两个潜在MAP激酶磷酸化位点(Nigg 1993年). 这个剖面图12.1突变是密码子536的第一个核苷酸（CGA到TGA）中的一个单碱基变化，预计会产生缺失蛋白质羧基末端13个氨基酸的Cut12截短型。由于形成稳定的螺旋所需的最小长度被认为是28个氨基酸(Lupas等人，1991年)，的切割12.1据预测，等位基因编码的蛋白质在羧基末端缺乏螺旋结构域（图。​（图2c）。2c） ●●●●。

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图2

 克隆和分子分析剪切12⁺基因。(一)约束映射和互补分析剪切12⁺包含通过补体分离的克隆切割12.1突变体，以及由重叠的2.8kb区域产生的亚克隆切割12.1互补质粒。(b条)核苷酸和预测的氨基酸序列剪切12⁺基因。这个剪切12⁺该基因包含两个由7和1637个核苷酸组成的外显子，它们共同编码一个预测为62kD的548个氨基酸蛋白。这两个外显子由一个42 bp的内含子分开；一致内含子剪接和分支序列用斜体下划线显示。预测Cut12蛋白的两个区域会形成卷曲线圈，下面画了下划线。潜在p34^cdc2和MAP激酶共识位点以黑体字表示。（G+）标准1.1甘氨酸71突变。GenBank的登录号剪切12⁺序列是{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“Y16837”，“term_id”：“3288626”，“term_text”：“X16837”}}16837日元. (c（c）)通过应用Lupas等人（1991年）具有28个氨基酸窗口。(d日)Cut12蛋白主要特征的示意图。（+）第34页^cdc2激酶共有位点；（星形）MAP激酶共识位点；（阴影区域）螺旋线圈的预测区域。

切口12⁺基因缺失导致纺锤体缺陷和切割分裂

单极轴的形成切割12.1突变可能是由于存在足够的Cut12活性而导致激活两个SPB中的一个。因此，我们检查了Cut12蛋白完全丢失的影响。一份剪切12⁺通过替换二倍体之间的所有编码区，该基因被删除Ppu10I公司现场（图。​（图2b）2b） 使用ura4型⁺的序列S.pombe，因此，删除所有保留基因的前32个核苷酸和基因下游的额外41个核苷酸。四分体分析表明剪切12⁺该基因对于在20°C至36°C的所有测试温度下的生存能力至关重要（数据未显示）。

由缺失引起的细胞表型剪切12⁺通过孢子萌发进行检测（图。​（图3a-c）。三a–c）。萌发Ura⁺孢子进入有丝分裂期，分解细胞质微管，浓缩染色体。然而切割12.d1孢子形成缺陷的有丝分裂纺锤体，其中微管与两个同等强度的Sad1病灶均无关联。纺锤体微管起源的位置由图中三个细胞中的每个细胞中的箭头指示​图3c，三c、 显然与Sad1染色病灶的位置无关。

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图3

 为删除的单元中的缺陷主轴形成剪切12⁺基因和细胞过度表达剪切12⁺. (a–c)纺锤形成缺陷和萌发中的切割分裂切割12.d1孢子。单倍体孢子由剪切12⁺/切割12.d1二倍体在30°C缺乏尿嘧啶的最低培养基中萌发，接种后12至22小时进行免疫荧光处理。所示为接种16小时后固定的三个细胞。(A类)相位/DAPI显示细胞轮廓和染色质；(B类)抗微管蛋白染色；(C类)抗Sad1染色。发芽切割12.d1孢子似乎含有两个Sad1染色病灶，尽管微管从两个病灶的远端位置产生，这三个细胞中的每个细胞都有箭头指示。细胞也经历了切分区（单元格3）。比例尺，10μm。(d–i日)质粒载体关闭后单极纺锤体形成和切割分裂剪切12⁺中的表达式切割12.d1单倍体细胞。一种文化切割12.d1通过表达质粒携带的剪切12⁺减毒硫胺素可阻遏物的cDNAnmt1（纳米1）⁺启动子在30°C无硫胺的最小培养基中生长到对数相。然后将等分样品接种到无硫胺素培养基中，以继续表达剪切12⁺第二等分接种到含有硫胺的培养基中以抑制剪切12⁺表达式。14至28小时后对样品进行免疫荧光处理。(d、 f、h)剪切12⁺表达；(e、 g、i)剪切12⁺压抑。(d、 e（电子）)Phase/DAPI显示细胞轮廓和染色质染色；(f、 克)抗微管蛋白染色；(h、 我)抗Sad1染色。抑制后约14小时细胞内形成缺陷纺锤体剪切12⁺单极纺锤波仅来自两个Sad1病灶（细胞1和细胞2）中的一个，类似于ts切口12.1突变，发生切割分裂（细胞3）。比例尺，10μm。(j–l)过度表达细胞的免疫荧光分析剪切12⁺.携带剪切12⁺与野生型连接的cDNAnmt1（纳米1）⁺将pREP1质粒的启动子培养到中对数期，将培养物分为两部分剪切12⁺表达被取消了一半。诱导后12至20小时内，每小时取样一次。所示为单元格，其中剪切12⁺减压16小时(j个)相位对比/DAPI染色；(k个)抗微管蛋白染色；(我)抗Sad1染色。细胞过度表达剪切12⁺该基因形成了单极纺锤波，似乎是由细胞内可见的Sad1染色单焦点引起的。其中的单元格剪切12⁺表达受到抑制，形成正常的双极纺锤体（未显示）。比例尺，10μm。

