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基因发育。1999年3月15日；13(6): 709–717.
数字对象标识：10.1101/gad.13.6.709
PMCID公司：项目经理316557
PMID：10090727

Wnt3a型−/−-类表型与肢体缺陷勒夫1−/−Tcf1型−/−老鼠

胡安·加尔塞兰,1 伊莎贝尔·法利尼亚斯,1,4 迈克尔·德普,2 汉斯·克利夫斯,三和鲁道夫·格罗舍尔1,5
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

LEF-1/TCF转录家族成员Wnt信号的转导与多种因素有关。然而，靶向基因失活Lef1、Tcf1、，或四氟化碳在小鼠中不产生任何类似于已知Wnt（重量）突变。这里我们显示了两种基因的空突变勒夫1和Tcf1型，表示为重叠早期小鼠胚胎中的模式，导致近轴中胚层的分化导致额外的神经管，表型与报告的相同Wnt3a缺乏小鼠。此外，勒夫1−/−Tcf1型−/−胚胎在胎盘形成和肢体芽的发育，两者都不能表达Fgf8型和形成顶端外胚层脊。这些数据共同提供LEF-1和TCF-1在Wnt信号传导中冗余作用的证据在小鼠发育过程中。

关键词：LEF-1、TCF-1、Wnt、肢体发育、中胚层区别

Wnt/wg蛋白的信号传导参与细胞命运决定和细胞增殖的调节（供审查，看见Cadigan和Nusse 1997年;Moon等人，1997年).LEF-1/TCF转录因子家族成员可以与Wnt的下游成分β-连环蛋白相互作用信号通路，激活转录。迄今为止该家族已在哺乳动物中鉴定出来；淋巴增强因子-1（LEF-1）、T细胞因子-1（TCF-1），TCF-3和TCF-4(Travis等人，1991年;Waterman等人，1991年;van de Wetering等人，1991年;Korinek等人。1998年a). 所有四种蛋白质都有一个几乎相同的DNA结合结构域β-catenin相互作用域。这些转录因子可以与β-catenin和in相关的基因表达增加组织培养转染试验中Wnt-1信号转导的反应(厢式货车de Wetering等人，1997年;Hsu等人，1998年;Korinek等人，1998年a). 在此外，LEF–1/TCF蛋白可以与蛋白CBP和Groucho，在缺乏Wnt/wg信号(Cavallo等人，1998年;Levanon等人，1998年;Roose等人，1998年;Waltzer和Bienz 1998). 最后，LEF-1可以相互作用蛋白ALY并在多蛋白增强子复合物的组装(Bruhn等人，1997年).

与这些转录因子在Wnt/wg信号传导果蝇属的正交勒夫1产生无翼（wg）表型(布伦纳等人，1997年;van de Wetering等人，1997年). 然而哺乳动物转录因子在体内Wnt蛋白信号传导中的作用由于Lef1、Tcf1,或四氟化碳基因没有产生任何类似的表型已知Wnt突变。勒夫1−/−小鼠牙齿、毛囊和乳腺，在Tcf1型结果在T淋巴细胞分化不完全停止四氟化碳−/−小鼠在以下方面有缺陷小肠的发育(Korinek等人，1998年b). 在相反，在Wnt3a型和重量4基因，在早期小鼠胚胎中表达表达勒夫1和Tcf1型，导致分别形成近轴中胚层和肾脏(Stark等人。1994;Takada等人，1994年). 表达式中的部分重叠勒夫1和Tcf1型在小鼠发育中(Oosterwegel等人al.1993年)因此，提出了一个问题，即基因冗余可以解释缺乏Wnt（重量）-类表型携带任一转录因子基因靶向突变的小鼠。

