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分子细胞生物学。2011年9月；31(18): 3790–3801.
数字对象标识：10.1128/MCB.05639-11
预防性维修识别码：项目经理3165726
PMID：21768308

TOP2A翻译控制对阿霉素疗效的影响▿

Subramanya Srikatan公司,1 科特布·阿卜杜勒莫森,1 李恩京,1 富田久美子,1 莎拉·苏巴兰,2 久野由纪夫,1 Ritu Kulshrestha公司,三 罗希特·潘查克沙里,三 Hyeon Ho Kim先生,1,4 杨晓玲,1 詹妮弗·马丁代尔,1 伯纳德·马拉萨,1 Mihee M.Kim先生,1 罗伯特·沃斯托,2 弗雷德·英迪格,2 迪潘詹·乔杜里,三，*和Myriam Gorospe公司1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

拓扑异构酶IIα（TOP2A）的细胞丰度在复制后至关重要地维持了DNA拓扑结构，并决定了TOP2抑制剂在化疗中的疗效。在这里，我们报道了RNA结合蛋白HuR，通常在癌症中过表达，与TOP2A公司3′-非翻译区（3′UTR）并增加TOP2A翻译。降低HuR水平引发了TOP2A公司RNA诱导沉默复合物（RISC）组分和细胞质加工体的转录物。使用一种新的MS2标记的RNA沉淀方法，我们鉴定了微小RNA miR-548c-3p作为这些作用的介质，并进一步揭示了miR-548c-3p与TOP2A公司3′UTR通过拮抗HuR的作用抑制TOP2A翻译。通过沉默HuR或过度表达miR-548c-3p降低TOP2A选择性地减少化疗药物阿霉素治疗后的DNA损伤。总之，HuR通过与miR-548c-3p竞争增强了TOP2A翻译；它们的联合作用控制TOP2A的表达水平，并确定阿霉素的疗效。

简介

哺乳动物细胞在整个分裂周期中表达不同的蛋白质亚群。显示丰度改变的蛋白质包括驱动细胞周期进展的蛋白质（例如，细胞周期蛋白）和细胞对每个细胞周期阶段不同代谢需求作出反应所需的蛋白质。后一组是拓扑异构酶IIα（TOP2A），这是一种酶，通过引入双链断裂来缓解DNA复制等过程产生的张力，从而帮助维持适当的DNA拓扑结构(12,38). G期间TOP2A峰值的表达2与相关蛋白TOP2B的表达不同，TOP2B在整个细胞分裂周期中的丰度是恒定的(19,39). 这种表达模式支持TOP2A在放松正超螺旋中的作用，正超螺旋是随着复制叉在S期的推进而发展的，在有丝分裂事件中，如染色体解列、动粒和着丝粒功能(28,31,33). TOP2A在化疗中也很重要；越来越多的文献表明，几种抗癌药物的疗效取决于TOP2A水平(29).

因为RNA聚合酶II的转录在有丝分裂期间受到抑制(30)，转录后过程对于控制有丝分裂细胞中的蛋白质丰度特别重要。TOP2A在有丝分裂细胞中的表达(19,39); 因此，调控TOP2A表达的潜在机制至关重要。在哺乳动物细胞中，TOP2A的功能与翻译后修饰（酰化、磷酸化）及其与其他蛋白质的相互作用有关（参考文献综述28). 然而，控制TOP2A表达的转录和转录后机制实际上是未知的。转录后基因调控（例如mRNA剪接、运输、储存、稳定性和翻译的变化）通常由顺式-调节mRNA中的作用元件反式-约束性调节因素。这些因子主要有两种类型，即RNA-binding proteins（RBP）和noncoding RNAs（主要是microRNAs），它们能有效调节mRNA的转换和翻译。

Hu／elav RBP家族中普遍存在的成员HuR是一个被广泛研究的结合转录物稳定性和翻译的调节器，它通过三个RNA识别基序（RRM）与之相互作用(9,20,22,24). HuR与致癌、分化、应激和免疫反应有关(1,20,26,35). 微小RNA（约22个核苷酸长）通常通过降低靶mRNA的翻译和/或稳定性来抑制转录后的基因表达(13). 它们的作用与招募RNA-induced silenting complex（RISC）以靶向与microRNAs部分互补相关的mRNAs有关(7). 微RNA还与生理和病理事件有关，包括对损伤和免疫信号的反应、发育和致癌(5,23,36).

在这里，我们证明TOP2A的表达在翻译水平上受到有力的调控。TOP2A表达增强与HuR与TOP2A公司mRNA，与miR-548c-3p与TOP2A公司mRNA，其与TOP2A公司mRNA导致其招募到加工体（PBs）、专门从事mRNA衰变和翻译抑制的细胞质病灶。HuR和miR-548c-3p对TOP2A表达的拮抗作用选择性地影响TOP2A抑制剂治疗后DNA损伤的程度。我们的研究结果强调了包括调节TOP2A翻译在内的化疗策略的有用性。

材料和方法

细胞培养、治疗和转染。

HeLa细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）和抗生素的Dulbecco改良基本培养基（DMEM；Invitrogen）中培养。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染带有小RNA和质粒的细胞。用于沉默HuR的小RNA（100nM）为AATCTTAAGTTTCGTAAGTTA（HuR U1）和TTCCTTAAGATATATATTAA（HuR U2），对照小干扰RNA（Ctrl-siRNA）为AATTCTCCGGAACGTGTCACGT（Qiagen），TOP2A siRNA来自Santa Cruz Biotech。以50 ng/ml[pEGFP，pEGFP-TOP2A（3′），pEGF-TOP2A（3′mut。诺卡唑（100 ng/ml）治疗持续16 h。如前所述，进行双胸苷阻断和流式细胞术(21).TOP2A公司通过插入TOP2A公司3′UTR转化为pEGFP-C1或pMS2。I.E.Gallouzi善意地提供了pHuR-Flag；pMS2和pMS2-YFP质粒如前所述(25).

