跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
公共科学图书馆一号。2011; 6（9）：e23943。
2011年9月2日在线发布。 数字对象标识：10.1371/日记.pone.0023943
PMCID公司：项目经理316282
PMID：21912653

刺猬信号拮抗剂促进原发性肝癌小鼠模型肝纤维化和肝癌的消退

乔治·菲利普斯,#1 艾萨克·S·陈,#1,2 马尔泽娜·斯威德斯卡,1 凡妮莎·施罗德,三 辛西娅·盖伊,4 Gamze F.卡拉卡,1 辛西娅·莫伊兰,1 Talaignair Venkatraman公司,5 塞巴斯蒂安·费尔林,5 Wing-Kin同步,1 容美美（Youngmi Jung）,1,6 拉斐尔·维特克,1 史蒂夫·崔,1 格雷戈里·米歇洛蒂,1 Fatima Rangwala公司,7 埃尔马尔·默克尔,5 克里斯托弗·拉斯科拉,5和安娜·梅·迪尔1,*
Pranela Rameshwar，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

目标

慢性纤维化肝损伤是人类肝癌发生的主要危险因素。Mdr2（MDR3的小鼠同源基因）靶向缺失的小鼠发生慢性纤维化肝损伤。在50–60周龄的小鼠中，肝细胞癌（HCC）会自发出现，这提供了一种纤维化相关肝癌发生的模型。我们用Mdr2−/−以研究hedgehog（Hh）信号通路的激活促进肝纤维化和HCC的发展这一假设。

方法

比较Mdr2中的肝损伤和纤维化、Hh途径激活和肝祖细胞群−/−小鼠和年龄匹配的野生型对照。用Hh信号拮抗剂GDC-0449进行剂量发现实验，以优化Hh途径抑制。然后用GDC-0449或载体治疗小鼠9天，通过免疫组织化学、qRT-PCR、Western blot和磁共振成像评估对肝纤维化和肿瘤负担的影响。

结果

与控制不同，Mdr2−/−小鼠持续表达Hh配体，并随着年龄的增长逐渐积累Hh反应性肝肌成纤维细胞和祖细胞。GDC-0449治疗老年Mdr2缺乏小鼠显著抑制肝Hh活性，减少肝肌成纤维细胞和祖细胞，减少肝纤维化，促进肝内肝癌的消退，减少转移性肝癌的数量，但不增加死亡率。

结论

Hh途径激活可促进肝纤维化和肝癌发生，抑制Hh信号可安全逆转这两个过程，即使纤维化和HCC进展。

介绍

肝细胞癌（HCC）是一种隐匿性癌症，每年导致多达100万人死亡，是全球第三大癌症死亡原因[1]肝硬化是进行性肝损伤和纤维化的结果，是HCC的最大单一危险因素[2]慢性肝损伤引起的伤口愈合反应改变，导致肌成纤维细胞和祖细胞群的失调激活，与肝硬化发病机制和最终致癌有关[3].

肝细胞小管磷脂翻转酶MDR3（ABCB4）的功能丧失突变与广泛的人类胆道疾病有关，包括进行性家族性肝内胆汁淤积3型（PFIC3）、妊娠胆汁淤滞、，药物性胆汁淤积和成人胆汁性肝硬化，其特征类似于原发性硬化性胆管炎（PSC）[4],[5],[6],[7]Mdr2（MDR3的小鼠直系同源基因）靶向缺失的小鼠缺乏肝脏特异性P-糖蛋白，该蛋白通过小管膜运输磷脂酰胆碱（PC）。胆汁中缺乏磷脂会导致进行性硬化性胆管炎，伴有门脉炎症、导管增生和门脉纤维化。肝损伤在出生后不久出现，肝细胞癌在50至60周龄时自发出现[8],[9],[10],[11],[12],[13],[14]与广泛用于研究HCC机制和治疗的异种移植模型不同，Mdr2−/−在慢性炎症、肝损伤和纤维化的背景下，小鼠提供了一个与肝癌自然演变相似的模型[15].

对Mdr2缺陷小鼠和杂合子对照组的基因表达分析表明，多种适应性机制的强烈持续诱导控制了与氧化应激、炎症、脂质代谢和增殖相关的细胞反应，促使人们推测这些过程有助于肝癌的发生[16]虽然早期对Mdr2缺乏小鼠的研究没有进行正式评估，但另一种可能在纤维化相关肝癌发生中起作用的途径是Hedgehog（Hh），因为Hh信号传导与肝损伤和HCC的纤维化修复有关。

Hh通路是一种进化上保守的信号通路，当Hh配体（声波刺猬和印度刺猬）与Patched（Ptc）结合时激活，Patched是一种在Hh反应细胞表面表达的跨膜受体。配体结合后，Ptc失活，减轻其对Smoothened（Smo）的抑制，Smoothene是一种介导细胞内Hh信号的跨膜蛋白。Smo激活最终导致Gli-family转录因子Gli1、Gli2和Gli3的核定位，进而调节下游基因表达。正常肝脏中的通路是静止的[17],[18]但作为慢性肝损伤的修复机制而重新激活[19],[20],[21],[22],[23]Hh配体促进肌成纤维细胞的生长和活性，其积累导致异常肝修复、纤维化和最终肝硬化[24],[25].Hh配体还可作为肝上皮祖细胞的活性和增殖因子，并且该细胞室的扩大与肝细胞癌的形成和维持有关[26]Hh途径激活有助于肝癌发生的可能性得到以下事实的支持：大约60%的人类HCC中发现了Sonic hedgehog（Shh）配体表达，50%的人类肿瘤中出现了Hh调节基因Gli1和Ptc的表达[27],[28],[29],[30].