结果

Lef1和小鼠早期胚胎中的Tcf1

更详细地比较个体的表达模式Lef1/Tcf小鼠早期发育中的基因使用特异于这个基因家族的四个已知成员（图。​（图11).勒夫1和Tcf1型都在E8.5胚胎的原始条纹，而三氟化碳和四氟化碳主要表达在前原基-和中脑。在E8.5胚胎中三氟化碳也可以是在后脑的原基和形成的体节中检测到。在E9.5胚胎中，额外重叠勒夫1和Tcf1型在前肢和鳃弓中检测到表达，与之前的切片原位杂交分析一致胚胎的数量(Oosterwegel等人，1993年). 因此，勒夫1和Tcf1型，但不是基因家族的其他成员在原始条纹和肢芽中以重叠模式表达。

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LEF-1/TCF成员的表达小鼠早期发育中的转录因子家族。表达式在胚胎第8.5天（E8.5）和E9.5天通过全量分析cDNA探针原位杂交勒夫1(a、 c（c）),Tcf1型(b、 d日),三氟化碳(e、 克)、和四氟化碳(f、 小时). 在E8.5胚胎中勒夫1和Tcf1型主要在原始条纹中检测到（PS）和E9.5胚胎在原始条纹中检测到表达和未分段的青春期前中胚层、前肢芽（FL）和鳃弓。三氟化碳在新形成的体节和前脑、中脑和后脑的原基。的表达式Tcf4型E9.0处(（f）)在中检测到中脑，位于视屏周围，位于间脑和正在形成的后肠。

我们通过生成携带两个基因的空等位基因的复合纯合小鼠。勒夫1−/−Tcf1型−/−胚胎恢复的频率在E6.5到9.5之间，但E10.5后其频率显著降低。扫描电子E9.5胚胎的显微镜检查显示复合突变纯合子（图。​（图2a、b）。2a、 b）。此外，突变胚胎的尿囊形成异常的细胞团，这可能与E10.5突变动物缺乏胎盘有关（未显示数据）。突变胚胎的端脑囊泡是也比野生型胚胎小。E9.5的组织学分析Lef1型−/−Tcf1型−/−胚胎证实了尾部缺陷并显示出严重缺陷体节的形成（图。​（图2d）。2d） ●●●●。位于前肢芽、体节形态异常（图。​（图2f），然而2f） ，而在尾部区域没有发现体节，这是高度变形并包含多个管状结构（图。​（图2d）。横向2d） ●●●●。尾部区域的横切面证实缺乏体节并在突变体中发现了多个（多达五个）管状结构胚胎（图。​（图2h）。2h） ●●●●。该表型表明前（近轴）中胚层的形成。中胚层首先形成在原肠胚形成期间，当细胞从外胚层分层进入胚胎后部的原始条纹。在原始条纹，空间定义的前兆产生不同中胚层命运，如轴向、近轴、中间和侧向中胚层(Tam and Beddington 1987年,1992). 突变胚胎含有侧中胚层和内脏中胚层（图。​（图2h）2h） 有一颗心背外侧中胚层衍生物（图。​（图2d），2d） 暗示着缺席LEF-1和TCF-1影响特定中胚层的分化单元格类型。

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携带靶向空区的胚胎尾部缺陷两者的突变勒夫1和Tcf1型基因。(a、 b条)E9.5的扫描电子显微镜（SEM）野生型(一)和勒夫1−/−Tcf1型−/−(b条)室友。在突变胚胎中，可以检测到体节直到前肢（FL），但不在尾部区域。尾部尾部末端（T）出现异常形态，变形比野生型小得多。突变胚胎也有一个较小的端脑小泡（TE）和较不明显的峡部（I）在中脑和后脑之间。标记为A的细胞的质量对应于尿囊的残余物，尿囊未与胎盘（数据未显示）。E9.5矢状切面的组织学野生型（wt；c、 电子)和勒夫1−/−Tcf1型−/−(d、 （f）)胚胎。Somites和发育良好的心脏（H）可见于野生型胚胎。在突变胚胎中，没有在畸形的尾侧半部可以检测到可识别的体节胚胎，包含多个神经管样结构（NT）。然而，突变胚胎有一个心脏(d日). 在该地区前肢水平前方（支架内c、 d日)在野生型和突变型胚胎中都可以检测到体节(e、 （f）). 然而，突变胚胎中的体节有结构不完整，缺乏清晰的节段边界。(g、 小时)E9.5野生型和尾部水平的突变胚胎通常是第一个体节在突变胚胎中(小时)三个神经管是检测。正常的外侧中胚层（LM）和内脏中胚层（VM）在突变胚胎中形成。（箭头）脊索的位置。(a–f)罗斯特拉尔是为了左边和尾端正确的.