显微镜。

如前所述进行荧光显微镜检查(25). 简单地说，细胞用2%甲醛固定，用0.2%Triton X-100渗透，用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭。与识别DCP1a的一级抗体（Abcam）孵育后，使用Alexa 568-共轭二级抗体（Invitrogen）检测一级抗体-抗原复合物（红色）。黄色荧光蛋白（YFP）荧光为绿色。使用Axio Observer显微镜（蔡司）和AxioVision 4.7蔡司图像处理软件或LSM 510 Meta（蔡斯）采集图像。共聚焦显微镜图像是用Z轴-15个切片和0.4μm间距的切片模式，并使用最大强度合并。

蛋白质和RNA分析。

使用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液制备全细胞裂解物，该缓冲液在4~12%三甘氨酸凝胶（Invitrogen）中溶解，并转移到Immobilon-P膜（Millipore）上。用识别TOP2A、HuR、绿色荧光蛋白（GFP）、α-微管蛋白（Santa Cruz Biotech）或β-肌动蛋白（Abcam）的初级鼠单克隆抗体或识别γ-H2AX的兔多克隆抗体（Santa Cruz）孵育，然后用二级抗体孵育（Amersham）和增强发光检测（Amersham）或SuperSignal West Femto最大灵敏度基板（Thermo Fisher）。在每种情况下选择负荷对照物（α-微管蛋白或β-肌动蛋白），以避免在同一个印迹上检测到重叠的蛋白质信号。

在使用随机六聚体和SSII逆转录酶（Invitrogen）对细胞总RNA进行逆转录（RT）后，使用SYBR绿色PCR主混合物（Kapa Biosystems）和以下基因特异性引物（分别为正向和反向）进行实时定量PCR（qPCR）分析：GCGAGTGTGCTGGTCACTAA和ACAATTGGCCTTAAACTTG检测TOP2A公司mRNA、TGCACCACACTGTTAGC和GGCATGGTCATGAG检测GAPDH公司（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）mRNA和TGACCGCAGTCTTCCCT和TGGGTGTCATGCTCACTA检测EGFP公司（增强型GFP）mRNA。使用QuantiMir检测分析（System Biosciences）定量成熟miR-548c-3p、miR-143、miR-355、miR-410、miR495、miR544和miR-548 e microRNA以及U6 snRNA。miR-548c-3p miRNA来自Applied Biosystems。

RNP检测：生物素下拉和RNP IP分析。

如前所述，进行天然RNP复合物的免疫沉淀（RNP IP分析）(三)使用识别HuR或YFP的初级抗体或控制IgG（圣克鲁斯生物技术公司）；使用上述引物，通过RT-qPCR进一步分析IP样品中的RNA。

生物素下拉分析如前所述进行(三). 简单地说，cDNA被用作PCR扩增的模板，以制备跨越TOP2A公司mRNA。为了合成每个模板，前向引物包含T7 RNA聚合酶启动子序列（T7）CCAAGCTTAATACGACTAGAGGAGA。使用以下引物对（正向和反向）合成TOP2A 3′UTR片段：（T7）AATGTGAGGCGATTTAAGTA和GCAGAGAAAAACAATGCCCAT用于片段A，（T7）CTGTCTAAATAGTGACCATCTC和AAAGAGGAGTGACACTT用于片段B，（T7）CAGTTTGATTTAAAAGTGTCACTC和CCTTGATGATTTGAAGATTA用于片段C，（T7）片段D的GCTCATGTTCTTCATCTTCA和AATGTTGTCCCCGAGTCTTCTG，片段E的（T7）GAGGACTGGATTGCAGAAAGAC和TTTATAAAGTACAAATTGTGGAAT。TOP2A编码区（CR）生物素化RNA是使用引物对（T7。利用引物对（T7）CCTCAACGACCACTTTGTCA和GGTTGACAGGTTTATT合成生物素化GAPDH 3′UTR。将全细胞裂解物（每个样品100μg）与3μg纯化生物素化转录物孵育（1小时，25°C）；用链亲和素偶联的Dynabeads（Invitrogen）分离复合物。通过Western blotting分析下拉材料中的蛋白质。

翻译分析。

如前所述，进行多核糖体分馏分析(4,25). 简而言之，将细胞与环己酰亚胺（100μg/ml，15 min；Sigma）孵育，通过15至60%线性蔗糖梯度离心分离细胞质裂解物（500μl），并将其分为10个组分进行RT-qPCR分析，以确定其分布TOP2A公司mRNA和GAPDH公司mRNA。

通过两种方法研究TOP2A的初级翻译(4,15). 其中一个，HeLa细胞与1 mCi孵育我-[35S] 蛋氨酸和我-[35S] 半胱氨酸（NEN/Perkin-Elmer）/60-mm板15分钟；裂解后，使用IgG1（BD Pharmingen）、抗GAPDH或抗TOP2A抗体进行IP反应（16 h，4°C），反应通过SDS-PAGE解决。将反应产物转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）过滤器中，并使用荧光成像仪（分子动力学）进行可视化。另一种方法是将HeLa细胞在不含蛋氨酸和半胱氨酸的培养基中培养1小时，培养基中含有我-纳入新生多肽链的叠氮高丙氨酸（AHA；Invitrogen）；然后按照制造商的说明，使用炔-生物素和Click-iT蛋白反应缓冲试剂盒（Invitrogen）标记裂解产物。使用链霉亲和素偶联Dynabeads（Roche）分离生物素化蛋白，并通过Western blot分析检测TOP2A和GAPDH。

结果

HuR与TOP2A公司3′UTR并增加TOP2A转换。

HuR调节基因表达的调查表明TOP2A公司mRNA可能是HuR的靶点(27). 通过转染siRNA降低HuR水平可有效降低HuR含量（<90%），并将TOP2A降低至其原始丰度的三分之一，而TOP2A公司mRNA水平保持不变(图1A和B）。相反，HuR过表达增加了TOP2A蛋白的水平，但没有TOP2A公司信使核糖核酸(图1C和D）。HuR同样促进了其他癌细胞中TOP2A的表达（未显示）。当HuR调节一些靶mRNA的翻译时(2)，我们测试了它是否与TOP2A公司mRNA。HuR核糖核蛋白（RNP）复合物的免疫沉淀（IP）后，从IP材料中分离RNA并进行RT-qPCR扩增TOP2A公司mRNA；对照反应包括免疫球蛋白和免疫球蛋白的IP和大量内务的测量GAPDH公司mRNA是所有RNP IP样本中存在的一种非特异性转录物，用于规范样本输入。该分析表明TOP2A公司HuR IP样本中的mRNA富集了约6倍(图1E） ●●●●。