我们还检测了培养基中Cut12蛋白缺失的影响切割12.d1单倍体，其中细胞通过表达剪切12⁺来自pREP81质粒的cDNA。pREP81质粒携带一种减毒的硫胺素可阻遏物nmt1（纳米1）⁺发起人(Basi等人，1993年;Maundrell 1993年). 镇压剪切12⁺通过添加2μ米硫胺素导致缺陷单极纺锤体的形成，与ts切口12.1突变体，微管起源于两个Sad1染色病灶中强度较低的部位（图。​（图3e、g、i）。三e、 g，i）。对照组培养物表达剪切12⁺，双极纺锤形成正常（图。​（图3d、f、h）。三d、 f、h）。形成缺陷纺锤体并经历缺陷切割分裂的细胞相对于其中的细胞被拉长剪切12⁺表达没有受到抑制（平均细胞长度13.5μms.e.m.公司。0.2微米；和12.4μm，s.e.m.公司。分别为0.1μm；n个=50). 因此，由于SPB复制和/或激活或成熟的缺陷，在没有Cut12蛋白的情况下形成的纺锤是单极的，无法支持染色体分离。

剪切12⁺过度表达干扰双极纺锤体的形成

双极纺锤体形成和胞质分裂在剪切12⁺来自野生型的表达式nmt1（纳米1）⁺发起人(Maundrell 1993年)被抑制（数据未显示），而在去抑制时，由Sad1染色单焦点引起的V型纺锤波累积（图。​（图3j–l）。三j–l）。驱动蛋白相关基因的突变也有类似的表型剪切7⁺(Hagan和Yanagida 1990年)和S.pombe公司Plk由plo1型⁺基因(Ohkura等人，1995年)可能是由于SPB复制缺陷或细胞无法将平行微管阵列解析为双极纺锤体所致。形成单极纺锤体的细胞相对于其中的细胞被拉长剪切12⁺表达受到抑制（14.1μm，s.e.m.公司。0.2微米与13.5微米，s.e.m.公司。分别为0.1μm；n个=50).

Cut12是SPB组件

采取了几种方法来定位Cut12蛋白。针对与GST融合的Cut12蛋白的33至548个氨基酸，制备了两种多克隆兔抗血清。来自这些血清的亲和纯化抗体不能识别从发芽制备的蛋白质提取物中的任何条带剪切12⁺缺失孢子（图。​（图4a，4a、 但通过野生型的免疫印迹识别出一条～62-kD的单条带S.pombe公司摘录（图。​（图4a，4a、 车道2）。a的过度表达剪切12⁺野生型cDNAnmt1（纳米1）⁺启动子导致该条带的强度增加（图。​（图4a，4a、 车道3），而替换野生型剪切12⁺带有GFP标记版本的基因导致分子量增加至～90 kD（图。​（图4a，4a、 车道4）。我们得出结论，p62是剪切12⁺基因。

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图4

 抗Cut12抗体的鉴定和Cut12的免疫荧光定位。(一)使用针对与GST融合的Cut12蛋白的氨基酸33-548的亲和纯化兔抗体来探测来自切割12.d1单元格(1)，野生型细胞(2)，过表达全长的细胞剪切12⁺cDNA来自nmt1（纳米1）⁺发起人(三)，或包含野生类型的单元格剪切12⁺该基因已被一个带有GFP标签的基因替换，该基因插入剪切12⁺顺序(4)从而导致Cut12蛋白的预测分子量从62 kD转移到89 kD。(b条)Cut12蛋白在细胞周期中的免疫定位。野生型裂变酵母细胞生长到对数中期，进行免疫荧光处理，并用抗Cut12和抗Tubin抗体染色。(顶部)DAPI显示的细胞轮廓和染色质位置；(中间的)抗微管蛋白染色；(底部)抗Cut12染色。（I） 相间；（P） 前期；（M） 中期；（AA）后期A；（AB）后期B；（PAA）后期数组。间期细胞中含有一个与间期染色质相关的抗Cut12染色单点，而有丝分裂细胞中的抗Cut12染色局限于纺锤体极。比例尺，10μm。