近轴中胚层分化缺陷勒夫1−/−Tcf1型−/−胚胎

进一步确定双突变体中胚层缺陷胚胎，我们用几个识别特定中胚层细胞群的探针（图。​（图3）。三). 硬化标记的表达，Pax1型，在前肢萌芽，尽管水平降低（图。​（图3b）。三b） ●●●●。不Pax1型表达于前肢芽，与尾部体节的缺乏一致。Pax3型转录本，通常发现于青春期前轴旁中胚层、皮肌层和背神经管在前肢水平前方的皮肌节和尾部区域（图。​（图3d）。三d） ●●●●。横截面显示杂交模式Pax3型在尾部区域代表多根管子的背半部，而不是皮肤肌节（图。​（图3f）。此外，三f） ●●●●。此外，突变胚胎未能表达槽口1在中云前中胚层形成区域（图。​（图3h），三h） ，尽管表达式在神经管中检测到（图。​（图3j）。三j） ●●●●。我们还检查了表达属于Wnt5a型，通常在尾芽区表达形成轴旁中胚层(Tam and Beddington 1987年,1992;Takada等人1994年). 不Wnt5a型在尾芽区域检测到表达勒夫1−/−Tcf1型−/−胚胎（图。​（图3l）。三l） ●●●●。检查管道结构的一致性的尾部区域勒夫1−/−Tcf1型−/−胚胎，我们分析了重量1作为标记背部中枢神经系统(Parr等人，1993年;Takada等人，1994年). 在突变胚胎中，重量1CNS中的表达普遍增加在尾侧的多条和簇状细胞中也有发现区域（图。​（图3n）。三n） ●●●●。此外突变胚胎显示，每个小管的背侧部分结构包含重量1-表达细胞（图。​（图3p）。三p） ●●●●。因此，勒夫1−/−Tcf1型−/−胚胎似乎缺乏前肢后面的近轴中胚层水平，形成异位神经管与报告的相同Wnt3a型−/−老鼠(高田等人，1994年;Yoshikawa等人，1997年).

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中胚层和神经标志物的表达野生型和勒夫1−/−Tcf1型−/−胚胎。分子标记的全原位分析E9.5胚胎杂交。硬化标记，Pax1型,在整个野生型中表现出有规律的体毛细胞表达模式胚胎，而只有9个体节检测到弱表达突变胚胎前肢水平（箭头）前方(a、 b条).Pax3型，通常表示为突变体中表达背神经管和皮肌层胚胎位于前肢水平尾端的非节段模式（箭头；c、 d日). 尾侧的横截面这些胚胎的区域（细线）如所示e（电子）和f、。Pax3型在皮肤肌层和背部检测到表达野生型胚胎的神经管和突变胚胎。的表达式槽口1在未分段的在野生型中观察到了粒前中胚层（PM；括号），但在突变胚胎(g、 小时).槽口1表达式是也在野生型胚胎的前肢芽中检测到（克)，但在突变胚胎的前肢芽中没有（箭头；小时). 的表达式槽口1在神经中在野生型和突变型的横切面上都检测到试管胚胎(i、 j个). 在突变胚胎中神经管没有闭合。的表达式Wnt5a型在中在野生型胚胎中检测到胚前中胚层(k个)但不是在突变胚胎中(我). 的表达式Wnt5a型也在前肢芽（箭头）中检测到野生型，但不是突变胚胎。(百万英镑)表达模式中枢神经系统背侧标志物，重量1，全悬置杂交在尾侧区域的横截面上通过一条细线。重量1在野生型大脑中表达和突变胚胎处于类似水平，但在突变胚胎的中枢神经系统。前肢后方区域突变胚胎的水平，额外的信号可以检测到细胞的条带和斑块（箭头；n个)代表开放式神经管和三个附加神经管(第页). 这个胸膜前中胚层标记，Tbx6型，在尾芽中表达和野生型的胚前中胚层，但不是突变胚胎(q、 第页).