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HuR与TOP2A公司mRNA并促进TOP2A翻译。（A和B）用Ctrl-siRNA或靶向HuR的siRNA（HuR-siRNA）转染HeLa细胞48小时后，对TOP2A、HuR和负载对照β-肌动蛋白进行Western blot分析（A），并检测其水平TOP2A公司mRNA相对于GAPDH公司通过RT-qPCR分析（B）计算mRNA。（C和D）用对照（pFlag）或HuR过度表达（pHuR-FlagTOP2A公司信使核糖核酸/GAPDH公司mRNA的RT-qPCR分析（D）。（E） RNP IP相互作用分析TOP2A公司mRNA与HuR结合使用抗HuR和小鼠IgG抗体。（顶部）TOP2A公司mRNA通过RT-qPCR检测并归一化为GAPDH公司mRNA水平（见材料和方法）。（底部）IP样品中HuR的Western blot（WB）分析。（F和G）通过蔗糖梯度（F）对从如A组所述转染细胞制备的裂解物进行分级TOP2A公司mRNA与对照GAPDH公司通过RT-qPCR分析10个梯度组分中每个梯度组分的RNA来研究mRNA（G）。箭头指示沉积方向。−，不含核糖体成分的组分；40S和60S，分别为大小核糖体亚基；80S，单体；LMWP和HMWP分别为低分子量和高分子量多聚体。在面板A和C中，通过密度测定法量化TOP2A水平；结果显示为平均值+标准偏差（SD）(n个= 5). 在面板B和D中，mRNA水平为平均值+SD(n个= 3). 在面板F和G中，数据代表了三个实验。**，P（P）<0.01。对于所有数据，使用Student’st吨测试。

为了测试HuR是否调制TOP2A翻译，我们研究了与TOP2A公司mRNA。通过蔗糖梯度对细胞质裂解产物进行分级，其中最轻的成分沉淀在顶部（组分1和2），小的（40S）和大的（60S）核糖体亚基和单体（80S）出现在组分3到5中，逐渐变大的多体从低分子量到高分子量（分别为LMWP和HMWP），分数为6到10(图1F） ●●●●。在Ctrl-siRNA细胞中TOP2A公司mRNA水平在第9组达到峰值，HuR沉默降低了多聚体的平均大小，在第8组达到峰值(图1G） ●●●●。尽管这种多聚体大小的变化一直被观察到，但相对来说是适度的，这表明可能其他翻译调控步骤（如翻译延伸）可能会因沉默HuR而受损。此外TOP2A公司编码区很长（~4.5kb），可能容纳多达50个核糖体；这么大TOP2A公司此处未检测到mRNA相关多聚体，表明TOP2A公司核糖体可能无法填充mRNA。相反TOP2A公司mRNA持续出现在8到10个组分中，表明TOP2A公司mRNA可能只被核糖体稀疏占据。GAPDH公司mRNA多聚体在两个转染组之间大量重叠。总之，这些发现表明HuR促进了TOP2A的翻译，至少部分是通过增强翻译起始。

为了确定HuR增强TOP2A翻译的机制，我们评估了HuR与TOP2A公司mRNA。TOP2A公司mRNA有一个短的5′UTR（0.1 kb），一个长的编码区（CR，～4.5 kb）编码一个～170-kDa蛋白，以及一个～1.0-kb长的3′UTR(图2A） ●●●●。光敏活性核糖核酸增强交联和免疫沉淀（PAR-CLIP）分析显示TOP2A公司3′UTR（J.D.Keene，个人沟通）；生物素下拉分析证实了HuR与这些位点相互作用，因为含有三个CLIP位点的生物素化RNAs B和C与HuR具有亲和力(图2B） ●●●●。HuR还与生物素化片段A和E相关，后者缺乏CLIP可检测到的HuR位点，这表明可能存在HuR与TOP2A公司3英尺UTR(图2B） ●●●●。

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HuR绑定到TOP2A公司3英尺UTR。（A） 的示意图TOP2A公司3′UTR描述了通过PAR-CLIP分析确定的HuR相互作用位点（蓝色文本和条纹）（J.D.Keene，个人通信）。生物素化转录物（A到E）在TOP2A公司3′UTR和TOP2A公司CR；生物素化对照GAPDH公司用3′UTR RNA检测背景结合。（B） 将等摩尔生物素化RNA与全细胞HeLa裂解物孵育后，取下RNP复合物并通过Western blot分析检测复合物中的HuR。输入5μg全细胞裂解物。（C） 通过克隆TOP2A公司3′UTR（全长或缺失HuR CLIP位点）进入质粒pEGFP，生成pEGFP-TOP2A（3′）和pEGFP/TOP2A的ΔHuR。（D） 用面板C中显示的质粒以及pFlag或pHuR-Flag转染细胞；16小时后，通过Western blot分析（顶部）评估表达的EGFP蛋白水平，通过密度测定法定量，标准化为α-微管蛋白水平，并绘制图表（底部）(n个= 5). （E） 在用面板C中显示的EGFP报告质粒转染的细胞中，HuR与表达的转录物的关联[EGFP公司mRNA与嵌合EGFP-TOP2A型（3′）和表皮生长因子p-TOP2A(3′)ΔHuR公司16小时后通过RNP IP分析测定mRNAs]。显示的是平均值+SD(n个= 3). *,P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01.