用抗Cut12和抗管蛋白抗体对指数增长的野生型细胞进行染色。抗Cut12染色的单个斑点与间期染色质有关，而在有丝分裂细胞中，有丝分裂纺锤体两极有两个离散斑点，与Cut12定位于SPB一致（图。​（图4b）。4b） ●●●●。这些斑点的强度在整个细胞周期中没有变化。

与免疫定位数据有关的一个问题是，固定样本中抗体的特异性可能不同于通过Western blot分析观察到的特异性，因此我们使用了两种额外的方法来定位Cut12蛋白。在第一种方法中，野生型剪切12⁺该基因被替换为带有绿色荧光蛋白（GFP）cDNA的版本维多利亚多管发光水母插入蛋氨酸33（图。​（图5a）。5a） ●●●●。这些细胞是活的，并形成正常纺锤体，尽管具有后期阵列（PAAs）的细胞的频率大约是野生型对照型细胞的两倍（未显示）。每个细胞可见一个或两个明显的GFP荧光点（图。​（图5b–e）。5b–e）。用针对Sad1蛋白的抗体染色证实GFP和Sad1信号是一致的（图。​（图5f–h）。5f–h）。在整个细胞周期中没有检测到GFP信号强度的变化。

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图5

 使用GFP定位Cut12蛋白。(一). 野生型剪切12⁺通过与含有GFP蛋白5′区的质粒进行同源重组，将该基因替换为含有GFP蛋白质的版本剪切12⁺该基因在蛋氨酸33处用GFP cDNA标记。(b–e类). 野生型细胞和带有GFP标记的细胞剪切12⁺从培养物中取出基因并用相差显微镜检查(b、 天)以及使用标准FITC过滤器的荧光显微镜，以显示GFP荧光(c、 e（电子）). (b、 c（c）)野生型细胞；(d、 e（电子）)剪切12-GFP标记单元格。携带整合GFP标记的细胞剪切12⁺该基因含有野生型细胞中不存在的一个或两个GFP荧光点。比例尺，10μm。(f–h). 携带整合GFP标记的细胞剪切12⁺进行免疫荧光处理，并用抗Sad1抗体染色。(（f）)DAPI显示细胞轮廓和染色质；(克)Sad1本地化；(小时)GFP-Cut12本地化。GFP–Cut12和Sad1信号在间期和有丝分裂细胞中共存。比例尺，10μm。

最后，野生型剪切12⁺该基因被替换为带有两个Pk表位标签拷贝的基因(Hanke等人，1992年)蛋氨酸33(S.pombe公司菌株IH744）。用抗Pk和抗Sad1抗体对细胞进行染色，证实Pk和Sad1信号在整个细胞周期中是一致的（数据未显示）。通过冷休克对微管的解聚表明，通过所有三种程序判断，Cut12在SPB上的定位与微管完整性无关，表明Cut12是真正的SPB成分（数据未显示）。

Cut12蛋白定位于SPB内表面的边缘

Cut12蛋白通过同时免疫金染色定位S.pombe公司带有抗Pk表位标签单克隆抗体（5纳米金）和多克隆抗Cut12抗体（10纳米金）的菌株IH744。这两种探针都特异性地定位于间期SPB细胞质体表面的外围（图。​（图6a）。6a） ●●●●。在图中​图6b–f，6b–f，显示了金粒子通过单个相间SPB在五个系列截面中的相对位置；这五个部分的注释特征叠加在图中​图6g。6g.虽然Cut12表位均匀分布在膜附近的SPB表面，但Pk表位仅局限于一侧。

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图6

 SPB内Cut12蛋白的电镜定位。(一)通过使用Pk表位标签抗体和多克隆抗Cut12抗体对SPB切片进行免疫金染色。次级抗体与5nm（Pk）和10nm（Cut12）的金颗粒结合。（S） 主轴极体；（M） 与SPB横向相关的细胞质微管；（N） 核膜。Cut12表位特异性地定位于靠近核膜的细胞质SPB主体的内表面。Pk表位标签似乎更多地定位于SPB内表面的一侧。(b–f)通过单个SPB的五个串行段，如所示一用Pk表位标签抗体和Cut12蛋白多克隆抗体染色。次级抗体与5nm（Pk）和10nm（Cut12）的金颗粒结合。(克)通过标记的Pk表位中的单个SPB在连续切片中对Cut12表位进行免疫金定位剪切12⁺应变。中所示的五个系列部分b–f被叠加。（绿点）10纳米金颗粒（抗切割12）；（蓝点）5nm金颗粒（抗-Pk）；（黄线）核膜；（红线）SPB；（蓝线）细胞质微管。

