TRAF6缺乏导致骨质疏松症和白细胞介素-1、CD40和LPS信号缺陷

TRAF6是围产期和产后生存所必需的

当对杂合子杂交的前327只活幼崽进行检测时，只有11%的幼崽被基因分型为TRAF6^−/−（表​（表1）。1). 然而，TRAF6的正常孟德尔比率^−/−受孕后第14.5天到第17.5天检查的胚胎中突变体占优势（表​（表1）。1). 可行TRAF6^−/−小鼠出生时表现正常，但未能正常生长，并过早死亡。少数TRAF6^−/−存活>2周的小鼠体重和长度均出现20%-30%的缺陷（未显示）。虽然突变的心脏和肝脏适度增大（1.3倍），但脾脏比对照窝友大2-6倍。变压器6^−/−小鼠还表现出中度正常细胞性、低色素性贫血（未显示）。

TRAF6缺陷小鼠具有骨石化症

令人惊讶的表型发现是TRAF6^−/−小鼠为岩骨症。TRAF6的射线照相分析^−/−小鼠的长骨和椎体都没有放射性物质。由于骨骼建模失败，长骨，尤其是股骨，长度缩短，末端明显加宽（图。​（图2A，2A、 箭头）。所有TRAF6的臼齿和切牙^−/−被检查的老鼠没有爆发（图。​（图2A，2A、 箭头），这是骨质疏松症的典型表现，因为骨吸收需要通过颌骨为牙齿萌生开辟一条通道。胫骨近端干骺端的外周定量计算机断层扫描（pQCT）测量显示总抬高[266±18 mg/cm^三（TRAF6^−/−,n个 = 6） 与234±7 mg/cm相比^三（TRAF6^+/−,n个 = 4） ]和小梁（269±24 vs.200±23 mg/cm^三)骨密度。股骨干的骨髓间隙主要由骨小梁和大量肥大的软骨填充（图。​（图2B），2B） 也是骨质疏松和骨吸收失败的特征。与长骨相比，通过膜内形成形成的骨骼，如颅骨，在TRAF6中的X线表现正常^−/−老鼠。血清生化分析显示，与对照窝友相比，钙水平正常，但磷酸盐水平降低（数据未显示）。

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图2

TRAP存在下的严重骨质疏松症⁺TRAF6中的破骨细胞^−/−老鼠。(A类)对一只4周龄TRAF6基因敲除小鼠（−/−）和一只野生型同窝小鼠（+/+）的骨密度进行X射线分析。对两组小鼠的骨骼进行了完整扫描，包括其股骨、胫骨/腓骨和面部区域。注意TRAF6中总骨密度的增加^−/−小鼠，其长骨缩短，干骺端扩大（箭头所示），以及口腔中没有门牙和臼齿（箭头所指）。扁骨的骨骼结构和形态发生似乎正常。(B类)H&E染色显示骨组织学变化。TRAF6中的股骨干^−/−老鼠体内充满了软骨和骨头。有一些证据表明骨膜骨模型发生在生长板附近。放大倍数，4倍。(C类)TRAP染色。存在多核TRAP⁺TRAF6中的破骨细胞（箭头）^−/−老鼠。大多数TRAF6^−/−破骨细胞从骨表面撤回，而野生型小鼠的破骨细胞附着在骨上。放大60倍。(D类)TRAP的数量⁺破骨细胞/mm²TRAF6中的组织面积^−/−，交通6^+/−和TRAF6^+/+老鼠是可比的。

TRAF6破骨细胞检查^−/−小鼠表明，野生型、杂合型和敲除型小鼠每平方毫米组织面积内抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性细胞的数量相当（图。​（图2D）。2D） ●●●●。有趣的是，TRAP⁺变压器6^−/−破骨细胞与骨表面缺乏接触（图。​（图2C，2C、 箭头）。电子显微镜证实了这一观察结果，显示大多数TRAF6^−/−破骨细胞从骨表面取出（图。​（图3，三，参见A和B）。一些细胞似乎形成了类似于附着区的结构（图。​（图3C，三C、 星号）和杂乱的折边（图。​（图3C，三C、 大箭头），导致小面积的骨吸收（图。​（图3C，三C、 箭头）。[褶边是破骨细胞的特殊膜区，它使破骨细胞附着在骨基质上并分泌氢离子和消化酶来吸收骨(Baron等人，1993年).] 然而，即使是附着的破骨细胞似乎也无法再吸收大量的骨（图。​（图3C，三C、 箭头行），表明破骨细胞功能的缺陷而非分化是TRAF6缺陷动物中观察到的骨质疏松症的原因。这些结果表明TRAF6在骨代谢中发挥了意想不到的作用。