基于这些观察结果，我们假设Hh途径激活对肝纤维化和纤维化相关HCC的发病机制都有贡献。为了验证这一假设，我们用Hh途径抑制剂GDC-0449（一种与Smoothened（SMO）结合的小分子抑制剂）治疗老年Mdr2缺陷小鼠。之所以选择这种药物，是因为它在第一阶段试验中的人体安全性，以及它对基底细胞癌（BCC）和髓母细胞瘤等实体器官肿瘤的疗效[31],[32],[33]我们的目的是确定患有晚期肝病和肝癌的小鼠是否能够耐受Hh途径的抑制，并改善肝纤维化和/或肿瘤负担。

方法

老鼠

Mdr2公司−/−老鼠是Detlef Schuppan博士（马萨诸塞州波士顿Beth Israel女执事医疗中心）送的礼物。年龄匹配的FVB/NJ野生型小鼠取自Jackson Laboratory（ME Bar Harbor）。所有老鼠都被关在一个12小时的光暗循环中，并给它们水和标准食物随意在2、4、12、36、52和62周龄时，在全身麻醉下处死小鼠。记录肝脏重量和体重，采集血清和肝组织。动物研究由机构动物护理和使用委员会批准，该委员会受国家卫生研究院《实验动物护理和应用指南》（杜克大学动物福利保障编号：A3195-01）管辖。

血清AST/ALT测定

根据制造商的说明，使用Biotron Diagnostics（分别为66-D和68-D；Hemet，CA）的商用试剂盒测量血清天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶。

西部印记

从RIPA缓冲液中的速冻全肝组织中提取总蛋白。样本按年龄合并（每个年龄组2-4个样本），除非另有说明。如前所述进行蛋白质印迹分析。用以下主要抗体探测膜：声波刺猬（sc-9024；Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁斯）、印度刺猬、β-肌动蛋白（sc-47778，圣克鲁斯生物技术）、Gli2（18-732-292462，加利福尼亚州圣地亚哥Genway）。将所有抗体稀释1∶1000，并在4°C下培养过夜。使用FluorChem HD2数字暗室系统（加利福尼亚州圣克拉拉Cell Biosciences）获取Western blot图像。

免疫组织化学

对4µm福尔马林固定的石蜡包埋样品进行脱蜡和再水化。为了评估组织结构，按照标准方案用苏木精-伊红（H&E）和天狼星红对玻片进行染色。对于免疫组织化学，将玻片在3%过氧化氢/甲醇中培养。通过在10 mM柠檬酸钠缓冲液或0.25%胃蛋白酶（K19；Invitrogen，Carlsbad，CA）中加热10分钟进行抗原回收。切片被阻断（Dako Envision，Carpindia，CA），并在4°C下与一级抗体孵育过夜：胶质母细胞瘤-2（Gli-2；18-732-292462；1∶2000；Genway，San Diego，CA）；细胞角蛋白19（Troma-III；杂交瘤银行，爱荷华州爱荷华市；1∶500）；甲胎蛋白（AFP）（Dako，1∶1000）；印度刺猬（Abcam；1∶750，马萨诸塞州剑桥）；Polymer-HRP抗兔（K4003；Dako）或抗鼠（K40011；Dako）或MACH3小鼠AP聚合物试剂盒（MP530，Biocare Medical，Concord，California，USA）用作二级抗体。检测过程中使用了3,3′-二氨基联苯胺（DAB）底物显色系统（K3466；Dako）和/或费朗吉蓝（Biocare）。在反应中省略一级抗体可消除染色，从而证明染色的特异性。使用DP2-BSW（奥林巴斯）图像采集软件系统，在奥林巴斯IX71（日本东京）倒置显微镜上采集图像。

定量实时逆转录PCR

从整个肝脏以及切除的肿瘤标本中分离出RNA，如前所述，RNA采用标准TriZol提取法[24]补充材料中包含了引物表。

形态测量学

如上所述，对福尔马林固定的肝脏和肿瘤切片进行CD44和骨桥蛋白染色，并使用MetaView软件（宾夕法尼亚州唐宁顿市Universal Imaging）进行形态计量分析。为每只小鼠评估至少5个随机选择的10×或20×场/节。

定量免疫组织化学分析

对福尔马林固定的肝脏和肿瘤切片进行Gli2和CK19共染色。通过计算共标记细胞的数量，对每只小鼠至少5个导管区域（每节20×场）进行评估。

肝羟脯氨酸测定

如前所述，用比色法对整个肝脏样本中的羟脯氨酸含量进行定量[34].

GDC-0449处理

在最初的动物剂量发现队列中，16 Mdr2−/−小鼠（年龄57-68周）被分配给溶媒对照组（DMSO，n=5）、20 mg/kg GDC-0449（n=5）或40 mg/kg GDC-0449（n=6）。各组之间的男女比例平衡。GDC-0449（Selleck Chemicals，德克萨斯州休斯顿）是每日在DMSO中新配制的。所有小鼠每天腹腔注射9天。第10天，处死动物。样品采集如上所述。第二组20 Mdr2−/−对小鼠（51–59周龄）进行全身磁共振成像以评估肿瘤负担，然后将具有可比肿瘤负担的成对小鼠分配给二甲基亚砜（对照组，n=10）或40 mg/kg GDC-0449（n=10）治疗。按上述方式交付药物；9天后重复MRI扫描第个治疗日；处死小鼠进行尸检和组织收获。

病理

肝脏切片的H&E和天狼星红染色由董事会认证的病理学家进行评估。检查肿瘤和非肿瘤组织的代表性切片。肿瘤组织被定义为大小至少为10 mm且可切除的肉眼可见结节。

腹部磁共振成像

给动物分配了一个盲代码，该代码在磁共振（MR）数据采集和分析期间保存。在7T Bruker Biospec 70/30水平钻孔系统（马萨诸塞州Billerica）上进行小鼠肝脏MR成像。在整个成像过程中（每只动物约60分钟），在异氟醚下对动物进行轻度麻醉，并持续监测和维持生理参数。首次获得轴位和冠状位二维T2加权快速自旋回波图像（TURBO-RARE，TE/TR=11/4200 ms，1 mm层厚，矩阵=256×256，FOV为2.4 cm×2.4 cm，5个平均值，0.0 mm层间间隙），用于筛查目的和补充解剖信息。对于定向肿瘤体积分析，采集了64张连续的500µM厚3D FSE质子密度图像，这些图像偏向T1加权（TURBO-RARE，TE/TR=9/1500 ms，矩阵=256×256×64，FOV 2.2 cm×2.2 cm×2.2 cm，持续时间25分钟）。所有成像序列均使用呼吸门控进行。

MR数据集的体积分析在Osirix软件中进行，该软件是Pixmeo（日内瓦，SUI）开发和维护的开源图像处理应用程序。治疗后，由一名经董事会认证的放射科医生（对治疗一无所知）对每只动物的肝脏肿瘤进行手动分割。对所选区域进行冠状面和矢状面表现的一致性审查，并与轴向2D FSE图像进行交叉相关。对于容量测定，对每个病灶分别进行两次体积测量，然后取平均体积。评分者间信度（kappa值）为0.97。进行T1和T2加权扫描序列。