然而，在小鼠突变体Fgfr1级−/−嵌合体以及携带突变基因的胚胎Tbx6型基因(邓等人1997年;查普曼和波帕约阿努1998). 特别是T-box转录因子基因突变，Tbx6型，其中与相关Brachyury公司也会导致近轴中胚层缺陷与在Wnt3a型−/−和勒夫1−/−Tcf1型−/−胚胎(Chapman等人，1996年;查普曼和帕皮奥安诺1998). 因此，我们检查了Tbx6型没有检测到任何表达在勒夫1−/−Tcf1型−/−胚胎（图。​（图3r）。三r） ●●●●。这种缺乏可检测性Tbx6型表达在复合纯合子突变胚胎的尾芽区域，表明正常表达的细胞Tbx6型缺失，和/或或者，LEF-1/TCF-1和Wnt信号可能作用于Tbx6型.因为的表达式Tbx6型在E9.5胚胎中要求Brachyury公司(Chapman等人1996)，我们有确定为LEF-1/TCF蛋白的直接靶点（J。Galceron，S.C.Hsu和R.Grosschedl，未提交），我们赞成这样的观点LEF-1/TCF蛋白作用于Tbx6型.

为了解决异位神经管是否在近轴中胚层的支出，如图所示Wnt3a型−/−老鼠(Yoshikawa等人。1997)，我们检查了野生型和勒夫1−/−Tcf1型−/−E8.5胚胎，细胞进入原始细胞的阶段条纹(Tam and Beddington 1987年). 在原始条纹区，间充质形态的中胚层细胞在野生型胚胎的外胚层下检测到，而只有上皮形态和管状的密集细胞在突变胚胎中发现了排列（图。​（图4a、b）。我们4a、 b）。我们还检测了尾核的增殖和凋亡是否发生改变的区域勒夫1−/−Tcf1型−/−通过计算分裂细胞和凋亡细胞的数量来获得胚胎。不在野生型和突变型胚胎之间检测到显著差异（未显示数据）。因此，异位神经管似乎形成于近轴中胚层的费用。基础单元格的生成原始外胚层表明勒夫1−/−Tcf1型−/−突变小鼠上皮细胞分层无明显缺陷在以下方面受损Fgfr1级−/−突变小鼠(Deng等人，1997年).因此勒夫1−/−Tcf1型−/−胚胎可能发生在随后的分化阶段。

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神经组织异位形成勒夫1−/−Tcf1型−/−以牺牲近轴中胚层为代价的胚胎。(a、 b条)野生型和野生型原始条纹区的组织学分析突变E8.5胚胎。原始外胚层（PE）下面的细胞野生型胚胎具有间充质形态(一)和突变胚胎的致密上皮形态(b条). 这个显示了背主动脉（DA）和原始肠道（PG）的位置。(c–f). 的表达式Wnt3a型在原始条纹中E8.0野生型的（PS）区域(c（c）)和突变胚胎(d日). 在由水平线，Wnt3a型可以在原始外胚层（PE）和皮下上皮细胞团突变胚胎的原始外胚层(d日). (克)的表达式勒夫1在节前中胚层。检测LEF-1蛋白与多克隆抗LEF-1免疫组化E8.5野生型胚胎横切面中的血清原始条纹区域。细胞命运示意图在缺少或存在Wnt3a、LEF-1和TCF-1。