使用嵌合报告子构建物对这些相互作用进行进一步分析，该结构表达EGFP公司CR链接到任一全长TOP2A公司3′UTR[pEGFP-TOP2A（3′）]或TOP2A公司3′UTR缺失HuR结合序列[pEGFP-TOP2A（3′）ΔHuR](图2C） ●●●●。与从亲本质粒（pEGFP）表达的EGFP相比，HuR过表达使pEGFP-TOP2A（3′）的EGFP-报告蛋白水平增加了4倍，而从pEGFP-TOP2A(图2D） ●●●●。因此，HuR RNP IP分析显示EGFP-TOP2A型与对照组相比，HuR的（3′）mRNA富集了约4倍EGFP公司mRNA，而EGFP-TOP2A型(3′)ΔHuR公司mRNA仅增加了～2倍(图2E） ●●●●。总之，这些发现表明HuR通过与多个位点的相互作用增强了TOP2A翻译TOP2A公司3英尺UTR。

通过沉默HuR抑制TOP2A翻译与增加的共定位TOP2A公司mRNA与RISC和PBs。

上述结果表明TOP2A公司mRNA在没有HuR的情况下被翻译抑制。测试是否TOP2A公司mRNA与RISC机制相关，我们对RISC的关键成分Argonaute 2蛋白（Ago2）进行RNP IP分析(图3A） ●●●●。Ago2 RNP IP在TOP2A公司对照转染中的mRNA(图3A） 但在沉默HuR后，这种富集增加到～5倍。研究发现，沉默HuR增加了TOP2A公司带有Ago2的mRNA表明，HuR沉默可能通过微RNA介导的事件促进翻译抑制。

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TOP2A公司mRNA与microRNA衰变机制的成分和miR-548c-3p相互作用。（A） Ctrl-siRNA或HuR-siRNA转染48小时后TOP2A公司含Ago2复合物的mRNA通过RNP IP进行评估（见材料和方法）。（右）IP样品中Ago2的蛋白质印迹分析。（B） 表达MS2-标记RNA[pMS2，pMS2-TOP2A（3′）]和表达荧光报告蛋白（pMS2-YFP）的质粒示意图。（C） 用所示的siRNA转染HeLa细胞；48小时后，用B组所示质粒转染细胞，24小时后固定细胞进行分析。通过共聚焦显微镜分析来自MS2-YFP（绿色）和DCP1a（红色，通过免疫荧光检测）的荧光信号（见材料和方法）。合并后的图像显示MS2-YFP和DCP1a之间的重叠；共定位信号的焦点（黄色）用箭头表示。（图）统计并绘制每个转染组中MS2-YFP和DCP1a信号重叠的细胞数。（D） 在如C组所述转染的细胞中，通过使用抗YFP抗体的RNP IP分析测试所示微RNA的相互作用。通过RT-qPCR分析评估IP样品中的microRNA水平，并绘制pMS2-TOP2A（3′）转染细胞相对于pMS2-转染细胞的富集图。（E）TOP2A公司3′UTR描绘了miR-548c-3p位点（红色）和HuR CLIP位点（蓝色）；方框，互补性TOP2A公司mRNA和miR-548c-3p。在面板A、C和D中，数据是来自3个独立实验的平均值+SD。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01.

通过检测可追踪基因的亚细胞定位，进一步验证了这种可能性TOP2A公司mRNA携带MS2发夹[由质粒pMS2-TOP2A（3′）表达]。HeLa细胞与pMS2-TOP2A（3′）和质粒pMS2-YFP共转染，质粒pMS2-YFP表达一种嵌合报告蛋白（MS2-YFP，含有核定位信号[NLS]），能够与MS2-tagged RNA相互作用(图3B） ●●●●。然后通过荧光显微镜研究MS2标记RNA的分布。MS2级由于NLS的存在，由控制载体pMS2表达并由MS2-YFP蛋白检测到的mRNA为核（绿色信号）(图3C） ●●●●。MS2-TOP2A（3′）mRNA在对照（Ctrl-siRNA）细胞中也是核表达的，但HuR沉默导致HuR-siRNA组细胞质中出现点状绿色荧光灶；这些病灶部分与DCP1a（红色）共定位，DCP1a是RISC的另一个组件，用作PB标记，在合并图像中显示为黄色信号（箭头）。如图所示(图3C） 在HuR-沉默细胞中，MS2信号与Dcp1a-PB标记共定位的频率比对照细胞高2倍。这些发现表明，在降低HuR后发生的TOP2A翻译抑制与TOP2A公司带有RISC和PBs成分的mRNA，翻译沉默位点。

结果进一步表明，小RNA可能参与HuR沉默后的TOP2A翻译抑制。由于一些假定的microRNAs靶向TOP2A公司通过计算预测了3′UTR，我们设计了一种新的方法来测试TOP2A公司3′UTR与细胞相关环境中的微小RNA。细胞转染了图3B、 在MS2-YFP的RNP IP分析后，评估IP材料中的microRNA水平；其中，只有miR-548c-3p与MS2-TOP2A（3′）mRNA相对于MS2级信使核糖核酸(图3D和E）。总之，这些结果支持了这样的观点，即TOP2A表达的抑制与TOP2A公司信使核糖核酸与微小核糖核酸翻译抑制机制的组成部分。

HuR可减轻miR-548c-3p对TOP2A表达的抑制。

与miR-548c-3p可以抑制TOP2A翻译的假设相一致，HeLa细胞转染后miR-548-3p过度表达(图4A） 不会影响TOP2A公司mRNA，但TOP2A蛋白水平降低50%(图4C和D）。相反，转染设计用于补充Pre-miR-548c-3p的反义（AS）RNA(图4B） TOP2A蛋白水平增加，但不影响TOP2A公司mRNA水平(图4E和F）。市售抗鼠药没有效果（未显示）。miR-548c-3p招募TOP2A公司通过Ago RNP IP获得RISC的mRNA，因为HeLa细胞中miR-548c-3p的过度表达增加了Ago2与TOP2A公司信使核糖核酸(图4G） ●●●●。因此，通过培养HeLa细胞短时间（15分钟）来分析新生的TOP2A翻译[35S] Met/Cys，然后使用抗TOP2A抗体通过IP检测新合成的TOP2A蛋白，结果显示从头开始miR-548c-3p过度表达后TOP2A产量下降(图4H） ●●●●。类似地，用我-叠氮高丙氨酸随后用炔-生物素标记新生蛋白，并用Western blot分析检测新合成的蛋白（Click-iT方法），进一步表明miR-548c-3p降低了TOP2A翻译(图4一） ●●●●。总之，miR-548c-3p与TOP2A公司3′UTR并减少TOP2A转换。