切口12⁺基因座与stf1.1具有等位基因

的数据库比较剪切12⁺核苷酸序列显示，该基因下游450–588个核苷酸的同源性为100%剪切12⁺带1–139个核苷酸的终止密码子全球技术合作伙伴1⁺编码假定GTP结合蛋白的基因(哈德逊和杨1993). 这个全球技术合作伙伴1⁺该基因位于有丝分裂控制基因的下游（449个核苷酸），因此被克隆stf1型⁺(Hudson等人，1990年;Hudson和Young 1993年).

这个cdc25⁺的基因S.pombe公司编码激活p34的酪氨酸磷酸酶^cdc2/细胞周期蛋白B激酶₂通过催化p34的酪氨酸15上抑制性磷酸化的去除实现向M的转变^cdc2(罗素和护士1986;Dunphy和Kumagai 1991年;Gautier等人，1991年;Kumagai和Dunphy 1991年;Strausfeld等人，1991年). 缺乏Cdc25功能的突变体复制其DNA，但不能激活有丝分裂p34^cdc2/细胞周期蛋白B激酶，并在G₂具有微管间期阵列的细胞周期的时相(罗素和护士1986;Hagan和Hyams 1988).标准1.1是一种半显性突变，允许功能丧失突变cdc25⁺，包括cdc25⁺基因破坏，成功分裂(Hudson等人，1990年). 我们的发现切口12⁺和stf1型⁺似乎位于同一基因的上游，表明切口12⁺和stf1型⁺基因可能是相同的。

我们越过了cdc25.22突变体，其中剪切12⁺该位点标记有ura4型⁺带有a的基因cdc25.22第1.1页双突变体。在30个四分体中我们没有发现Ura⁺Cdc公司⁺孢子，对应于1.7℃以内的连锁米在Ura4之间⁺-已标记剪切12⁺轨迹和标准1.1轨迹。这个剪切12⁺基因从标准1.1菌株和PCR产物的整个ORF直接测序。我们确定了该基因第71密码子中的一个碱基变化（G–T）剪切12⁺四个独立PCR反应的序列，这将导致甘氨酸71被缬氨酸残基取代。尽管表达质粒剪切12⁺来自pREP81质粒的cDNA无法拯救ts cdc25.22缺陷，表示切割12.G71V突变体cDNA抑制cdc25.2230°C下的缺陷，但不在33°C或36°C下（图。​（图7b）。7b） ●●●●。此抑制级别与cdc25.22/cdc25.22 stf1⁺/stf1.1型二倍体，可在32°C以下存活(Hudson等人，1990年). 因此，剪切12⁺和stf1型⁺是等位基因，甘氨酸71在剪切12⁺可以抑制有丝分裂起始对Cdc25的需求。这个切割12.G71V突变不会改变野生型或野生型Cut12的免疫荧光定位模式cdc25.22背景温度为25°C或36°C（未显示数据）。

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图7

 这个切口12⁺和stf1型⁺基因是相同的。(一)的温度灵敏度cdc25.22和标准1.1单个突变体和acdc25.22第1.1页双突变体。将细胞在25°C、30°C、33°C和36°C的完整培养基上划线。这个标准1.1突变允许生长cdc25.22在所有四个测试温度下，在完整培养基上的突变体，尽管在36°C下，相对于野生型细胞，生长缓慢，且菌落大小不规则。(b条)抑制cdc25.22通过在剪切12⁺基因。cdc25.22携带不含插入物（全长野生型）pREP81质粒的突变细胞剪切12⁺cDNA或突变体切割12.G71VcDNA，在25°C、30°C、33°C和36°C的缺乏硫胺素的最低培养基上划线。尽管cdc25.22携带空白质粒或野生型的细胞切口12⁺该基因在30°C时无法形成菌落，cdc25.22携带切割12.G71V突变cDNA能够在30℃下生长，但不能在33℃下生长。这与cdc25.22/cdc25.22第1.1/stf1页⁺二倍体在33°C以下生长(Hudson等人，1990年).