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图3

TRAF6破骨细胞的电镜观察^−/−和TRAF6^+/−老鼠。(A类)变压器6^+/−吸收陷窝内可见破骨细胞。所示细胞显示出一个附着区（星号）、细胞质空泡化和皱褶边缘（箭头），这是正常激活的矿物吸附破骨细胞（箭头）的特征。(B类)该细胞显示TRAF6中典型的破骨细胞^−/−老鼠。没有活化或矿物质吸收的迹象，细胞没有形成附着区或皱褶边缘（箭头），与下面的骨骼接触有限。(C类)TRAF6中少数活化破骨细胞之一^−/−鼠标。细胞与矿化骨接触，形成一个粘连区（星号），并有部分无组织的皱褶边缘（大箭头）。溶解的骨材料（箭头所示）和细胞的细胞质空泡化证明发生了一些吸收。然而，在覆盖的大部分骨骼表面上，没有褶皱边缘形成，也没有骨吸收（箭头线）。尺寸棒，5μm。

CD40和LPS受损诱导TRAF6缺陷B淋巴细胞增殖

为了评估TRAF6在CD40信号传导中的生理作用，我们首先检测了用激动性大鼠抗小鼠CD40单克隆抗体、重组小鼠IL-4或LPS刺激2、3或4天的B细胞的脾细胞增殖。在缺乏TRAF6的情况下，抗CD40刺激的B细胞无法增殖（图。​（图4A）。4A） ●●●●。最初的实验设计包括LPS作为B细胞增殖的阳性对照。出乎意料的是，在TRAF6中LPS刺激的增殖被显著抑制^−/−B电池（图。​（图4A）。4A） ●●●●。相反，TRAF6似乎不参与T细胞反应，因为TRAF6的增殖与野生型没有显著差异^−/−观察到用抗CD3ε、抗CD3λ+抗CD28、葡萄球菌肠毒素A（SEA）或伴刀豆球蛋白A刺激的T细胞（数据未显示）。

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图4

TRAF6缺陷细胞中增殖受损、iNOS诱导和LPS信号转导。(A类)野生型（）或TRAF6富集的（见材料和方法）脾B细胞的增殖指数^−/−（□）小鼠(A–C)，通过计算[^三H] 处理细胞与未处理细胞的胸腺嘧啶核苷摄取（cpm）。用抗CD40、IL-4、抗CD40加IL-4或LPS刺激细胞72小时[^三H] 野生型和TRAF6的胸苷摄取^−/−同型对照处理的细胞与未处理的细胞没有显著差异（未显示）。由于小鼠年龄较小，无法确定对IgM交联反应的增殖。所示数据代表三个独立实验。(B类)用50 U/ml mIFNγ、50 U/ml mIFN伽马加10 ng/ml mIL-1β或50 U/m l mIFN-γ加10 ng/ml mTNFα处理巯基乙酸合法PMφ巨噬细胞24小时后诱导iNOS。测定上清液中的亚硝酸盐（见材料和方法）。所示数据代表亚硝酸盐平均产量±s.e.m.公司。用于TRAF6^−/−(n个 = 8） 和野生型室友(n个 = 10） 在五个独立的实验中进行了分析。(C类)在用增加浓度的LPS、50 U/ml mIFNγ或50 U/ml mIFNγ加10 ng/ml mTNFα处理48小时的BMMφ巨噬细胞中诱导iNOS。上清液中亚硝酸盐含量测定，如B类数据显示平均值±s.e.m（标准电气）来自三个独立试验的一个试验代表的三份样品。（N.D.）无法检测。