近轴中胚层缺损的惊人相似性勒夫1−/−Tcf1型−/−小鼠和Wnt3a型−/−饲养的小鼠这些基因是否在反馈回路中相连的问题。我们检查了Wnt3a型在E8.5胚胎和在野生型和勒夫1−/−Tcf1型−/−胚胎，与LEF-1和TCF-1下游的功能一致Wnt3a型.在横截面中，Wnt3a型表达式是仅在野生型胚胎的原始外胚层中检测到，而在突变体的异位神经组织中也发现了这种蛋白胚胎（图。​（图4e、f）。4e、 f）。虽然在与野生型胚胎相比，复合突变胚胎更受欢迎认为扩展表达式是由于生成过度的神经外胚层以中胚层为代价，而不是损失负面监管，这已被证明在缺乏监管的情况下发挥作用Wnt信号的(Cavallo等人，1998年;Waltzer和Bienz 1998). 最后，我们检测了原始条纹中哪些细胞含有LEF-1蛋白。通过用抗LEF-1抗体对E9.5胚胎进行免疫组化，我们发现在胸膜前中胚层和体节，但不在原始外胚层（图。​（图4g）。4g） ●●●●。此表达式模式与近轴中胚层模型一致细胞在原始细胞中迁移的分化streak上调LEF-1的表达，并能胜任Wnt3a信号来自外胚层细胞，假设为中胚层神经外胚层细胞的命运。

肢体发育停止勒夫1−/−Tcf1型−/− 胚胎

勒夫1和Tcf1型也表示为重叠E9.5胚胎前肢芽中的模式。早期肢芽从车身侧壁突出，由侧板组成中胚层和外胚层。随着肢芽的发育信号中心的形成需要适当的扩展和肢体的图案(约翰逊和塔宾1997;Martin 1998年). 顶端外胚层嵴（AER）是一种特殊的上皮结构位于芽的远端边缘。在鼠标中，AER表示至少四个Wnt（重量）基因(重量3,重量4，重量6、和重量7b)和四个成纤维细胞生长因子(纤维细胞生长因子)基因(Fgf2、Fgf4,Fgf8、Fgf9)（有关审查，请参阅Martin 1998年). 在下伏远端中胚层，包括进展区和含有肢体间充质细胞的前体，段塞,Fgf10型、和Msx1型表示。Msx1型整个前部和后部也有转录本保证金(Ros等人，1992年). 极化活动区（ZPA）为定义为声波刺猬在后缘的表达bud（有关审查，请参阅Johnson和Tabin 1997年;Martin 1998年). 此外，已知肢芽的背外胚层会产生以下信号调节背腹（D–V）轴，其特征是的表达式Wnt7a型(Parr等人，1993年;帕尔和麦克马洪1995).Wnt5a型在腹肢外胚层表达并在肢体间质中分级(Parr等人，1993年).勒夫1在肢芽的间质中有表达，但不在AER中，而Tcf1型在两个间质中表达和AER(Oosterwegel等人，1993年).

E9.5野生型和野生型前肢芽的形态分析勒夫1−/−Tcf1型−/−扫描电子显微镜显示突变胚胎突变胚胎含有明显较小的新生肢芽比野生型肢芽（图。​（图5a、b）。5a、 b）。我们分析了AER和远端中胚层分子标记的表达。杂交E9.5野生型和突变胚胎的组织切片用一个Pax3型探针，表明来自皮肤肌体的细胞含有推测的肢体肌肉前体，迁移到外侧野生型和突变型胚胎的板中胚层（图。​（图5c、d）。然而，5c、 d）。然而，早期AER标记Fgf8型大量表达于野生型胚胎，但突变胚胎中没有（图。​（图5e、f）。5e、 f）。此外，我们检查了雕刻1(英语1)，其中是肢芽D–V极性的标记，在腹外胚层甚至在AER形成之前(帕尔和麦克马洪1995;Loomis等人，1996年).英语1也表示为中脑/后脑边界，是Wnt-1的靶点信号(达涅利安和麦克马洪1996). 在勒夫1−/−Tcf1型−/−胚胎，英语1虽然在前肢芽中不表达中脑/后脑有丰富的表达边界（图。​（图5g，h）。5g、 h）。维护英语1中的表达式中脑/后脑边界提示Wnt1信号转导胚胎的这个区域由另一个LEF-1/TCF转录因子家族，或独立于这些蛋白质。

