在原肠胚形成之前，小鼠胚胎由三种不同的细胞谱系组成，这三种细胞谱系在围植入期的胚泡中建立，即外胚层、胚外内胚层和滋养层。整个胎儿将由外胚层、胚外中胚层和羊膜外胚层形成，外胚层是一个杯状上皮，其开口端与滋养外胚层的衍生物胚外外胚层相连。外胚层和胚外外胚层都被内脏内胚层所覆盖，内脏内胚层是胚外内胚层谱系的一部分(Hogan等人，1994年).
小鼠胚胎的原始生殖细胞（PGCs）来源于部分外胚层细胞，主要产生胚外中胚层。PGC的前体位于原肠胚形成之前，靠近胚外外胚层的外胚层最近端区域，其后代不仅存在于生殖系中，也存在于胚外结构中，即尿囊、血岛和卵黄囊中胚层，以及羊膜的两层。在胚胎第6天（E），这些前体分散在一个环中，从与胚外外胚层交界处延伸至三倍细胞直径(劳森和黑格1994). 在原肠胚形成早期，它们汇聚到胚胎后部的原始条纹并通过它移位。在前体细胞通过条纹并定居于胚外中胚层后，在E7.2周围的～45个细胞中发生生殖细胞谱系的分配(劳森和哈格1994). 这大约是在这个时候，推测的PGC可以首先在原始条纹后面的一个簇中从形态学上识别出来，这个簇的位置后来将成为尿囊的基底(Ginsburg等人，1990年). PGCs以碱性磷酸酶（AP）活性的特征模式强烈染色(奇奎因1954)，这是由于组织非特异性AP(Hahnel等人，1990年;MacGregor等人，1995年). PGC在发育中的后肠中增殖并迁移至生殖嵴时继续表达AP（有关综述，请参阅布埃尔1997).
移植研究表明，来自前原始和早期原始条纹阶段胚胎的具有遗传标记的远端外胚层细胞，通常有助于神经外胚层，而不会有助于PGC，当移植到近端外胚层时，可以产生PGC和胚外中胚层(Tam和Zhou，1996年). 这些结果增加了PGC前体由胚外外胚层和外胚层交界处局部存在的细胞外因子和/或细胞相互作用诱导的可能性。
预测编码推定生殖细胞前体诱导因子的候选基因在原肠胚形成之前和期间在小鼠胚胎中表达。其中一个因子是骨形态发生蛋白4（Bmp4），它是细胞间信号蛋白TGFβ超家族的成员(霍根1996;Waldrip等人，1998年). 大多数小鼠胚胎在英国标准普尔4原肠胚形成周围死亡（～E6.5）(Winner等人，1995年). 然而，在某些遗传背景下，一部分突变胚胎存活到体节早期，并表现出严重缺陷，特别是在胚外中胚层(Winner等人，1995年). 在本文中，我们利用这种晚期表型来证明PGC的形成绝对需要Bmp4信号。此外，在杂合突变胚胎中，PGC创始群体的大小显著减少。通过使用Bmp4–lacZ报告基因，我们已经明确定位英国标准普尔4原肠形成前在胚外外胚层中表达，在胚外中胚层原始条纹期中晚期胚胎中表达。因此，英国标准普尔4在正确的时间和位置表达，在近端外胚层中PGC前体的定量诱导和胚胎外中胚层中生殖细胞谱系的分配中发挥作用。此外，通过分析遗传嵌合体，我们清楚地确定了Bmp4在PGC前体诱导中的作用，并首次证明外胚层的分泌信号是外胚层正常发育所必需的。
结果
Bmp4的表型异常原肌球蛋白1纯合子空突变体
在（129/SvEv×Black Swiss）和（C57BL/6×CBA）遗传背景上英国标准普尔4原肌球蛋白1纯合子胚胎发育到并超过早期体节阶段。图中显示了一个20体节（S）期纯合胚胎的例子B.在晚期存活的纯合子突变体中，观察到一些一致的异常。首先，与野生型和杂合型同卵双胞胎相比，它们发育迟缓（图。A、 B）。值得注意的是，所有的尿囊都完全缺失（图。B、 D），许多显示严重的后部缺陷，包括紊乱的后外胚层（图。G、 H），体肌过度生长和内皮化（图。在最严重的突变表型中，内皮细胞延伸到羊膜（图。H） 卵黄囊小而血管化不良。
高级表型英国标准普尔4原肌球蛋白1（129/SvEv×黑瑞士）突变胚胎。(A类)英国标准普尔4原肌球蛋白1/+早期胚胎前肢芽期表现为野生型形态。(B类)英国标准普尔4原肌球蛋白1/英国标准普尔4原肌球蛋白1，的室友A类发育迟缓，转向不完全，体节不规则，神经管扭结，尾巴向左不规则环状，尿囊缺失。(C类)胚胎后部A类（盒状区域）有尿囊（a）。(D类)纯合子突变体中没有尿囊（箭头所示）。中的虚线B类标记解剖级别D类. (E–H（E–H）)野生型和纯合型null片段英国标准普尔4原肌球蛋白1显示后部表型的（129/SvEv×Black Swiss）胚胎。AP和血球染色。(E类)野生型。带有27个体节的E9.5胚胎后部的横切面（TS）。脐静脉（u）界定了体肌（sop）和羊膜（am）之间的连接。PGC（箭头）从后肠（hg）迁移到生殖脊（gr）。(F类)胚胎−/−同胞的后区TSE类该胚胎有23个体节，外部形态与B类没有外部尿囊炎，但羊膜和体肌之间的区域内皮化严重（e）。(克)另一个E9.5−/−同胞的后区TS，有14个体节和更严重的后部缺陷。内皮化的体肌向后反射，形成与羊膜相连的后囊。囊内包含由表面外胚层（se）包围的尾部紊乱神经外胚层（n）的背侧延伸（n′）。(H（H）)E8.5−/−胚胎的矢状切面显示严重的突变表型。胚胎部分包含从原始条纹（ps）向头端延伸的回旋外胚层（ec）和有限中胚层。羊膜嘴侧正常，但尾侧充满中胚层（箭头所示），与原始条纹连续。此外，有AP-阳性羊膜外胚层的积聚（*）。（A） 前部；（da）背主动脉；（n） 神经管；（P） 后部；（ys）内脏卵黄囊。比例尺英寸C类对于A–D，200微米；在里面E类对于E–H（E–H），200微米。
全纯合子缺失尿囊英国标准普尔4突变体强烈表明，它们也可能缺乏PGC，因为这两种细胞类型的前体在原肠胚形成前位于近端外胚层的相似位置。因此，通过AP染色对不同阶段的胚胎进行PGC存在的检测。
Bmp4的剂量效应原肌球蛋白1关于PGC编号
以下同窝动物的比较英国标准普尔4原肌球蛋白1/+E7.2和E7.75的交叉试验表明，第一，纯合零突变体不含PGCs[来自7个（C57BL/6×CBA）交配的12个胚胎]，第二，具有可识别PGCs的杂合胚胎的发生率落后于野生型，直到（C57PL/6×CB）和 黑色瑞士）背景（图。). 在E7.5进行更详细的定量分析并不能提供信息，因为PGC仍在从AP阳性细胞群中出现(Ginsburg等人，1990年)，人口还没有呈指数级增长(劳森和黑格1994).