TRAF6缺陷巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶活性受损

为了进一步研究TRAF6在LPS和细胞因子信号转导中的作用，来自TRAF6的巯基乙酸合法腹膜（PMφ）和原始骨髓（BMMφ）巨噬细胞^−/−采集和野生型幼崽，用IL-1β、IFNγ或TNFα以各种组合或增加LPS剂量进行处理。用TNFα（未显示）、IL-1β或IFNγ单独治疗野生型PMφ巨噬细胞不会诱导iNOS(我可导电的n个亚硝基的o个氧化物秒ynthase）显著增加；然而，当用IL-1β或TNFα联合IFNγ处理细胞时，iNOS活性发生了显著的协同诱导作用（图。​（图4B）。4B） ●●●●。来自TRAF6的PMφ巨噬细胞^−/−小鼠对IL-1β无反应，但对TNFα和IFNγ有野生型反应（图。​（图4B）。4B） ●●●●。随着LPS浓度的增加，iNOS在野生型BMMφ巨噬细胞中以剂量依赖的方式被诱导（图。​（图4C，4C、 左）。相反，TRAF6^−/−BMMφ巨噬细胞诱导iNOS的能力受损，即使在高剂量LPS下（图。​（图4C，4C、 左）。这种缺陷是LPS信号通路特有的，因为TNFα和IFNγ的结合能够激活TRAF6中的iNOS^−/−BMMφ巨噬细胞（图。​（图4C，4C、 右侧）。此外，TRAF6^−/−外周血白细胞（PBL）分泌TNFα的能力因LPS治疗而受损（未显示）。综上所述，这些结果清楚地证明了在LPS信号中对TRAF6的意外需求。

TRAF6缺乏小鼠的骨质疏松症

与报道的TRAF2或TRAF3基因敲除小鼠不同，TRAF6基因缺陷小鼠表现出骨质疏松。在大多数其他骨质疏松小鼠中，如p50/p52双突变体(Franzoso等人，1997)，c-Fos突变体(Wang等人，1992年;Grigoriades等人，1994年)和PU.1缺乏小鼠(Tondravi等人，1997年)骨岩症是由于造血前体细胞分化为成熟破骨细胞的缺陷所致。相反，酪氨酸激酶c缺乏的小鼠-型钢混凝土(Soriano等人，1991年)是由于破骨细胞功能缺陷而非发育导致的岩骨症。TRAF6的岩骨表型^−/−老鼠和c的相似-型钢混凝土-缺陷小鼠。这两个突变体都有正常数量的成熟破骨细胞，这些破骨细胞在形成皱褶边缘时受损，因此不能正确地重新吸收骨骼(Boyce等人，1992年).

c（c）-型钢混凝土与集落刺激因子-1（CSF-1）的信号传导有关(Insogna等人，1997年). CSF-1治疗正常破骨细胞可诱导胞质扩散-型钢混凝土激酶活性与蛋白质酪氨酸磷酸化(Insogna等人，1997年). 尽管CSF-1不能在c区诱导传播-型钢混凝土^−/−破骨细胞(Insogna等人，1997年)是否需要CSF-1信号传导来触发破骨细胞的骨吸收尚待阐明。有趣的是，CSF-1^−/−小鼠成熟巨噬细胞和破骨细胞严重缺乏(Yoshida等人，1990年)，与TRAF6不同^−/−老鼠。这些数据反驳了TRAF6在CSF-1信号传导中的作用。此外，TRAF6中IL-1或CD40信号的破坏不太可能^−/−小鼠是骨质疏松症的病因，因为小鼠缺乏IL-1R1、IL-1β(Zheng等人，1995年;Leon等人，1996年;Glacum1997年;Labow等人，1997年)，MyD88型(Adachi等人，1998年)，第40页(Kawabe等人，1994年)，或CD40L(Xu等人，1994年)不要表现出骨质疏松。

TRAF6在破骨细胞成熟和激活过程中的作用尚不清楚，但可能涉及破骨细胞表面受体的信号转导。在破骨细胞生物学已知的基础上，一个候选的信号受体是RANK(第页接收器一的激活器N个F类-κB） ，一个与CD40关系最密切的新型TNFR家族成员(Anderson等人，1997年). RANK最近被定位在破骨细胞祖细胞表面(Hsu等人，1999年). RANK的配体，也称为骨保护素配体（OPGL），对破骨细胞的分化和激活至关重要(莱西等人，1998年;Kong等人，1999年). 最近的研究表明，包括TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5和TRAF6在内的多种TRAF蛋白可以与RANK的羧基末端相互作用(Darnay等人，1998年;Galibert等人，1998年;Wong等人，1998年;Hsu等人，1999年). 然而，每个TRAF蛋白对RANK信号传导的生理作用仍有待阐明。