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miR-548c-3p抑制TOP2A翻译。通过RT-qPCR分析，在转染Ctrl-siRNA、miR-548c-3p模拟物或（AS）miR-549c-3p（B）的细胞中检测（A和B）miR-54/3p水平。（C至F）转染Ctrl-siRNA、miR-548c-3p模拟物（C和D）或靶向Pre-miR-548c-3p（E和F）的siRNA 72小时后，TOP2A公司通过RT-qPCR分析评估mRNA水平，并将其归一化为GAPDH公司mRNA水平（C和E）和TOP2A丰度通过Western blot分析进行评估，并通过密度测定法（D和F）进行量化。（G） 协会TOP2A公司通过对转染miR-548c-3p或对照siRNA的细胞进行RNP IP分析，评估含Ago2复合物的mRNA。（H和I）从头开始用miR-548c-3p或对照siRNA转染的HeLa细胞中TOP2A和GAPDH的翻译通过35S-氨基酸掺入（H）或Click-iT分析（I）。（J） 在用Ctrl-siRNA或miR-548c-3p转染后TOP2A公司mRNA和GAPDH公司RNP IP分析检测HuR IP样品中的mRNA；（K）在Ctrl-siRNA或miR-548c-3p转染48小时后，用pFlag或pHuR-Flag质粒转染HeLa细胞，24小时后制备裂解物。通过Western blot分析评估TOP2A、HuR和对照α-微管蛋白的水平，P（P）< 0.05; **,P（P）<0.01（进行了3到5个独立实验）。对于面板C和D，n个=5；对于面板E至I、J和K，n个= 3; 对于面板D、F、H和I，P（P）< 0.05.

由于miR-548c-3p抑制TOP2A翻译，而HuR增强TOP2A翻译，我们推测这些分子可能是功能性拮抗剂。为了验证这个假设TOP2A公司通过RNP IP分析测定表达不同水平miR-548c-3p的细胞中HuR的mRNA。miR-548c-3p过度表达显著降低了HuR与TOP2A公司信使核糖核酸(图4J） 在增加HuR的同时，miR-548c-3p拯救了TOP2A的抑制(图4K） 如果miR-548c-3p水平同时降低（数据未显示），则通过沉默HuR来抑制TOP2A的作用被挽救。这些结果表明，HuR拮抗miR-548c-3p，从而增强TOP2A的表达。

测试miR-548c-3p是否通过其推测抑制TOP2A表达TOP2A公司3′UTR位点，我们比较了pEGFP与pEGFP-TOP2A（3′）的EGFP表达（携带TOP2A公司3′UTR）和来自一个在种子区有4个错配的突变报告子[pEGFP-TOP2A（3′mut）]来破坏miR-548c-3p结合(图5A、 顶部）。通过Western blot分析，miR-548c-3p过度表达并不影响pEGFP转染组的EGFP生成，但显著降低了pEGFP-TOP2A（3′）表达的EGFP(图5A、 底部）。重要的是，miR-548c-3p位点的突变完全消除了miR-549c-3p的抑制作用，表明miR-548 c-3p通过预测TOP2A公司3′UTR站点。

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miR-548c-3p促进了PB中TOP2A的定位。（A） 质粒pEGFP、pEGFP-TOP2A（3′）和pEGFP-TOP2A的示意图（3′mut）；最后一个质粒在TOP2A公司3′UTR干扰其与miR-548c-3p（盒）的相互作用。用Ctrl-siRNA或miR-548c-3p转染细胞后24小时，分别用三种报告质粒转染细胞；24小时后制备裂解物，通过Western blot分析评估EGFP水平。（B） 用Ctrl-siRNA或miR-548c-3p转染HeLa细胞；48小时后，细胞被转染图3B、 24小时后，固定细胞进行分析。共聚焦显微镜检测MS2-YFP（绿色）和DCP1a（红色）的荧光信号。在合并的图像中，定殖信号的焦点（黄色）用箭头表示。（C） miR-548c-3p水平与MS2-TOP2A（3′）和MS2-TOP2A通过RNP IP分析（使用IgG或抗YFP抗体）测定转染相应质粒的细胞中的（3′mut）。（D） miR-548c-3p的丰度与MS2-顶部2a（3′）按照面板C所述进行测量，但相互作用是在表达内源性HuR（pFlag）或过度表达HuR的细胞中进行测量（通过转染pHuR-Flag，如图1C） ●●●●。面板A中的数据代表了4个实验，面板C和D中的数据则代表了3个实验。**，P（P）< 0.01.

MS2标记RNA的分析表明，miR-548c-3p的过度表达增加了MS2-顶部2a（3′）mRNA（绿色），与PB标记DCP1a（红色）共定位(图5B、 合并列，箭头）。MS2-YFP RNP IP的进一步生化分析表明，miR-548c-3p优先与MS2-TOP2A（3′）RNA，但不含MS2级或MS2-TOP2A（3′mut）RNA(图5C） ●●●●。重要的是，miR-548c-3p与TOP2A公司当HuR过度表达时，3′UTR显著降低，进一步支持了HuR可能与miR-548c-3p竞争结合到TOP2A公司3英尺UTR(图5D） ●●●●。这些实验共同表明，miR-548c-3p通过特异性TOP2A公司3′UTR站点，miR-548c-3p招募TOP2A公司mRNA与细胞质PBs结合，HuR与miR-548c-3p竞争结合TOP2A公司mRNA。基于这些结果，我们认为TOP2A公司带有miR-548c-3p的mRNA通过Ago/RISC抑制其翻译（见下文所述模型），而HuR拮抗miR-548-3p，从而解除TOP2A翻译并允许TOP2A累积。