统计分析

结果表示为平均值±标准偏差。使用学生t检验确定显著性。当p<0.05时，差异显著。

结果

Mdr2中Hh反应细胞的渐进性积累−/−老鼠

各种形式的急性和慢性肝损伤诱导Hh配体的肝脏表达和Hh反应细胞的激活。Mdr2患者血清AST和ALT水平持续升高−/−小鼠比年龄匹配的对照组(图S1)证实敲除小鼠有慢性肝损伤。因此，我们调查了Mdr2的肝脏−/−小鼠Hh途径激活。与野生型对照组的肝蛋白裂解物相比，Mdr2的裂解物−/−通过Western blot分析，小鼠表现出Sonic hedgehog（Shh）和Indian hedgethog（Ihh）的增加。这一点在第一次检查时（出生后2周）就很明显，并在动物的整个寿命期内保持不变（直到64周大）( 图1A ). Hh-调节转录因子Gli2的免疫组织化学显示Mdr2核Gli2染色的细胞进行性、年龄相关的积聚−/−老鼠。这种Gli2阳性细胞包括基质细胞、肝细胞和导管细胞( 图1B-C ). 总之，这些数据表明，在Mdr2缺乏小鼠的慢性损伤肝脏中，Hh通路被激活，导致各种Hh应答细胞群的逐渐扩大。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pone.0023943.g001.jpg
Mdr2肝刺猬（Hh）通路活性增加−/−老鼠。

A。幼年Mdr2全肝提取物中Sonic Hedgehog（SHh）和Indian Hedgehog（IHh）的Western blot分析−/−小鼠（2-16周龄），年龄（36-64周龄）Mdr2−/−小鼠和年龄匹配的对照组（n=3-5只/组/时间点）。展示了一个代表性的证明幼鼠结果的Western blot。绘制了老年小鼠的平均值±扫描电镜数据。B。年轻（4周龄）、中年（36周龄）和老年（52周龄）Mdr2的代表性肝脏切片染色显示Gli2−/−老鼠。在任何年龄的野生型小鼠中都观察到少量Gli2表达，因此显示了一只具有代表性的36周龄野生型小鼠的结果。(10×)C、。定量Gli2免疫组化数据。在Mdr2的每个肝脏切片中，至少在5个高倍视野（HPF）中计数核Gli2（+）细胞的数量−/−绘制4周龄、36周龄和64周龄小鼠和野生型对照组（n=3-4只/组/时间点）的平均值±SEM*Mdr2中的p<0.05，**p<0.01−/−各组与各自的对照组。

Mdr2的治疗−/−使用平滑抑制剂GDC-0449的小鼠是安全的，并且可以减少刺猬信号通路

为了确定GDC-0449的适当剂量，对16名年龄段（57-68周龄）的Mdr2进行了初步研究−/−老鼠。每天腹腔注射20 mg/kg GDC-0449（n=5）、40 mg/kg GDC-0449（n=6）或DMSO载体对照（n=5），持续9天，然后处死动物。对照组和高剂量（40 mg/kg）GDC-0449组的死亡率无统计学差异。在牺牲时，三组小鼠的肝脏/体重比也相似，这表明患有晚期肝病和肝癌的小鼠能够很好地耐受40 mg/kg的GDC-0449相对较短的系统治疗疗程(图S2A–B). 对这组动物肝裂解物的Western blot分析表明，GDC-0449治疗在较高剂量下导致Shh配体水平下降，在两种剂量下Gli2表达减弱(图S2C).

GDC-0449抑制Hedgehog信号消除Hh信号对靶基因表达的影响

根据我们的剂量研究中获得的数据，Mdr2的第二个队列−/−小鼠（51–59周龄）被分配接受为期9天的每日静脉注射溶媒（DMSO；n=10）或40 mg/kg GDC-0449（n=10。在第二队列中，两组的总体生存率相等，DMSO治疗组无死亡，GDC-0449治疗组有1例继发于医源性损伤的死亡。治疗小鼠的肝实质和肿瘤均显示Hh途径靶向Gli2的表达降低( 图2A-B ). 对切除肿瘤的实时PCR分析表明，GDC-0449治疗释放了Hh信号对PPARá的抑制作用，导致其基因表达显著增加( 图2C ). GDC-0449治疗也导致另一个Hh靶基因Gli1的表达显著下降( 图2D ).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pone.0023943.g002.jpg
Hedgehog（Hh）抑制剂GDC-0449消除肝实质和肝癌结节内Hh信号的作用。

A。代表性二甲基亚砜和GDC-0449处理小鼠（40×）的肝脏切片进行Gli2染色。使用二甲基亚砜或GDC-0449（n=9–10/组）治疗的小鼠非肿瘤肝脏的Gli2定量免疫组化数据用平均值±SEM表示(**p<0.01在40倍放大的条件下，计算每个门静脉道/节段中Gli2阳性染色的导管细胞数量。B。相同小鼠的肿瘤切片也进行了染色，以显示Gli2。显示了典型DMSO和GDC-0449处理小鼠的结果。通过在40倍放大镜下计数肿瘤切片中的核Gli2阳性导管和肝细胞，生成定量Gli2免疫组化数据。结果以平均值±SEM Gli2-阳性细胞/40×高功率场表示（**p<0.01）C–D类二甲基亚砜（开放条形）和GDC-0449（黑色条形）处理小鼠的全肝RNA的定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析。C、。PPAR-γ，一种通常被Hh信号抑制的基因。D。Gli1，一种由Hh信号传导诱导的基因。绘制平均值±SEM（**p<0.01）。

GDC-0449抑制刺猬信号通路减少肝纤维化

Mdr2公司−/−小鼠表现出α-平滑肌肌动蛋白（α-sma）的肝脏表达随着年龄的增长而逐渐增加，α-sma是肌纤维母细胞肝星状细胞的标记物( 图3A ，顶部面板). 伴随着促成纤维因子的增强表达，如转化生长因子TGF-β和血小板衍生生长因子PDGF-β(图S3A–B)和进行性纤维化，天狼星红染色证明( 图3A ，底部面板)和肝脏羟脯氨酸含量的定量( 图3B ). GDC-0449治疗可降低α-sma表达的肌纤维母细胞、TGF-β和PDGF-β的肝脏表达、天狼星红染色和羟脯氨酸含量，表明Hh途径抑制可减少肝纤维化( 图3C-D 和图S3C–D).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pone.0023943.g003.jpg
GDC-0449治疗减少Mdr2的纤维化−/−老鼠。