stf1.1 cdc25.22突变体在高温下形成有丝分裂纺锤体缺陷

能力标准1.1绕过Cdc25的要求是不完整的。基因组突变标准1.1可以抑制cdc25.22以及删除cdc25⁺该基因仅在35°C以下，而在37°C下，两个双突变体都形成了包含异常分裂细胞的小菌落(Hudson等人，1990年). 为了确定更高温度下的致死基础，单个突变体标准1.1和cdc25.22，和双突变体stf1.1 cdc25.22，在25°C下生长并转移至37°C。换到37°C时，cdc25.22细胞通过间期微管和G的单核特征阻止细胞周期进程₂（图。​（图8a、d、g）8a、 d，g），而标准1.1细胞继续形成正常纺锤体并分裂（图。​（图8b、e、h）。8b、 e、h）。stf1.1 cdc25.22细胞分解了间期细胞骨架，浓缩了染色体，形成了异常的星形纺锤体，这些纺锤体起源于单个Sad1染色的大焦点（图。​（图8c、f、i）。8c、 f、i）。Sad1病灶扩大导致微管阵列中心出现特征性孔洞。因此，鉴于标准1.1突变可以在所有温度下绕过对Cdc25的需求，并允许在37°C下进行有丝分裂，即在细胞内形成的纺锤体标准1.1缺少Cdc25功能的突变体有缺陷。

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图8

 这个标准1.1突变体在cdc25.22背景。(a–i)免疫荧光分析cdc25.22和标准1.1单突变体和双突变体cdc25.22第1.1页。细胞在25°C的完全培养基至中对数期培养，然后转移至37°C，并进行免疫荧光分析。(a–c)相位/DAPI；(d–f日)抗微管蛋白染色；(g–i类)抗Sad1染色。(a、 天，克)cdc25.22；(e、 f、h)stf1.1；(c、 f、i)cdc25.22第1.1页。单曲cdc25.22具有G细胞间期骨架特征的突变株₂单元格，而标准1.1突变体继续形成正常的纺锤体并分裂。双突变体cdc25.22第1.1页由细胞内单个大的Sad1焦点产生的异常星形纺锤体。比例尺，10μm。

Cut12功能的丧失导致单极轴的形成

间期分裂酵母SPB由两个组分组成。SPB的主体位于细胞质中，通过核膜与有丝分裂纺锤体微管成核剂γ-微管蛋白分离(Ding等人，1997年). SPB的有丝分裂激活伴随着局部核膜破裂和这两种元素的结合。在缺乏Cut12功能的活跃分裂细胞中，Sad1定位与微管成核活性无关。这可能表明，在没有Cut12的情况下，有丝分裂SPB的这两个元件保持独立。

在图12.1，单极纺锤波起源于两个Sad1染色病灶中较弱的一个，而在萌发过程中切割12.d1孢子单极纺锤体与两个染色相同的Sad1病灶均无关。The differential effect of the剖面图12.1两个SPB上的突变表明Cut12以保守的方式并入重复的SPB，并且在温度变化之前并入细胞周期中SPB的Cut12蛋白稳定。复制SPB的差异行为也可以通过在两个后期SPB中的一个上激活胞质分裂调节GTPase Spg1来说明(Sohrmann等人，1998年). 由于两个SPB似乎是由一个较大的前体裂变为两个较小的结构而产生的(Ding等人，1997年)，两个子SPB之间的不等效性可能是由于生长期间SPB特定区域内的新材料局部掺入而产生的；裂变将导致生产一个成熟的和一个新的SPB。SPB内Cut12氨基末端表位暴露的明显不对称性支持了这种可能性。

cut12.G71V绕过了Cdc25的要求

第34页^cdc2激酶在T14和Y15残基上受到抑制性磷酸化作用，这些抑制性磷酸的去除决定了进入有丝分裂的时间(Gould and Nurse 1989年). 在裂变酵母中，这种抑制性磷酸化由Wee1激酶和冗余的Wee1同源物Mik1催化(罗素和护士1987年a;费瑟斯通和罗素1991;Lundgren等人，1991年;Parker等人，1993年;Lee等人，1994年;Den Haese等人，1995年). Wee1/Mik1激酶的作用与Cdc25磷酸酶相反(Fantes 1979年;罗素和护士1986)，在体外对T14和Y15进行脱磷(Dunphy和Kumagai 1991年;Gautier等人，1991年;Kumagai和Dunphy 1991;Strausfeld等人，1991年).