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肢体芽缺陷勒夫1−/−Tcf1型−/−胚胎。(a、 b条)前肢野的形态学野生型和突变型胚胎。E9.5胚胎的SEM照片显示前肢水平的颈胸区。发育良好的肢芽（LB）见于野生型胚胎，而Lef1型−/−Tcf1型−/−胚胎只显示侧板有突起的迹象前肢芽区的中胚层。突变胚胎显示体节位于头侧，但不位于预期前肢芽的尾部。这个突变胚胎的体节（S）被外胚层覆盖类似于神经管背部的覆盖物。(c、 d日)野生型和突变型的横切面与之杂交的前肢芽（FL）水平的胚胎Pax3型野生型和突变型胚胎都显示Pax3型向侧板表达肌源性前体中胚层。（NT）神经管。(e–l型)分子分析E9.5野生型和突变型胚胎的标记杂交。的表达式Fgf8型，一个早期标记在发育中的前肢芽中检测到野生型的AER(e（电子）)但不是突变胚胎(（f）). （箭头）位置前肢芽在这些和其他面板中。(g、 小时)的表达式英语1在中检测到野生型而非突变型前肢芽的腹面区域。然而，英语1在中后脑边界检测到表达。(i、 j个)的表达式长x1b，的标记新生肢芽的背间充质(Cygan等人，1997年)是在野生型和突变型胚胎中都检测到。然而，该地区属于长x1b突变体肢芽中的表达增加的级别长x1b与野生动物相比，表达水平较低型肢芽。的表达式长x1b在中后脑突变胚的边界不受影响。(k、 我)胚胎肢芽水平的横切面如图所示在(我和j个)用坚牢的中性红染色。长x1b表达仅限于背侧间质野生型肢芽(我)而是沿着整个肢体延伸突变胚的边缘(j个).

缺少可检测的英语1在肢芽中的表达可能也反映了肢体的背向化(Cygan等人，1997年;卢米斯et1998年). 因此，我们检查了长x1b,比如Wnt7a型参与背部细胞命运的决定(Riddle等人，1995年;Vogel等人，1995年;Cygan等人，1997年).长度mx1b在化合物的肢芽中检测到表达突变胚胎（图。​（图5j），5j） 尽管表达水平较低相对于野生型胚胎，表达区域变宽（图。​（图5i）。5i） ●●●●。在野生型肢芽的横切面上，长x1b仅限于背部间质（图。​（图5k），然而5k） ，而在背侧和腹侧间质中都有表达勒夫1−/−Tcf1型−/−肢芽（图。​（图5l）。5l） ●●●●。这种模式长x1b表达式是让人联想到早期的肢芽和缺乏D–V边界已证明导致无法形成AER(约翰逊和塔宾1997). 最后，我们检测了中胚层标记的表达Msx1型并发现在突变体肢芽和表达域变宽（数据不如图所示）。这拓宽了长x1b和Msx1型可能反映出区域规范的缺陷四肢萌芽Lef1型−/−Tcf1型−/−胚胎。的表达式Wnt5a型，通常表示为腹肢外胚层和肢间质(Parr等人。1993)在中未检测到勒夫1−/−Tcf1型−/−肢芽（图。​（图3l）。三l） ●●●●。综上所述，这些数据表明转录因子LEF-1和TCF-1也调节多余的方式。