A。年龄匹配的典型Mdr2非肿瘤肝脏切片中α-SMA（顶面）和天狼星红（底面）的免疫组织化学染色−/−野生型小鼠（10×）。B。肝脏羟脯氨酸总含量为2–52周龄野生型（WT）和年龄匹配的Mdr2−/−小鼠（n=3-5/组）。Mdr2结果−/−将小鼠归一化为年龄匹配的WT小鼠，并绘制出折叠变化图。数据显示为平均值+/-SD（*p<0.05）C、。在典型的DMSO和GDC治疗的Mdr2中，对非肿瘤肝脏切片进行α-SMA（顶面，20×）和天狼星红（底面，10×）染色−/−老鼠。D。DMSO和GDC处理小鼠的肝羟脯氨酸含量（n=9/组）。GDC-0449处理小鼠的结果被归一化为DMSO车用处理小鼠的值，并以倍数变化的形式绘制。数据显示为平均值+/-SEM（*p<0.05）。

GDC-0449抑制刺猬信号传导减少肝祖细胞的积累

作为对损伤的反应，肝脏中的祖细胞群会增殖。因此，对祖细胞标记物如细胞角蛋白-19（CK-19）和α-胎蛋白（AFP）的免疫组织化学分析表明，Mdr2随年龄增长而增加−/−老鼠( 图4A ). CK19和Gli2的联合训练证实了祖细胞群体具有Hh反应性( 图4B ). GDC-0449治疗后，祖细胞标记物减少( 图4C )表明在肿瘤发生过程中需要Hh信号来维持祖细胞数量，Hh抑制足以缩小祖细胞数量的大小，即使在患有晚期HCC的小鼠中也是如此。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pone.0023943.g004.jpg
Mdr2缺乏和Hedgehog（Hh）抑制对肝祖细胞群体的影响。

A。年龄匹配的典型Mdr2肝切片的免疫组织化学染色−/−以及野生型小鼠的祖细胞标记物、细胞角蛋白-19（CK-19）（顶部面板）和α-甲胎蛋白（AFP）（底部面板）（20×）。B。Mdr2肝门静脉三联体的典型显微照片−/−小鼠，显示CK-19（蓝色）和Gli2（棕色）在导管室（40×）共同定位。C、。DMSO和GDC-0449处理的Mdr2中Gli2和CK19的定量免疫组化−/−小鼠（n=9–10/组）。在20倍放大镜下计数肿瘤内Gli2和CK19双阳性导管样细胞的数量。绘制每个高功率场（HPF）的平均值±SEM双（+）细胞t（*p<0.05）D。DMSO（开条）或GDC-0449（闭条）处理小鼠肿瘤RNA中AFP的QRT-PCR分析结果GDC-0449-处理小鼠的AFP归一化为DMSO载体处理小鼠的结果，并以平均值±SEM表示（*p<0.05）。

Hedgehog信号传导减少骨桥蛋白的表达并防止骨桥蛋白反应性（CD44阳性）细胞的积聚

包括肝癌在内的多种癌症的干/祖细胞群被认为富含表达CD44的细胞，CD44是干细胞生长因子骨桥蛋白的受体[35],[36]骨桥蛋白的表达受Hh信号调节[37]因此，我们检测了GDC-0449对骨桥蛋白及其受体CD44的影响。免疫组织化学和定量形态计量学表明，GDC-0449抑制Hh通路显著降低原发性肝肿瘤中的骨桥蛋白染色( 图5A ). CD44+肿瘤细胞也出现了类似的治疗相关的减少( 图5B ). 基因表达分析表明，骨桥蛋白和CD44 mRNA的表达在GDC-0449处理的小鼠中也趋于减少( 图5C ). 总之，这些结果表明，Hh信号可能通过调节骨桥蛋白的可用性来调节假定的肝癌干/祖细胞。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pone.0023943.g005.jpg
抑制Hh信号降低老年Mdr2肿瘤和瘤周组织中骨桥蛋白和骨桥蛋白应答（CD44）阳性细胞−/−老鼠。

A。代表性DMSO和GDC-0449治疗Mdr2的肿瘤切片−/−对小鼠进行染色以显示骨桥蛋白（OPN）代表性切片(右侧面板). OPN染色通过20倍放大镜对每个肿瘤切片至少5个HPF进行形态计量分析进行量化（n=5只小鼠/组）。GDC-0449治疗组的结果被归一化为DMSO载体组的结果，并以折叠变化的形式表示。数据显示为平均值±SEM（**p<0.01）。B。典型二甲基亚砜和GDC-0449治疗的Mdr2肿瘤周围组织中骨桥蛋白受体CD44的免疫组织化学染色−/−老鼠。(右侧面板)如A中所述，通过形态计量分析对CD44染色进行量化。GDC-0449处理小鼠的结果与车辆处理对照小鼠的结果进行了标准化，并以平均值±SEM表示（**p<0.01）。C、。DMSO-（开条）和GDC-0449-（闭条）治疗的Mdr2肝肿瘤RNA的QRT-PCR分析−/−OPN（左）和CD44（右）小鼠。将DMSO治疗组的结果归一化后，绘制平均值±扫描电镜图（*p<0.05）。

GDC-0449治疗后肝肿瘤退化的MRI和组织学证据

为了评估基质和祖细胞的变化对肝癌的潜在影响，使用磁共振成像分析治疗前后的肿瘤体积( 图6A–B ). 对无明显转移的小鼠肿瘤的分析表明，接受GDC-0449治疗9天的小鼠肿瘤体积减少，而经车辆治疗的小鼠肿瘤持续生长( 图6C ; −6.7%+/-11.7%对22.7%+/-9.1%，p=0.03）。该数据与尸检结果相关：与80%的DMSO小鼠相比，GDC-0449处理的小鼠只有56%有可见的肝肿瘤结节( 表1 ). 此外，MRI和尸检均显示GDC-0449治疗组小鼠的转移数量低于车辆治疗组( 表1 ). 还对两组的所有动物进行了H&E染色肝脏切片的组织学分析。如果肿瘤结节不明显或大小大于10mm，则将样本排除在分析之外。GDC-0449治疗动物的显微镜下肿瘤结节显示出血性梗死的发生率增加（20%比0%； 图6D ，顶部面板)微泡脂肪变性（40%vs 0%， 图6D ，中间面板)嗜酸性坏死和变性细胞质改变（70%vs 40%， 图6D ，底部面板)与载体治疗动物的肿瘤进行比较。因此，MRI、尸检和肝脏组织学的结果是一致的，并证明Hh途径抑制导致原发性和转移性肝癌显著消退。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pone.0023943.g006.jpg
磁共振成像（MRI）显示，Hh通路抑制可降低肝脏肿瘤体积，并诱导肿瘤消退的组织学特征。