某些位点的细胞周期特异性磷酸化刺激Cdc25的活性(Ducommun等人，1990年;Moreno等人，1990年;Izumi等人，1992年;Kumagai和Dunphy 1992年;Hoffmann等人，1993年;Izumi和Maller 1993年). Wee1和Mik1激酶也受到细胞周期依赖性磷酸化的影响，据报道，磷酸化抑制了激酶的活性(罗素和护士1987b;科尔曼等人，1993年;Parker等人，1993年;Tang等人，1993年;吴和罗素1993;McGowan和Russell 1995年;Mueller等人，1995年;Watanabe等人，1995年). 因此，Cdc25和相反Wee1/Mik1激酶的磷酸化促进p34的激活^cdc2/细胞周期蛋白B和有丝分裂的开始。Nim1/Cdr1激酶的作用催化Wee1的磷酸化和抑制(科尔曼等人，1993年;Parker等人，1993年;吴和罗素1993)和其他不相关的激酶，包括MPM2表位激酶(Tang等人，1993年;Mueller等人，1995年). Cdc25的刺激性磷酸化可以通过p34在体外完成^cdc2/细胞周期蛋白B激酶(Hoffmann等人，1993年;Izumi和Maller 1993年)或按非34^cdc2包括MPM2表位激酶的激酶，如爪蟾Plx激酶(Kuang等人，1994年;Izumi和Maller 1995年;Kumagai和Dunphy，1996年). 生物化学研究爪蟾已经证明了p34正反馈回路的存在^cdc2和Cdc25，其中Cdc25可以去磷酸化并激活p34^cdc2/细胞周期蛋白B随后磷酸化并刺激Cdc25，进而进一步去磷酸化p34^cdc2/细胞周期蛋白B，导致少量MPF快速扩增并进入有丝分裂(Izumi和Maller 1993年;Hoffmann等人，1993年). 这个放大回路可能由p34触发^cdc2Cdc25的独立磷酸化和活化，或通过Wee1/Mik1的磷酸化和抑制。循环也可以通过生成一部分p34来触发^cdc2/不需要Cdc25激活或对Wee1/Mik1的抑制不敏感的细胞周期蛋白B。

在这种情况下，可以考虑一些模型来解释SPB成分中半显性突变绕过Cdc25要求的能力。Cut12不太可能单独规范Cdc25的活动，因为标准1.1可以抑制由于cdc25⁺基因(Hudson等人，1990年,1991). 削减12也不太可能只监管Wee1，因为标准1.1与相加凌晨1.50在抑制中cdc25.22并且对星期一⁺(Hudson等人，1990年). 然而，Cut12可能直接或间接地调节Wee1和Mik1的活动，或可能与Cdc25和Wee1/Mik1功能的双重调节器相互作用，这是为爪蟾Plx MPM2激酶(Kumagai和Dunphy，1996年;Lane and Nigg 1996年). 在这两种模型中，Cut12可能通过下调Wee1和Mik1来促进缺乏Cdc25功能的有丝分裂，从而缓解维持Cdc25的负性抑制cdc25.22G中的突变₂Cut12还可以通过促进p34的Y15去磷酸化来缓解这种抑制^cdc2另一种酪氨酸磷酸酶，如酪氨酸磷酸酯Pyp3(Miller等人，1992年). Pyp3与Cdc25无关，但可能与Cdc25协同作用，使p34的Y15去磷酸化^cdc2(Miller等人，1992年). 然而标准1.1突变不太可能通过增加Cdc25功能来绕过Cdc25功能的丧失第3页⁺活动，如第3页⁺功能似乎不会导致切割分割(Miller等人，1992年). 在更简单的模型中标准1.1可以形成p34^cdc2/SPB处的细胞周期蛋白B复合物不受Wee1/Mik1激酶的抑制。

切口的分离和排序12⁺基因

标准DNA操作按照Sambrook等人（1989）. The剪切12⁺通过对温度敏感突变体的互补，分离出该基因。从两个基因组的筛选中分离出14个携带5个互补质粒的转化子S.pombe公司图书馆（A.Carr博士的慷慨捐赠；Barbet等人，1993年). 这些质粒具有约2.8kb的重叠区域，包括最小互补2.0kb生态RV–私人股本II碎片。包含部分克隆DNA的质粒的整合ura4型⁺同源重组表明，克隆的区域含有剪切12⁺基因之间未观察到重组剖面图12.1和ura4型⁺在>1100个孢子中(护士1975). 1.0-kbHin公司dIII–生态RV和2.0-kbHin公司将完全覆盖该最小互补区的dIII片段克隆到Bluescript质粒中，分别生成pSCUT12-1和pSCUT12-2质粒，并使用核酸外切酶III进行嵌套删除。使用T7 DNA聚合酶手动双脱氧法对两条链进行DNA测序。通过使用引物（5′-TTCAGATCCGAATGAATGTCAG-3′）对从基于pREP1的cDNA文库（由英国牛津大学分子医学研究所ICRF分子肿瘤实验室约翰·拉德克利夫医院C.Norbury博士捐赠）中通过PCR扩增分离的克隆进行测序，证实了预测的42-bp内含子的存在和（5′-CCTTCCGTCTTCTCCTTTCCTAATC-3′）。这个切割12.1突变型剪切12⁺用5′-CGACTAATACGGCTTACAAGCC-3′和5′-CATGCAGAATATCAGACTCCG-3′两个引物进行PCR扩增，分离出该基因。PCR产物通过手动T7 DNA聚合酶程序直接测序。在发现突变的地方，通过四个独立的PCR反应再次对该基因的该区域进行测序。