鉴于TRAF6和OPGL被认为通过相同的信号受体（即RANK）发挥作用，人们预计这两个突变小鼠的表型相似。相反，OPGL缺陷小鼠与TRAF6不同^−/−小鼠，因为前者完全没有破骨细胞(Kong等人，1999年). 有两种可能的机制可以解释这种差异。首先，除了作用于RANK外，OPGL还可能作用于一些迄今为止未标记的受体，该受体特异性地介导破骨细胞的生成，而不依赖于TRAF6。为了解决这个问题，需要使用基因靶向技术进一步研究RANK的生理功能。或者，也可能RANK是OPGL的唯一受体，但其下游信号发生分歧。在这种情况下，导致破骨细胞生成的信号可能会被其他分子补偿，例如TRAF2和/或TRAF5，其中TRAF6在传递介导成熟破骨细胞功能的信号中不可或缺。未来旨在产生缺乏多种TRAF蛋白的突变小鼠的研究将有助于回答这些问题。

OPGL的破骨细胞激活作用以前在体外进行过检测(Fuller等人，1998年;莱西等人，1998年). 用OPGL治疗孤立破骨细胞导致假足运动迅速增加，并刺激骨吸收，这些效应在添加诱饵受体骨保护素（OPG）后被特异性抑制(Fuller等人，1998年). 因此，OPGL–RANK信号传导除了在破骨细胞分化中发挥作用外，对成熟破骨细胞的激活也很重要。我们的结果表明，TRAF6可能是RANK下游的信号转导子，这是导致破骨细胞活化的途径所特别需要的。

大体解剖和组织学分析

TRAF6组^+/+，TRAF6^+/−和TRAF6^−/−小鼠在出生后21天或28天进行尸检。使用Faxitron X射线系统（型号43855A，FaxitronX射线公司，布法罗格罗夫，IL）进行射线照相。在距胫骨近端1.5和2.0 mm的两个0.5 mm的骨横截面上测定骨密度。测定干骺端的总骨密度和小梁骨密度（定义为骨横截面的最内侧20%）（XMICE 5.2，Stratec，德国）。骨组织用甲酸脱钙并包埋在石蜡中。通过特异性标记TRAP的表达来鉴定破骨细胞。使用酶组织化学方法测定TRAP活性，该方法导致TRAP的特异性红色染色⁺细胞，即破骨细胞(Simonet等人，1997年). 在TRAP染色切片中，借助分级目镜对破骨细胞进行计数。在约0.4 mm的区域进行测量²原发性海绵体位于胫骨近端生长板的远端。破骨细胞数量是相对于测量的组织面积确定的。

免疫沉淀和Western blot分析

TRAF6的肾脏^+/+，TRAF6^+/−和TRAF6^−/−将同窝仔均化，并在含有50 m的冰冷裂解缓冲液中裂解米三氯化氢（pH 7.5），150 m米氯化钠，1%Triton X-100，20 m米EDTA、蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF，10μg/ml）、亮氨酸蛋白酶（1μg/ml米). 使用25μl蛋白A珠（Pharmacia）和1μl针对全长TRAF6的多克隆抗人TRAF6抗血清，从1.5 mg总蛋白中免疫沉淀TRAF6。免疫沉淀物和总裂解物在8%三甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶（加利福尼亚州圣地亚哥Novex）上通过凝胶电泳分离，并转移到硝化纤维素膜上（Schleicher&Schuell，Keene，NH）。用1:1000稀释的抗TRAF6抗体检测Western blot，并根据制造商的说明用增强化学发光法（ECL，Amersham）显影。为了验证装载了等量的蛋白质，用1:100稀释的抗β-肌动蛋白抗体（Sigma）重制了印迹。