A。GDC-0449治疗后通过对比增强MRI确定的肝内肿瘤的典型横断面图像。B。用于体积分析的矢状、冠状和斜向透视的代表性MRI图像。C、。肿瘤体积的变化通过计算机生成的体积测量进行量化，并以平均值±标准偏差（*p<0.05）表示。D。GDC-0449治疗引起的典型组织学变化的显微照片。顶部面板显示肿瘤坏死；中间板显示脂肪变性；底部显示空泡状肿瘤细胞，细胞核固缩。

表1

GDC-0449治疗对肝内肝癌和肝癌转移的影响。
外科切除术MRI成像
车辆治疗车辆治疗
肝内肿瘤结节 80%56%78%50%
转移酶 20%0%50%20%

讨论

我们研究了Mdr2−/−小鼠以确定Hh途径的激活是否有助于慢性纤维化肝损伤期间的肝癌发生。Mdr2缺乏小鼠缺乏正常胆汁形成所需的磷脂翻转酶，因此从小就表现出肝脏损伤和导管增殖。所有受折磨的小鼠最终都会出现明显的肝纤维化和转移性肝癌。我们的结果表明，这种病理学伴随着Hh途径的进行性激活。引入一种关键Hh信号转导中间体的特异性抑制剂Smoothened，降低了通路活性，并证明持续的Hh信号传导是维持肝脏肌成纤维细胞和祖细胞数量增加的必要条件，这些细胞在受损肝脏中积累。此外，用Hh途径抑制剂治疗老年Mdr2缺陷小鼠（已患有晚期肝纤维化和HCC）可显著降低肝纤维化和肿瘤负担，首次证明抑制Hh信号对肝纤维化和肝癌具有临床相关的治疗价值。更令人兴奋的是，有证据表明，这种药物对肝肿瘤的生长具有抑制作用体内与肝内肝癌和远处转移有关。

此外，我们的结果提供了对一些潜在机制的见解。在发生进行性肝纤维化和侵袭性HCC的小鼠中，Hh配体的肝脏产生增加。这些小鼠的血清转氨酶水平持续升高，这与Mdr2缺乏引起慢性肝细胞损伤的其他证据一致[38],[39]各种降低肝细胞活力的应激源已被证明可诱导受损肝细胞产生和释放Hh配体[40],[41]因此，肝细胞损伤可能是增加mdr2缺乏肝中Hh配体生成的因素之一。在慢性损伤的肝脏中逐渐积累的肌纤维母细胞和导管型祖细胞也会产生Hh配体，以及其他因子，如PDGF-β，刺激Hh配体物的自分泌-嘌呤合成[20],[42]与年龄/性别匹配的健康对照小鼠相比，患有导管反应和肝纤维化的老年mdr2缺乏小鼠的肝脏PDGF-βmRNA水平较高，这表明纤维化修复反应本身可能使Hh配体的过度肝蓄积持续存在。后一个概念得到了证据的支持，即GDC-0449抑制Hh信号传导减少了肌成纤维细胞和导管型祖细胞的积累，减少了PDGF-β的表达，并抑制了由于Mdr2基因缺乏而仍有肝细胞损伤风险的小鼠的肝脏表达Hh配体。

Hh配体的慢性过度生成具有重要的病理生物学意义，因为生成更多Hh配体物的小鼠也表现出肝脏中Hh途径的过度激活。通过对Hh-调节转录因子Gli2进行核染色的大量细胞，以及包括Gli1和骨桥蛋白在内的各种Hh-靶基因的增强表达，证明了这一点。在这些动物中，我们发现用高度特异性的Smoothened拮抗剂治疗能够抑制所有这些反应，这与已发表的证据一致，即Hh反应细胞中Smoothene的激活促进了Gli2的核定位，并随后诱导了Gli1和骨桥蛋白转录[43],[44]骨桥蛋白反过来被证明可以促进小鼠肌成纤维细胞的积累和肝纤维化[37],[45]它还通过其受体CD44发挥作用，增强某些类型的肝祖细胞的生存能力和生长，包括肝癌干/祖细胞[35],[36],[46],[47]因此，Hh途径可能通过调节骨桥蛋白的自分泌/旁分泌可用性来调节肝纤维化和肝癌的生长。

肌成纤维细胞和导管前体细胞也是其他促成纤维因子（例如PDGF-β和TGF-β）的重要来源，这些因子能够通过不需要平滑的机制激活Gli2[48],[49],[50]在Mdr2缺乏小鼠中，我们观察到PDGF-β和TGF-β的肝脏表达增加。这表明，在纤维原性修复过程中，重新增强典型Hh通路作用的平滑独立机制可能会发生演变。然而，在mdr2缺陷小鼠中，GDC-0449显著降低了TGF-β的表达，并倾向于抑制PDGFβ的表达，证明具有最终平滑激活的典型Hh信号最终需要与依赖TGF-β和PDGF-β与其各自受体相互作用的非经典途径充分结合，以激活受损纤维化肝脏中的Gli2。

最后，肝纤维化/肝硬化是HCC发生的主要危险因素，这一事实不应被误解为意味着肝纤维化就其本身而言导致癌症。可以想象，纤维化和肝癌都是由慢性肝损伤期间发生的一些适应性反应引起的。我们的结果表明，损伤相关的Hh通路激活代表了一种适应性反应，即促生和促癌反应。这一发现反过来又提供了新的证据，有助于解释为什么纤维化和肝癌经常在同一肝脏中发生。因此，它对许多肝硬化HCC患者具有直接的临床意义。然而，还需要进行额外的研究，以描述所涉及的精确下游机制，并确定哪些（如果有的话）随后的纤维生成和致癌过程是相互依赖的，哪些是完全独立的。