HuR和miR-548c-3p在G期间改变TOP2A水平2/并通过阿霉素调节DNA损伤。

我们通过监测G中的TOP2A水平来研究这些相互作用的后果2/M、 TOP2A上调的细胞周期阶段(19,39). 双胸苷阻滞释放的细胞内阻滞并通过G进展1、S和G2/M（M）(图6A） ，当大多数细胞处于G组时，TOP2A水平较高2/M（8小时，图6B） ，TOP2A公司mRNA水平似乎没有显著变化(图6C） 和miR-548c-3p水平与TOP2A呈负相关(图6D） ●●●●。在G被捕的牢房内2/诺康唑治疗16小时后，TOP2A和HuR升高，而TOP2A公司mRNA没有变化(图6E至G）；miR-548c-3p水平在G组最低2/米(图6H） ●●●●。因此，pEGFP-TOP2A（3′）的报告蛋白表达选择性较高(图6一） 表明TOP2A在G2/M可能是由于通过TOP2A公司3英尺UTR。这些结果支持以下假设：低水平的miR-548c-3p和高水平的HuR有助于提高G2/M。RNP IP分析进一步表明，在G2/诺康唑治疗M，TOP2A公司mRNA与HuR相关较多，与Ago2相关较少(图6J） ●●●●。反过来，沉默HuR或过度表达miR-548c-3p可以阻止G中TOP2A蛋白的增加2/对照（Ctrl-siRNA）细胞中的M(图6K） ●●●●。这些变化不是由于细胞周期分布的重大改变（未显示）。

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G中TOP2A增加2/M受较低miR-548c-3p和较高HuR水平的影响。（A） 荧光激活细胞分选仪（FACS）对HeLa细胞进行分析，这些细胞通过双胸腺嘧啶核苷阻断同步，并在指定的时间内释放（显示了每个阶段的细胞百分比）。（B至D）按A组所述处理的细胞用于Western blot分析，以评估TOP2A、HuR和对照β-肌动蛋白（B）的水平，并用于RT-qPCR分析，以量化TOP2A公司mRNA（C）和miR-548c-3p（D）。（E） 对未经处理（异步，Asyn.）或用诺卡唑处理（100 ng/ml，16 h）的HeLa细胞进行FACS分析；显示了每个细胞周期阶段的细胞百分比。（F） 从按面板E所述处理的细胞制备裂解物，并通过Western blot分析评估TOP2A、HuR和对照β-肌动蛋白的水平，并通过密度测定法进行量化。（G） 总RNA是从按照面板E所述处理的细胞中制备的TOP2A公司mRNA与正常化控制GAPDH公司通过RT-qPCR分析测定mRNA。（H） 通过RT-qPCR（归一化为U6 RNA）对诺卡唑处理16 H（G2/M组）或获释并测试8小时（G1)12小时（S）后。（一） 转染HeLa细胞的质粒如图2C用诺卡唑（100 ng/ml）处理，16小时后制备裂解物。EGFP水平的评估和绘制如以下所述图2D.（J）细胞未经处理（Asyn.）或用诺卡唑处理（100 ng/ml）；16小时后，制备裂解物TOP2A公司RNP IP分析测定HuR和Ago的mRNA。（K） 用Ctrl-siRNA、HuR-siRNA或miR-548c-3p转染细胞；48小时后，用诺卡唑处理细胞（100 ng/ml，16小时）或不处理细胞，通过Western blot分析评估TOP2A水平。对于面板B至D，n个= 2; 对于面板I，n个= 3. *,P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01.

最后，我们研究了调节TOP2A对DNA插入剂阿霉素（Dox）和TOP2毒物（稳定TOP2A与TOP2A产生的双链DNA断裂结合的复合物）的遗传毒性损伤的影响。当TOP2A水平高时，多氧治疗最有效(29)我们假设HuR或miR-548c-3p引起的TOP2A水平的变化可能会改变Dox的有效性。通过监测磷酸化H2AX（γ-H2AX）信号，Dox治疗显示对照细胞中存在广泛的DNA损伤(图7A） ●●●●。相反，通过过度表达miR-548c-3p或沉默HuR或TOP2A本身来降低TOP2A可降低γ-H2AX水平，表明降低TOP2A可改善Dox诱导的DNA损伤(图7A和B）。这种效应对Dox是特异性的，因为不靶向TOP2A的化疗药物，如顺铂，在转染组之间没有表现出不同的DNA损伤(图7C） ●●●●。此外，HuR的过度表达或miR-548c-3p的减少增加了Dox诱导的γ-H2AX信号，这一效应通过沉默TOP2A而得以缓解(图7B） ●●●●。

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低miR-548c-3p和高HuR水平影响阿霉素治疗后TOP2A的增加。（A和C）转染小RNA 72小时后，用阿霉素（1μM）（A）或顺铂（10μM）处理细胞或不处理；24小时后，通过Western blot分析评估γ-H2AX、HuR和β-actin水平，并通过密度测定法进行定量。（B） 用所示的小RNA和/或质粒转染细胞；48小时后，用Dox（1μM）处理细胞，24小时后通过Western blot分析评估γ-H2AX水平。（D） miR-548c-3p之间拟议的对抗示意图TOP2A公司mRNA到microRNA-RISC的阻遏机制，使Dox抵抗（底部）和HuR与miR-548c-3p竞争，并允许TOP2A翻译发生（顶部），因为我们假设TOP2A转换发生在G2/并使细胞对阿霉素敏感。对于面板A至C，n个= 3.