电子显微镜

在尸检时取出腰椎，纵向劈开，并将其浸入冷态0.1米pH 7.4，含有2.5%戊二醛和1.6%多聚甲醛的二甲氨基甲酸钠缓冲液。在4°C下24小时后，将样品转移到脱钙溶液中，脱钙溶液由5%EDTA和1%戊二醛组成，浓度为0.1米二甲氨基甲酸钠缓冲液。7天后，脱钙被认为是完全的，椎骨在缓冲液中冲洗，在1%四氧化锇水溶液中固定，在乙醇中脱水，并嵌入环氧树脂中。

每个区块最初在1-2μm处切片，用甲苯胺蓝染色，并用光学显微镜检查。然后修剪选定的块体并进行超薄切片。在Philips CM120透射电子显微镜上进行100 kV检查之前，用醋酸铀酰和柠檬酸铅对收集的切片进行对比增强。

细胞增殖分析

来自两个10日龄健康TRAF6的脾细胞^−/−或野生型小鼠混合。细胞悬液是通过将脾脏穿过细金属丝网来制备的。使用ACK（0.155）分析红细胞米氯化铵，0.1米EDTA二钠，0.01米碳酸氢钾）在冰上放置3分钟。通过将悬浮液与三种单克隆抗体组合在37°C下培养1小时，去除T细胞(马龙和朱利叶斯1994)，抗Thy1.2（H013.4.9-2）、抗CD4（RL-172-4H）和抗CD8（3.168），与豚鼠补体（Cedarlane）联合使用。Mac-1型⁺使用涂有5μg/ml小鼠抗鼠IgG（Jackson Immunoresearch Laboratories）和鼠抗鼠Mac-1（M1/70，ATCC）的Optilux培养皿（Falcon）淘洗细胞，去除细胞。细胞悬液在4°C的涂布板中培养1小时，然后回收Mac-1⁻细胞（富集的B细胞）三次洗涤。

对于增殖分析，1×10⁵在添加5×10⁻⁵ 米2-巯基乙醇，NaHCO_三（2.4克/升）、链霉素（5μg/ml）和5%热灭活胎牛血清（GIBCO）。用10μg/ml大鼠IgG2a抗小鼠CD40 mAb（Pharmingen，3/23）、10μg/ml大鼠Ig G2a同型对照（Pharmingen，11020D）、10微克/毫升LPS（Difco）或5 ng/ml重组小鼠IL-4（Genzyme）处理细胞2、3或4天。用1μCi对板进行脉冲处理[^三H] 胸腺嘧啶核苷6小时，收集到玻璃纤维过滤器上。[^三H] 使用闪烁计数器（Topcount，Canberra Packard）测量胸苷摄取。

EMSA公司

原代胚胎成纤维细胞（2×10⁶)，脾细胞（1×10⁷)和Abelson转化的前B细胞（1×10⁷)未经治疗或用10 ng/ml mIL-1β（Genzyme）、10 ng/ml mTNFα（Genzeme）、20μg/ml LPS（Sigma）、5μg/ml抗小鼠CD40（3/23）单克隆抗体（IgG）刺激_2a个κ） （PharMinen）或5μg/ml大鼠抗人肌酐激酶单克隆抗体（IgG_2a个κ） （同型控制）。如前所述，采集核提取物并进行EMSA(Yeh等人，1997年).

JNK/SAPK激酶测定

原代胚胎成纤维细胞（1×10⁶)在含有10 m米HEPES和0.1%无脂肪酸BSA。然后用10 ng/ml重组小鼠IL-1β处理不同时间（Genzyme）或10μg/ml茴香霉素处理30分钟。使用抗JNK1 C-17兔多克隆IgG（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）免疫沉淀JNK/SAPK，激酶检测如前所述(Yeh等人，1997年).

我们感谢路易斯·马丁·鲍彻、孔永云、阿达·沙希尼安、吉田博吉、拉兹夸拉·哈基姆、大卫·卡吉、安德鲁·赫塞尔、西希纳、保罗·沃特豪斯、近藤精工、丹尼斯·鲍查德、吴蜜雪儿、贝蒂·休姆、戴安·杜里娅、卡罗尔·伯格、埃尼斯·朱利安和严诚提供的试剂、有益的讨论和/或技术援助，以及Mak实验室的其他成员进行有益的讨论和建议。我们还感谢Irene Ng的出色行政支持和Mary Saunders的科学编辑。这项工作得到了安大略省研究生奖学金的部分支持。Mark A.Lomaga是多伦多大学药学院的博士生。

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