Hh信号的抑制显著降低了肌成纤维细胞和祖细胞的肝脏含量，这表明这些细胞类型促进和/或维持了恶性肝细胞的生长。这一发现反过来又为进一步研究提供了一个起点。事实上，其他人报告称，平滑拮抗剂通过影响肿瘤血管生成导致胰腺癌退化[51]肌成纤维细胞是血管生长因子（如VEGF）的重要来源[52],[53],[54]我们发现，与年龄/性别匹配的对照组的健康肝脏相比，Mdr2缺陷小鼠的病变肝脏中VEGF及其受体VEGFR1的肝脏表达增加（数据未显示）。因此，肌成纤维细胞耗竭可能对肝血管系统产生负面影响，最终导致HCC退化。GDC-0449倾向于抑制VEGF/VEGFR1的肝脏表达（数据未显示），并增加GDC-0449-治疗小鼠肝癌的坏死，这一观点得到了证据的支持。已知Hh信号也可维持各种祖细胞群[55],[56],[57]之前，我们报道了Hh配体作为肝祖细胞自分泌和旁分泌生存信号的功能，并表明肝肌成纤维细胞是Hh配子的重要旁分泌来源[40],[42],[58],[59],[60]肝祖细胞反过来产生Hh配体，提供旁分泌信号，重新促进肝肌成纤维细胞的生长[61],[62]鉴于这种背景，用平滑拮抗剂阻断Hh信号传导导致两种细胞类型的相互耗竭并不奇怪。然而，据我们所知，通过证明HCC肿瘤中CD44、细胞角蛋白-19和α-甲胎蛋白的显著治疗相关减少，目前的数据提供了第一个证据，即平滑拮抗剂减少了具有肿瘤干/祖细胞特征的细胞数量。需要进一步研究以确定异常的Hedgehog信号如何促进这些癌症干细胞亚群。

总之，我们在Mdr2中的发现−/−进行性肝纤维化和自发性肝癌发生的小鼠模型表明，Hh配体的产生增加和Hh反应性细胞类型（如肌成纤维细胞和肝祖细胞）的逐渐积累在HCC出现之前，并在HCC发展之后持续。尽管存在晚期肝纤维化和HCC，但使用高特异性和临床可用的Hh信号抑制剂进行短疗程治疗，耐受性良好，并显示出明显的抗肿瘤效果。因此，使用GDC-0449抑制Hh通路可作为肝硬化患者肝癌的潜在治疗方法，为预后不良且治疗手段有限的新发疾病提供了一种新的治疗选择。

支持信息

图S1

Mdr2持续肝损伤的证据−/−老鼠。Mdr2的AST和ALT测量−/−在不同的时间点，小鼠及其年龄匹配的野生型对应物。每个数据点表示n=2-7只动物，并绘制平均值±SD。（与年龄匹配的野生型对照组相比，p<0.05）。

（畅通节能法）

图S2

GDC-0449治疗的全身治疗在Mdr2患者中耐受性良好−/−患有晚期肝病和HCC的小鼠。 A。对三个治疗组中的每一组的所有动物进行每日体重测量，并随时间绘制图表。数据表示为平均值±标准偏差。B。三个治疗组中每一组动物的肝脏与体重比率。数据表示为平均值±标准偏差。C、。Western blot分析用载体、20 mg/kg GDC-0449和40 mg/kg GDC 0449处理的Mdr2−/−小鼠的全肝提取物中的Shh、Gli1、Gli2和肌动蛋白（负荷控制）。分别装载每个治疗小鼠的肝脏提取物。

（畅通节能法）

图S3

Mdr2中TGFβ和PDGFβ在肝脏的表达增加−/−GDC-0449治疗可逆转小鼠。从Mdr2中分离出全肝RNA−/−小鼠和年龄/性别匹配的野生型对照（WT）（n=3只小鼠/组）以及QRT PCR进行比较(A类)转化生长因子β和(B类)PDGFβ。使用类似的方法来评估用Hh途径抑制剂GDC-0449或载体（DMSO）治疗9天疗程对(C类)转化生长因子β和(D类)Mdr2中的PDGFβ−/−小鼠（n=5只/组）。基因表达归一化为相同样本中S9的表达；计算平均+/-SEM值；实验组的数值与相应对照组的数值相对应。显示了P值。

（畅通节能法）

表S1

（PDF格式）

脚注

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

基金：这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）RO1 DK077794、NIH RO1 AA010154、NIH T32 DK007568和NIH T32CA071341的部分支持。部分成像在杜克活体显微镜中心进行，部分由国家研究资源中心国家生物医学技术研究中心（P41 RR005959）和国家癌症研究所小动物成像资源计划（U24 CA092656）提供支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