讨论

我们的研究表明转录因子的空突变基因勒夫1和Tcf1型导致近轴中胚层的形成，与之几乎相同在Wnt3a缺乏小鼠中可见。特别是Lef1型−/−Tcf1型−/−小鼠以破坏近轴中胚层为代价形成多余的神经外胚层。Wnt3a通过LEF-1/TCF信号传导的假定作用细胞命运决定中的蛋白质与最近的发现一致将显性负性Wnt注入前消化神经斑马鱼的嵴细胞以牺牲色素细胞(Dorsky等人，1998年). 此外，Wnt1和Wnt3a被证明可以调节背部神经前体的扩张在小鼠胚胎中(Ikeya等人，1997年). The reduction in size of the端脑小泡也可能与通过发送信号Wnt3a型，与其他Wnt一起表示端脑内侧边缘的蛋白质(Grove等人，1998年).勒夫1−/−Tcf1型−/−小鼠也不能形成胎盘，这种表型在Wnt2缺乏小鼠的发音(Monkley等人，1996年). 因此，我们的分析表明这些转录因子在通过小鼠中至少一种，很可能是多种Wnt蛋白发出信号。

肢体发育缺陷Lef1型−/−Tcf1型−/−小鼠表明Wnt信号在这一发育过程中发挥作用。收件人日期，唯一Wnt（重量）已经证明具有肢体发育缺陷是Wnt7a型(帕尔和麦克马洪1995).然而，最近对小鸡的研究表明β-catenin通过逆转录病毒转染在肢芽中表达，表明Wnt-7a通过β-catenin独立途径(Kengaku等人，1998年). 相比之下LEF-1的显性负性形式干扰了Wnt3a型在诱导表达Bmp2型,Fgf4型、和Fgf8型AER中(Kengaku等人，1998年).此外，本研究表明Wnt3a上调了勒夫1在中胚层中并通过这种转录起作用因子(Kengaku等人，1998年). 在鼠标中，Wnt3a型，这是不同于重量3，未以可检测的水平表达，提示LEF-1和TCF-1可能介导另一种Wnt的作用信号。的肢芽表型勒夫1−/−Tcf1型−/−老鼠让人联想到无肢的小鸡的突变，启动肢芽形态发生，但不能表达En1、Fgf4、Fgf8、和Tcf1型、和具有AER形成前的缺陷(Grieshammer等人，1996年;Noramly等人1996;Ros等人，1996年). AER表达缺乏勒夫1−/− Tcf1型−/−小鼠的肢芽发育在AER的形成。根据这种观点肢芽需要通过间充质中的LEF/TCF蛋白发出Wnt信号。勒夫1−/−Tcf1型−/−肢芽也不能表达Fgf8型，与角色一致Wnt信号在诱导中的作用Fgf8型在小鸡身上(Kengaku等人，1998年).

The pronounced similarity of the勒夫1−/−Tcf1型−/−和Wnt3a型−/−表型升高这些转录因子在信号传导中的作用问题时空表达的其他Wnt蛋白小鼠早期发育的重叠模式。缺少Wnt5a型两者中的表达式勒夫1−/−Tcf1型−/−和Wnt3a型−/−胚胎暗示LEF-1和TCF蛋白也可以通过多种途径调节信号传导Wnt蛋白质通过反馈回路间接地表达。然而，我们不能排除缺乏特定Wnt蛋白的表达反映了缺少特定的单元格类型。此外，一些Wnt蛋白质，例如Wnt7a型在小鸡中，可能不涉及LEF-1/TCF蛋白的转录反应(肯加库等人1998)相反，并非所有的转录活动LEF-1依赖于与β-catenin的结合(Hsu等人。1998). 因此，分析额外的突变等位基因勒夫1和Tcf1型需要进一步解剖Wnt信号调节网络。