构建切割12.d1删除

4-kb基因组Pst（磅/平方英尺）1–千磅我从最短的片段切割12.1互补基因组克隆克隆到Pst（磅/平方英尺）1–千磅I–消化pUC19生成质粒pDCUT12-1。1.6千字节Ppu公司10I片段包含所有剪切12⁺除前10个氨基酸外，编码序列从pDCUT12-1中删除，并替换为不是I链接器（GCGGCCGC）生成pDCUT12-2。1.8千字节Acc公司III片段包含ura4型⁺基因(Barbet等人，1993年)已插入链接器以生成pDCUT12-3。包含切口12⁺基因被删除ura4型⁺从pDCUT12-3中纯化基因并用于转化二倍体（h⁺/小时⁻ leu1-32/leu1-32 ura4-d18/ura4-d18 ade6-M210/ade6-M116). 稳定Ura⁺通过基因组Southern杂交选择具有所需替换的二倍体。使用2.0-kb进行探测Hin公司dIII片段包含剪切12⁺基因显示3.7kbBgl公司除了野生型中观察到的1.7kb和2.0kb条带外，缺失二倍体中还有II片段。

全长切口施工12⁺用于过度表达研究的cDNA

pREP1和pREP81用于表达剪切12⁺在硫胺素可抑制物质的控制下nmt1（纳米1）⁺发起人(Basi等人，1993年;Maundrell 1993年). 用于建造Nde公司启动子密码子处的I位点（CATATG），质粒pSCUT12-1用Nsi公司I.允许两个寡核苷酸（5′-ATATGTCAGAAACTTGAACACTCGCCAACC-3′）和（5′-TAGGTGGCGAGTTCAAAGTTTCTGACA-3′）退火，以生成插入到Nsi公司I位点，从而生成一个克隆，包含剪切12⁺带有两个拷贝的基因剪切12⁺起始密码子和前10个氨基酸，其中原始起始密码子后接内含子，新引入的第二起始密码子具有Nde公司我在ATG网站。原件Nde公司I位点位于剪切12⁺该程序还删除了编码序列。质粒命名为pSCUT12-1/M1Nde公司I.答Bgl公司II–生态来自pSCUT12-1/M1的RV片段Nde公司我被亚克隆回了4 kb的基因组剪切12⁺克隆。然后用Nde公司我和Pvu公司二、 产生2.2kb的全长片段剪切12⁺cDNA和基因的约300 bp 3′。这个Nde公司I–Pvu公司然后将II片段插入Nde公司I–Sma公司I消化pREP质粒。

构建带有GFP标签的切割集成版本12⁺基因

GFP标签插入Nde公司我的网站创建于切口12⁺顺序。使用引物5′-GCCTTTACACATATGTCCTTTAC-3′和由此产生的突变克隆（pSCUT12-1/M33），将pSCUT12-1质粒用作定点突变的模板Nde公司一） 在起始密码子和Hin公司dIII位点，以确认在诱变过程中没有引入错误。GFP cDNA作为Nde公司然后将I片段（准备中的R.Craven、D.Griffiths、K.Sheldrick、R.Randall、I.Hagan和A.Carr）插入该位置，得到pSCUT12-1/M33GFP。创建用于整合转化的质粒剪切12⁺-GFP进入基因组Hin公司dIII–生态然后将RV片段克隆到Hin公司dIII–生态RV–消化Bluescriptura4型⁺插入在不是我现场将形成pINTCUT12-1/M33GFP。