工具书类

1Rahbari NN、Mehrabi A、Mollberg NM、Muller SA、Koch M等。肝细胞癌：当前管理和未来展望。安·苏格。2011;253:453–469.[公共医学][谷歌学者]
2Luedde T，Schwabe RF。NF-kappaB与肝脏损伤、纤维化和肝细胞癌相关。Nat Rev胃肠肝素。2011;8:108–118. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
三。新罕布什尔州阿夫达尔Schuppan D。肝硬化。柳叶刀。2008;371:838–851. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4Gonzales E、Davit-Spraul A、Baussan C、Buffet C、Maurice M等。与MDR3（ABCB4）基因缺陷相关的肝病。Front Biosci公司。2009;14:4242–4256.[公共医学][谷歌学者]
5Jacquemin E.多药耐药3缺陷在儿童和成人肝病中的作用：一个基因导致三种疾病。塞米恩肝病。2001;21:551–562.[公共医学][谷歌学者]
6Trauner M、Fickert P、Halilbasic E、Moustafa T。从胆汁淤积性肝病的发病机制和治疗中吸取有毒胆汁概念的教训。Wien Med Wochenschr公司。2008;158:542–548.[公共医学][谷歌学者]
7Trauner M、Fickert P、Wagner M.MDR3（ABCB4）缺陷：成人胆汁淤积综合征的遗传学范式。塞米恩肝病。2007;27:77–98.[公共医学][谷歌学者]
8Baghdasaryan A、Fickert P、Fuchsbichler A、Silbert D、Gumhold J等。肝脏磷脂在Mdr2（Abcb4）基因敲除小鼠肝损伤发展中的作用。肝脏Int。2008;28:948–958.[公共医学][谷歌学者]
9De Vree JM、Ottenhoff R、Bosma PJ、Smith AJ、Aten J等。在进行性家族性肝内胆汁淤积小鼠模型中通过肝细胞移植纠正肝脏疾病。胃肠病学。2000;119:1720–1730.[公共医学][谷歌学者]
10Fickert P、Fuchsbichler A、Wagner M、Zollner G、Kaser A等。泄漏胆管中的胆酸回流会导致Mdr2（Abcb4）基因敲除小鼠发生硬化性胆管炎。胃肠病学。2004;127:261–274.[公共医学][谷歌学者]
11Fickert P、Zollner G、Fuchsbichler A、Stumptner C、Weiglein AH等。熊去氧胆酸通过破坏胆管，加重胆道封闭和Mdr2基因敲除小鼠的胆汁梗死。胃肠病学。2002;123:1238–1251.[公共医学][谷歌学者]
12Frijters CM、Ottenhoff R、Van Wijland MJ、Van Nieuwkerk C、Groen AK等。胆汁盐对肝脏mdr2 P-糖蛋白表达的影响。高级酶调节。1996;36:351–363.[公共医学][谷歌学者]
13Popov Y、Patsenker E、Fickert P、Trauner M、Schuppan D.Mdr2（Abcb4）−/−小鼠通过促纤维化和抗纤维化基因的大规模失调自发发展为严重的胆道纤维化。肝素杂志。2005;43:1045–1054.[公共医学][谷歌学者]
14Van Nieuwkerk CM、Elferink RP、Groen AK、Ottenhoff R、Tytgat GN等。熊去氧胆酸盐和胆酸盐喂养对mdr2 P-糖蛋白基因受损的FVB小鼠肝脏疾病的影响。胃肠病学。1996;111:165–171.[公共医学][谷歌学者]
15Katzenellenbogen M、Mizrahi L、Pappo O、Klopstock N、Olam D等。mdr2基因敲除小鼠肝癌发生的分子机制。摩尔癌症研究。2007;5:1159–1170.[公共医学][谷歌学者]
16Katzenellenbogen M、Pappo O、Barash H、Klopstock N、Mizrahi L等。在Mdr2基因敲除小鼠肝癌发生的早期阶段，揭示了慢性肝病的多种适应性机制。癌症研究。2006;66:4001–4010.[公共医学][谷歌学者]
17Ramalho-Santos M，Melton DA，McMahon AP。刺猬信号调节胃肠道发育的多个方面。发展。2000;127:2763–2772.[公共医学][谷歌学者]
18Berman DM、Karhadkar SS、Maitra A、Montes De Oca R、Gerstenblith MR等。广泛要求刺猬配体刺激消化道肿瘤生长。自然。2003;425:846–851.[公共医学][谷歌学者]
19奥梅内蒂A，迪尔AM。声音刺猬在开发和修复中的冒险。二、。声波刺猬与肝脏发育、炎症和癌症。美国生理学杂志胃肠道肝脏生理学。2008;294：G595–598。[公共医学][谷歌学者]
20Omenetti A、Popov Y、Jung Y、Choi SS、Witek RP等。刺猬通路调节大鼠胆道梗阻的重塑反应。内脏。2008;57:1275–1282.[公共医学][谷歌学者]
21Omenetti A、Porrello A、Jung Y、Yang L、Popov Y等。刺猬信号调节啮齿动物和人类胆道纤维化期间的上皮-间充质转化。临床投资杂志。2008;118:3331–3342. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22.Omenetti A，Yang L，Li YX，McCall SJ，Jung Y，等。Hedgehog介导的间质-上皮相互作用调节肝对胆管结扎的反应。实验室投资。2007;87:499–514.[公共医学][谷歌学者]
23.Syn WK、Jung Y、Omenetti A、Abdelmalek M、Guy CD等。非酒精性脂肪性肝病中Hedgehog介导的上皮-间充质转化和纤维化修复。胃肠病学。2009;137：1478–1488 e1478。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
24Choi SS、Omenetti A、Witek RP、Moylan CA、Syn WK等。Hedgehog通路激活和培养和肝硬化大鼠肝细胞肌成纤维细胞转化过程中的上皮-间质转化。美国生理学杂志胃肠道肝脏生理学。2009;297：G1093–1106。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Sicklick JK，Li YX，Choi SS，Qi Y，Chen W，等。刺猬信号在肝星状细胞激活和存活中的作用。实验室投资。2005;85:1368–1380.[公共医学][谷歌学者]
26黄S，何杰，张旭，卞毅，杨磊，等。人肝细胞癌中刺猬通路的激活。致癌。2006;27:1334–1340.[公共医学][谷歌学者]
27Sicklick JK，Li YX，Jayaraman A，Kannangai R，Qi Y，等。人类肝癌发生过程中Hedgehog通路的失调。致癌。2006;27:748–757.[公共医学][谷歌学者]
28Patil MA，Zhang J，Ho C，Cheung ST，Fan ST，等。人类肝细胞癌中的刺猬信号传导。癌症生物学。2006;5:111–117.[公共医学][谷歌学者]
29Chen W，Tang T，Eastham-Anderson J，Dunlap D，Alicke B，et al.标准刺猬信号通过诱导基质血管周细胞中的VEGF-A增强肿瘤血管生成。美国国家科学院院刊。2011;108:9589–9594. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30.Pereira Tde A、Witek RP、Syn WK、Choi SS、Bradrick S等。病毒因子在患有病毒性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的人类中诱导Hedgehog通路激活。实验室投资。2010;90:1690–1703. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Lorusso PM、Rudin CM、Reddy JC、Tibes R、Weiss GJ等。Hedgehog通路抑制剂Vismodegib（GDC-0449）在难治性、局部晚期或转移性实体瘤患者中的I期试验。临床癌症研究。2011;17:2502–2511. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