材料和方法

小鼠繁殖和基因分型

C57BL/6小鼠被用作野生型菌株从Jackson Laboratories（Bar Harbor，ME）获得。LEF-1和TCF-1-如前所述生成缺陷小鼠(van Genderen等人1994年;Verbeek等人，1995年). 获得了双突变胚胎来自复合杂合子之间的杂交勒夫1−/+,Tcf1型−/+老鼠。所有人的基因分型胚胎通过PCR分析从使用以下引物的卵黄囊：Tcf1（七）：a，5′-GAGCCAGGTCATGCTGAGTGC；Tcf1（七）：b，5′-标记tcccgcgcggaccag；和PGKP2，5′-GGTTGGCTCTACCGGTGTGG筛选Tcf1（七）−/−小鼠和D8，5′-CCGTTTCAGTGCACGCCCTCC，LPP2.2，5′-TGTCTCTCTCTTTCCGTGCTAGTTC和NEO，5′-ATGGCGATGCCTCTGCTGCGCCGAATA进行筛选勒夫1−/−老鼠。

组织学和免疫组织化学

将胚胎解剖并固定在Carnoy’s固定剂中（60%乙醇、30%氯仿、10%乙酸），乙醇脱水，石蜡包埋，7μm切片用0.1%甲酚紫染色用于常规分析。

对胚胎的横切面进行免疫细胞化学用兔多克隆血清对所述1/50稀释度的全长LEF-1蛋白在(van Genderen等人，1994年). 免疫检测用ABC方法（ABC精英试剂盒，Vector Labs）。

扫描电子显微镜

胚胎取自定时妊娠，并固定在4°C在PBS的4%PFA中过夜。然后在PBS中清洗胚胎，在乙醇中脱水，临界点干燥，放置在黄铜桩上，并涂上25纳米金-钯。查看了样本用JEOL 840扫描电子显微镜拍摄。

全贴装原位杂交

胚胎按照公布的方案进行固定和处理(Henrique等人，1995年)经过以下修改：内源性用6%H淬灭过氧化物酶2O（运行）2持续2小时在蛋白酶K消化和杂交之前。杂交是在63°C下，在5×SSC（pH 4.5）、50%甲酰胺、5米米EDTA，50μg/ml酵母tRNA，0.2%吐温20、0.5%CHAPS和100μg/ml肝素。颜色为用NBT/BCIP基板开发。胚胎后固定并在PBS中的50%甘油中拍照。显色后胚胎在PBS中清洗，在PBS的30%蔗糖中冷冻，包埋于OCT中，20μm冷冻切片，核染色在Permount中安装前呈红色。

探头

在体外转录和DIG标记的反义RNA探针从以下基因中获得：左旋-1来自氨基酸1–243 (Travis等人，1991年),Tcf-1型克隆M2a(Oosterwegel等人al.1993年),Tbx6，Tcf-3型、和Tcf-4型图像克隆分别为1636895、444295和764951(Lennon等人，1996年),帕克斯-1（Wailin等人，1994年），第3页(Goulding等人。1991),槽口-1跨膜和细胞质区探针(德尔Amo等人，1993年),Wnt-1、Wnt-3a、和Wnt5a型(Parr等人，1993年),Fgf8型(Martin 1998年),工程1(Loomis等人，1996年),Msx1型(Ros等人，1992年),长x1b(Cygan等人，1997年).

致谢

我们感谢彼得·格罗斯、鲁迪·巴林、罗埃尔·努斯和兰迪约翰逊和杰基·帕普科夫赠送cDNA探针。我们感谢安德鲁McMahon和John Rubenstein进行讨论，Gail Martin，CliffTabin和Didier Stainier对手稿进行了批判性阅读。这个这项工作得到了霍华德·休斯医学研究所对R.G.的资助。

这篇文章的出版费用部分由付款支付共页费用。因此，必须在此标记此物品《美国法典》第18卷第1734节规定的“广告”仅适用于指出这一事实。

脚注

电子邮件ude.fscu.asti@ssorgr; 传真：（415）476-8201。

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社