基于这一证据，我们提出了一个模型TOP2A公司带有miR-548c-3p的mRNA通过Ago/RISC导致其翻译抑制。HuR，可能与TOP2A公司3′UTR能拮抗miR-548c-3p，从而抑制TOP2A的合成并使TOP2A积累(图7D） ●●●●。总之，降低TOP2A水平的转录后因子（如miR-548c-3p）与增强TOP2A表达的转录后因素（HuR）竞争，可以有效调节主要化疗靶点TOP2A的水平，从而调节阿霉素的疗效。

讨论

我们报告说，翻译控制TOP2A丰度。The interaction of theTOP2A公司3′UTR和HuR促进了TOP2A的翻译，而与miR-548c-3p的相互作用抑制了TOP2A的翻译。用于鉴定miR-548c-3p作为TOP2A表达调节因子的方法值得注意。虽然生物信息学程序可以预测microRNA-mRNA的相互作用，但它们有很大的局限性。在这里，我们对MS2标记的RNA进行IP验证，以验证一些预测的microRNA-TOP2A公司有意义背景下的mRNA相互作用(图3B和D）。通过这种方法，我们确定miR-548c-3p是一种与TOP2A 3′UTR序列的特定位点相关的小RNA，并选择性抑制其翻译(图4). 内源性分析TOP2A公司mRNA和异源报告显示，HuR与miR-548c-3p竞争结合到TOP2A公司3′UTR，因为miR-548c-3p过表达或HuR沉默后miR-548 c-3p的结合普遍存在，而HuR过表达后miR-54 8c-3p的结合减少(图5). 我们进一步表明TOP2A公司带有HuR和miR-548c-3p的mRNA有效控制TOP2A翻译。特别有趣的是，这些TOP2A调节因子作用于TOP2A公司mRNA而不是通过影响TOP2A公司转录，因为转录本身可能受到基因毒性损伤的损害，而基因毒性损伤实际上可能需要TOP2A才能解决。相反，microRNA和RBP可以作用于已经合成的TOP2A公司mRNA调节TOP2A蛋白的产生。

由于RBP和microRNAs共存于共享的靶mRNAs上，人们对阐明它们的功能相互作用越来越感兴趣(9,16,22). 与迄今为止报道的大多数其他微RNA一样，miR-548c-3p与TOP2A公司3′UTR序列并选择性抑制其翻译；该位点的突变消除了miR-548c-3p的抑制作用(图5A） ●●●●。相反，HuR与TOP2A公司3英尺UTR(图2); HuR的竞争取决于一个还是几个TOP2A公司3′UTR相互作用区域尚待确定。HuR的沉默引发了TOP2A公司mRNA相关多聚体(图1G） 并导致可追踪的TOP2A公司转录成PB(图3C） ●●●●。

虽然分析标记RNA的局限性在于它必须在体外表达，但MS2标记系统已被证明对研究感兴趣的RNA的生化相互作用和亚细胞定位特别有价值。例如，它用于识别与特定mRNA相互作用的RBP，以及研究特定转录物在酿酒酵母和哺乳动物细胞(6,8,18,32). 在本报告中，细胞质MS2-TOP2A沉默HuR后的mRNA信号(图3C） 或过度表达miR-548c-3p后(图5B） 与PB标记DCP1a（黄色合并信号）共定位。鉴于microRNAs和PBs之间的联系，这一发现意义重大(10). 一些DCP1a信号与MS2-顶部2a（3′）支持含有DCP1a的病灶（如PB）是异质性的概念(14,17).

总之，我们的结果表明，在G2/M至少部分是由于其3′UTR介导的TOP2A翻译增加，与其翻译增强子HuR表达增加和翻译抑制子miR-548c-3p表达减少有关。阐明控制TOP2A表达的机制也可能在癌症治疗中具有重要意义。当TOP2水平升高时，TOP2会毒化阿霉素和足叶乙甙，产生包括DNA断裂和共价结合蛋白在内的损伤。高水平的这些复合物阻止DNA复制和转录，从而触发细胞凋亡(28). 鉴于这种作用机制，癌细胞能够降低TOP2的表达水平，从而对TOP2靶向药物产生耐药性(37)，尽管实现这一减少所需的具体过程尚不清楚。在这方面，测试HuR水平的降低或miR-548c-3p水平的增加是否有助于在对TOP2毒素产生耐药性的细胞中发现TOP2A丰度的降低，将是一件有趣的事情。相反，TOP2的水平与TOP2毒药的疗效相关(34)而体外降低TOP2对阿霉素产生耐药性(11). 根据这一证据和我们在这里描述的结果，似乎有利于选择性地增加HuR或降低miR-548c-3p水平，以提高暴露于TOP2毒物的细胞中TOP2A的丰度。此外，癌症中高水平的HuR可能是对阿霉素产生强烈反应的预测因素，而相反，TOP2A公司导致HuR结合降低的3′UTR突变可能导致阿霉素耐药。我们希望在不久的将来对这些问题进行调查。如TOP2A所示，我们的研究结果强调了RBP和microRNA在控制DNA复制和癌症治疗的关键因子转录后表达中的作用。