32Von Hoff DD、LoRusso PM、Rudin CM、Reddy JC、Yauch RL等。晚期基底细胞癌中hedgehog通路的抑制。N英格兰医学杂志。2009;361:1164–1172.[公共医学][谷歌学者]
33Rudin CM、Hann CL、Laterra J、Yauch RL、Callahan CA等。用刺猬途径抑制剂GDC-0449治疗髓母细胞瘤。N英格兰医学杂志。2009;361:1173–1178. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
34Witek RP、Stone WC、Karaca FG、Syn WK、Pereira TA等。泛酶抑制剂VX-166减少非酒精性脂肪性肝炎动物模型中的纤维化。肝病学。2009;50:1421–1430.[公共医学][谷歌学者]
35.Orian-Rousseau V.CD44，转移性肿瘤的治疗靶点。《欧洲癌症杂志》。2010;46:1271–1277.[公共医学][谷歌学者]
36Yang GH，Fan J，Xu Y，Qiu SJ，Yang XR，等。骨桥蛋白联合CD44，一种新的肝细胞癌根治性切除患者预后生物标志物。肿瘤学家。2008;13:1155–1165.[公共医学][谷歌学者]
37Syn WK、Choi SS、Liaskou E、Karaca GF、Agboola KM等。非酒精性脂肪性肝炎中，骨桥蛋白由刺猬途径激活诱导，并促进纤维化进展。肝病学。2011;53:106–115. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Mauad TH、van Nieuwkerk CM、Dingemans KP、Smit JJ、Schinkel AH等。mdr2 P-糖蛋白基因纯合性破坏的小鼠。非化脓性炎症性胆管炎和肝癌发生研究的新动物模型。《美国病理学杂志》。1994;145:1237–1245. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
39Smit JJ、Schinkel AH、Oude Elferink RP、Groen AK、Wagenaar E等。小鼠mdr2 P-糖蛋白基因的纯合性破坏导致胆汁中完全缺乏磷脂，并导致肝脏疾病。单元格。1993;75:451–462.[公共医学][谷歌学者]
40Jung Y、Witek RP、Syn WK、Choi SS、Omenetti A等。来自死亡肝细胞的信号触发肝祖细胞的生长。内脏。2010;59:655–665. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
41Rangwala F、Guy CD、Lu J、Suzuki A、Burchette JL等。通过膨胀的肝细胞增加声音刺猬的产量。病理学杂志。2011;224:401–410. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42杨磊，王毅，毛赫，弗莱格S，奥梅内蒂A，等。声波刺猬是肌纤维母细胞肝星状细胞的自分泌活性因子。肝素杂志。2008;48:98–106. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
43Das S，Harris LG，Metge BJ，Liu S，Riker AI等。刺猬通路转录因子GLI1通过上调骨桥蛋白促进癌细胞的恶性行为。生物化学杂志。2009;284:22888–22897. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
44Omenetti A，Choi S，Michelotti G，Diehl AM。肝脏中的刺猬信号。肝素杂志。2011;54:366–373. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
45Machado MV，Cortez-Pinto H.骨桥蛋白：非酒精性脂肪性肝炎中刺猬信号与纤维化之间缺失的联系。肝病学。2011;53:382–384.[公共医学][谷歌学者]
46Rangwala F，Omenetti A，Diehl AM。癌症干细胞：修复出了问题？《Oncol杂志》。2011;2011:465343. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
47Haramaki M、Yano H、Fukuda K、Momosaki S、Ogasawara S等。CD44在人肝癌细胞系中的表达。肝病学。1995;21:1276–1284.[公共医学][谷歌学者]
48Dennler S，Andre J，Verrecchia F，Mauviel A.人类GLI2启动子的克隆：通过SMAD3/β-catenin合作转化生长因子β转录激活。生物化学杂志。2009;284:31523–31531. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
49Dennler S、Andre J、Alexaki I、Li A、Magnaldo T等。通过转化生长因子-beta诱导声波刺猬介体：体内外Gli2和Gli1表达的Smad3依赖性激活。癌症研究。2007;67:6981–6986.[公共医学][谷歌学者]
50Friedman SL。肝星状细胞：肝脏的蛋白质、多功能和神秘细胞。生理学评论。2008;88:125–172. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
51Olive KP、Jacobetz MA、Davidson CJ、Gopinathan A、McIntyre D等。抑制Hedgehog信号可增强胰腺癌小鼠模型的化疗效果。科学。2009;324:1457–1461. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
52Ankoma Sey V，Wang Y，Dai Z.缺氧刺激活化大鼠肝星状细胞中血管内皮生长因子的表达。肝病学。2000;31:141–148.[公共医学][谷歌学者]
53Lee JS，Semela D，Iredale J，Shah VH.窦性重塑和血管生成：肝周细胞的新功能？肝病学。2007;45:817–825.[公共医学][谷歌学者]
54Witek RP，Yang L，Liu R，Jung Y，Omenetti A，等。肝细胞衍生微粒激活刺猬信号传导并改变肝内皮细胞中的基因表达。胃肠病学。2009;136：320–330 e322。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
55Song Z，Yue W，Wei B，Wang N，Li T，et al.声波刺猬通路对人胃癌中癌干细胞的维持至关重要。公共科学图书馆一号。2011;6：e17687。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
56Katoh Y，Katoh M.刺猬靶基因：异常刺猬信号激活诱导的致癌机制。当前分子医学。2009;9:873–886.[公共医学][谷歌学者]
57Tanaka H、Nakamura M、Kameda C、Kubo M、Sato N等。刺猬信号通路在维持CD44+CD24−/低亚群和乳腺癌细胞的副群中起着重要作用。抗癌研究。2009;29:2147–2157.[公共医学][谷歌学者]
58Jung Y、Brown KD、Witek RP、Omenetti A、Yang L等。刺猬反应祖细胞的积累与小鼠和人类酒精性肝病的严重程度平行。胃肠病学。2008;134:1532–1543. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
59Sicklick JK，Li YX，Melhem A，Schmelzer E，Zdanowicz M，et al.刺猬信号在一生中维持肝脏祖细胞的存活。美国生理学杂志胃肠道肝脏生理学。2006;290：G859–870。[公共医学][谷歌学者]
60Jung Y，McCall SJ，Li YX，Diehl AM。胆管和基质细胞在原发性胆汁性肝硬化中表达刺猬配体和/或刺猬靶基因。肝病学。2007;45:1091–1096.[公共医学][谷歌学者]
61Omenetti A、Syn WK、Jung Y、Francis H、Porrello A等。刺猬信号的修复相关激活促进胆管细胞趋化因子的产生。肝病学。2009;50:518–527. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
62Fleig SV、Choi SS、Yang L、Jung Y、Omenetti A等。Hedgehog反应性祖细胞的肝蓄积随着小鼠脂肪肝损伤的严重程度而增加。实验室投资。2007;87:1227–1239.[公共医学][谷歌学者]
文章来自PLOS ONE系列由以下人员提供普洛斯