构建整合的Pk表位标记的cut12⁺基因

对于表位标记剪切12⁺我们使用了一个pREP42质粒（pREP42-PkN），该质粒携带三个Pk表位标签副本（氨基酸序列IPNPLLGLD；R.Craven、D.Griffiths、K.Sheldrick、R.Randall、I.Hagan和a.Carr，在准备中），作为Nde公司我在多克隆网站录制磁带。磁带还带有一个内部Nco公司我网站下面的第二份标签副本；因此，可以连接Nco公司I消化基因到带有pREP42质粒的Pk标签，然后通过Nde公司我消化。安Nco公司I站点已插入剪切12⁺使用引物5′-GCCTGTACAACCATGCCTCTTTAC-3′对pSCUT12-1质粒进行定点突变测序，并获得克隆（pSCUT12–1/M33Nco公司一） 在起始密码子和Hin公司dIII站点。A类Bgl公司II–生态将RV片段亚克隆回4-kb基因组剪切12⁺克隆pDCUT12-1形成pDCUT12–1/M33Nco公司I.然后用Nco公司我和Pvu公司二、 它产生了一个2.2kb的片段，带有截短形式的剪切12⁺编码氨基酸33–548的基因，以及插入pREP42-PkN的基因的约300 bp 3′。全长再生剪切12⁺pREP42-PkN载体中截短版本的基因因Nde公司I位于生态pDCUT12-1中的RV部位。为了避免这个问题，1.6-kbNsi公司我的碎片缺乏内在Nde公司I位点从pDCUT12–1/M33中切除Nde公司I并克隆到Bluescript质粒中，得到pDCUT12-4。标记截断的5′区域剪切12⁺然后通过以下方法从pREP42-PkN中分离出该基因Nde公司I–Bgl公司II消化，产生的0.5-kb片段连接到Nde公司I–Bgl公司II–消化的pDCUT12-4。这个Nsi公司然后将产生的质粒的I片段克隆回pDCUT12-1，从而产生全长的质粒剪切12⁺在甲硫氨酸33处插入两个拷贝的Pk表位标签的基因，称为pDCUT12–1/M33Pk。这个Hin公司dIII–生态然后将来自该质粒的RV片段克隆到Hin公司第II部分——生态RV–消化Bluescriptura4型⁺插入在不是我选址创建用于Pk标记的整合转化的质粒剪切12⁺进入基因组，称为pINTCUT12-1/M33Pk。

用PCR分离stf1.1突变位点并克隆PCR产物

这个标准1.1突变版本的剪切12⁺根据描述的方案，通过PCR扩增分离基因图12.1。要克隆stf1.1型突变基因，0.5kbNsi公司I–Bgl公司从PCR产物中纯化II片段并连接到Nsi公司I–Bgl公司II–消化的pSCUT12-1/M1Nde公司I.对产生的克隆进行手动测序，以确认是否存在标准1.1密码子71突变。要从这个变异的构造中重新创建全长克隆Bgl公司II–生态将RV片段亚克隆回4-kb基因组剪切12⁺克隆，从而再生全长标准1.1的突变版本剪切12⁺。然后使用Nde公司我和Pvu公司二、 产生2.2kb的全长片段切割12.G71VcDNA和基因的约300 bp 3′，克隆到Nde公司I–Sma公司I–消化pREP81。

GST-Cut12融合蛋白的构建及抗血清的制备

全长切口12⁺具有Nde公司M33的我被消化了Nde公司我和Pvu公司II，并克隆到质粒pGEX4T-3中。此构造已转换为大肠杆菌菌株BRL21表达GST–Cut12融合蛋白。细菌产生的蛋白质通过100 mÅ的电泳从聚丙烯酰胺凝胶中洗脱，并用磷酸盐缓冲盐水进行透析。第一次注射时，将150微克不溶性蛋白质悬浮液与完全弗氏佐剂混合，随后两次注射时将不完全弗氏辅助剂混合。抗血清和亲和纯化血清的制备如哈洛和莱恩（1988）用过氧化物酶结合的抗兔二级抗体进行Western blot检测。

荧光和免疫荧光显微镜

对于免疫荧光显微镜Hagan和Hyams（1988）被跟踪。亲和纯化的抗Sad1抗体AP9.2(Hagan和Yanagida 1995年)，抗微管蛋白抗体TAT1(Woods等人，1989年)和抗Pk标签抗体336(Hanke等人，1992年)前面已经描述过。为了改善用抗管蛋白和抗Cut12双重标记的细胞中微管的保存，将细胞与等体积的预热YES培养基和2.4混合米山梨醇在4%多聚甲醛中固定5分钟。为了观察GFP–Cut12蛋白，细胞在YES培养基中培养，在磷酸盐缓冲盐水中清洗一次，然后在盖玻片上干燥。使用蔡司FITC数据集10观察GFP融合。

我们感谢Paul Nurse提供S.pombe公司菌株，Keith Gull和Rick Randall分别检测TAT1和336抗Pk抗体，Tony Carr和Chris Norbury提供S.pombe公司基因组和cDNA文库，以及David Mastronardre的Cut12免疫电镜定位图像。我们还感谢Tony Carr、Paul Clarke、Dick McIntosh、Paul Nurse、Viesturs Simanis和Marc Sohrmann对手稿的积极讨论和批评性阅读。这项工作得到了癌症研究运动对I.H.的资助，国家卫生研究院对M.M.的资助为GM33787和RR00592，英国文化委员会对英国-日本细胞周期小组对曼彻斯特R.B.成像设施的资助也得到了威康信托基金的资助。

这篇文章的出版费用部分是通过支付版面费来支付的。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。