致谢

我们感谢J.D.Keene和N.Mukherjee分享未发表的结果。

这项研究得到了NIA-IRP（NIH）的支持。R.K.、R.P.和D.C.获得了巴尔奖和NCI的支持R01CA142698号。

脚注

▿2011年7月18日提前出版。

参考文献

1Abdelmohsen K.，Gorospe M.，2011年。HuR对癌症性状的转录后调控。电线RNA 1: 214–229[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
2Abdelmohsen K.、Kuwano Y.、Kim H.和Gorospe M.，2008年。氧化应激期间RNA-结合蛋白的转录后基因调控：对细胞衰老的影响。生物化学。 389: 243–255[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
三。Abdelmohsen K.等人，2007年。Chk2对HuR的磷酸化调节SIRT1的表达。分子电池 25: 543–557[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4Abdelmohsen K.，Srikatan S.，Kuwano Y.，Gorospe M.，2008年。miR-519通过降低RNA-结合蛋白HuR水平降低细胞增殖。程序。国家。阿卡德。科学。美国。 105: 20297–20302[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
5Ambros V.2004年。动物microRNA的功能。自然 431：350–355[公共医学][谷歌学者]
6Bachler M.，Schroeder R.，von Ahsen U.，1999年。StreptoTag：一种分离RNA结合蛋白的新方法。核糖核酸 5: 1509–1516[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Bartel D.P.2009年。MicroRNAs：目标识别和调节功能。单元格 8: 215–233[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
8Bertrand R.等人，1998年。活酵母中ASH1 mRNA颗粒的定位。分子电池 2：437–445[公共医学][谷歌学者]
9Bhattacharyya S.N.、Habermacher R.、Martine U.、Closs E.I.、Filipowicz W.，2006年。微RNA介导的翻译抑制在受应激的人类细胞中的缓解。单元格 125: 1111–1124 [公共医学][谷歌学者]
10Bhattacharyya S.N.、Habermacher R.、Martine U.、Closs E.I.、Filippowicz W.，2006年。应激诱导的人类细胞microRNA阻遏和mRNA P-body定位的逆转。冷泉港交响乐团。数量。生物。 71: 513–521 [公共医学][谷歌学者]
11Burgess D.J.等人，2008年。拓扑异构酶水平决定体内外化疗反应。程序。国家。阿卡德。科学。美国。 105: 9053–9058[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Champoux J.J.2001年。DNA拓扑异构酶：结构、功能和机制。每年。生物化学评论。 70: 369–413 [公共医学][谷歌学者]
13Chekulaeva M.，Filipowicz W.，2009年。miRNA介导的动物细胞转录后调控机制。货币。操作。细胞生物学。 21: 452–460 [公共医学][谷歌学者]
14Decker C.J.，Parker R.2006年。CAR-1和拖车挂接装置：在ER处驱动mRNP颗粒功能？ 《细胞生物学杂志》。 173: 159–163[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Dieterich D.C.、Link A.J.、Graumann J.、Tirrell D.A.、Schuman E.M.，2006年。利用生物正交非标准氨基酸标签（BONCAT）选择性鉴定哺乳动物细胞中新合成的蛋白质。程序。国家。阿卡德。科学。美国。 103: 9482–9487[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16Eiring A.M.等人，2010年。miR-328作为RNA诱饵调节白血病细胞中hnRNP E2对mRNA翻译的调节。单元格 140: 652–665[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
17Fujimura K.、Katahira J.、Kano F.、Yoneda Y.、Murata M.，2009年。PCBP2在细胞质加工体中的选择性定位。生物化学。生物物理学。学报 1793: 878–887 [公共医学][谷歌学者]
18Fusco D.等人，2003年。单个mRNA分子在活的哺乳动物细胞中显示出概率运动。货币。生物。 13: 161–167[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
19Heck M.M.，Hittelman W.N.，Earnshaw W.C.，1988年。真核细胞周期中DNA拓扑异构酶I和II的差异表达。程序。国家。阿卡德。科学。美国。 85: 1086–1090[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Hinman M.N.，Lou H.2008。Hu蛋白的多种分子功能。单元格。分子生命科学。 65: 3168–3181[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21Kim H.H.等人，2008年。Cdk1磷酸化引起的核HuR积累。基因发育。 22: 1804–1815[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Kim H.H.等人，2009年。HuR招募let-7/RISC抑制c-Myc表达。基因发育。 23: 1743–1748[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Kloosterman W.P.，Plasterk R.H.2006年。小RNA在动物发育和疾病中的多种功能。开发单元 11: 441–450 [公共医学][谷歌学者]
24Lal A.等人，2004年。HuR和AUF1与共同不稳定靶mRNA的同时结合与个体结合。EMBO J。 23: 3092–3102[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Lee E.K.等人，2010年。hnRNP C通过与FMRP竞争APP mRNA对P体的补充来促进APP翻译。自然结构。分子生物学。 17: 732–739[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
26López de Silanes I.等人，2003年。RNA-结合蛋白HuR在结肠癌发生中的作用。癌基因 22: 7146–7154 [公共医学][谷歌学者]
27López de Silanes I.，Zhan M.，Lal A.，Yang X.，Gorospe M.M.2004。RNA-结合蛋白HuR靶RNA基序的鉴定。程序。国家。阿卡德。科学。美国。 101: 2987–2992[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
28Nitiss J.L.2009年。DNA拓扑异构酶II及其日益增长的生物功能。Nat.Rev.癌症 9: 327–337[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
29Nitiss J.L.2009年。靶向DNA拓扑异构酶II在癌症化疗中的应用。Nat.Rev.癌症 9: 338–350[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30Parsons G.G.，Spencer C.A.1997年。RNA聚合酶II转录的有丝分裂抑制伴随着转录延伸复合物的释放。分子细胞。生物。 17: 5791–5802[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31波特·A·C、法尔·C·J·2004。拓扑异构酶II：解开其在着丝粒的贡献。染色体研究。 12: 569–583 [公共医学][谷歌学者]
32Shav-Tal Y.等人，2004年。活细胞细胞核中单个mRNPs的动力学。科学类 304: 1797–1800[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Shimogawa M.M.、Widlund P.O.、Riffle M.、Ess M.、Davis T.N.，2009年。张力检查点需要Bir1。分子生物学。单元格 20：915–923[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
34Smith K.、Houlbrook S.、Greenall M.、Carmichael J.、Harris A.L.，1993年。人类原发性乳腺癌和乳腺癌细胞系中拓扑异构酶IIα与erbB2共扩增与m-AMSA和米托蒽醌敏感性的关系。癌基因 8: 933–938 [公共医学][谷歌学者]
35Srikatan S.、Gorospe M。HuR在疾病中的作用。前面。Biosci公司。，出版中[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
36Stefani G.，Slack F.J.2008年。动物发育中的非编码小RNA。自然修订版分子细胞生物学。 9: 219–230 [公共医学][谷歌学者]
37Walker J.V.，Nitiss J.L.，2002年。DNA拓扑异构酶II作为癌症化疗靶点。癌症投资。 20: 570–589 [公共医学][谷歌学者]
38王建忠，1998年。通过II型DNA拓扑异构酶将一个DNA双螺旋穿过另一个：一个简单分子机器的故事。Q.生物物理学评论。 31: 107–144 [公共医学][谷歌学者]
39Woessner R.D.、Mattern M.R.、Mirabelli C.K.、Johnson R.K.、Drake F.H.1991年。NIH-3T3细胞中170千道尔顿和180千道尔顿拓扑异构酶II表达的增殖和细胞周期依赖性差异。细胞生长不同。 2: 209–214 [公共医学][谷歌学者]
文章来自分子和细胞生物学由提供泰勒和弗朗西斯