E7.2–E7.75具有可识别PGC的野生型和杂合胚胎的发病率英国标准普尔4原肌球蛋白1/+（C57BL/6×CBA）杂交（7只雌性，40只胚胎）和ICR×英国标准普尔4lacZneo公司/+在整座山上检查了交配（4只雌性，38个胚胎）。（开放列）野生型；（孵化柱）杂合子；括号中的样本大小。在两组中都发现了相同的趋势（未显示）：合并数据显示，杂合子中具有PGCs的胚胎比例在头折叠（HF）期之前（包括头折叠期）较小（χ2测试：P（P） < 0.05). （ES/MS）早连胜/中游；（LS）晚条纹；（NP）神经板；（HF）头巾；（S） 索米特。
本文所述的全山AP染色技术允许在胚胎晚期原位定量PGC。例如，如图所示，PGC明显存在于野生型和杂合胚胎的后肠中（图。A–C；另请参见图。E） ，但在纯合子突变体中完全缺失（图。D类；另请参见图。F–H）。这种缺失在两种遗传背景中都是正确的（C57BL/6×CBA：来自23只雌性的29个纯合子突变胚胎；129/SvEv×Black Swiss:5只雌性的8个纯合子突变胚胎），并在所有阶段进行检查。E9.5的最高级突变体（C57BL/6×CBA）胚胎有17个体节，一个（129/SvEv×Black Swiss）胚胎完全转化为23个体节。
来自E8.5同胞胚胎的后肠（后肠）片段中的PGC英国标准普尔4原肌球蛋白1/+（C57BL/6×CBA）交叉交配。碱性磷酸酶染色，背视图。(A类)野生型，15S胚胎。(B类)部分功率高A类显示后肠中的单个PGC（箭头）。(C类)杂合子，15S胚胎。与中的野生型兄弟姐妹相比，PGC更少A类. (D类)纯合零，8S胚胎。虽然存在后肠（hg），但PGC完全不存在。比例尺英寸A类对于A、 C类、和D类，200微米；在里面B类，100微米。（+/+）野生型；（+/-）杂合子；（−/−）纯合零。
杂合子胚胎虽然在整体大小和形态特征（包括尿囊）方面与野生型同卵双胞胎没有区别，但在两种遗传背景下，PGC的数量都有所减少（图。，参见A和C；关于尿囊的一个例外，参见图。). 此外，9%的杂合（C57BL/6×CBA）胚胎中没有PGC（图。A） ●●●●。尽管杂合子胚胎中的PGC较少，但杂合子和野生型同卵双胞胎中PGC的区域分布没有差异，PGC通过背侧肠系膜从腹侧后肠扩散到E9.5的生殖嵴。
胚胎中PGC数量（以总数量计）与体节数的线性回归分析英国标准普尔4原肌球蛋白1/+交叉路口。(A类)英国标准普尔4原肌球蛋白1（C57BL/6×CBA）。(B类)英国标准普尔4lacZneo公司（129/SvEv×黑瑞士）。（○，虚线）野生型；（●，实线）杂合子；（ω）纯合子为空。回归方程中的值，Y（Y） = 一 + bX公司，用于日志PGC(Y（Y）)体节(X（X）)平均值处的数字X（X）和Y（Y）每一组数据都在A类野生型，2.124=1.684+0.0286（15.4）；杂合子（PGC值>0），1.647=1.268+0.0275（13.8）；B类野生型，2.305=1.878+0.0288（14.8）；杂合子，2.089=1.541+0.0298（18.4）。基因型鉴定B类β-gal染色和表型。在A类，具有23个PGCs的25/26S杂合子类似于晚期纯合无效胚胎（如图。B） 而且完全没有尿囊。
为了确定PGC种群大小的差异出现在哪个阶段，根据体节数绘制了在整个坐骑上估计的PGC数量。对数PGC数对体节数的回归线适合杂合子大于零的所有值，与野生型的回归线平行，但海拔降低(P（P） < 0.001）（图。A、 B）。平行回归线表明，野生型和杂合型胚胎中PGC种群的扩张速度相同。假设平均每90分钟形成一对体节对(Tam 1981年)，斜率给出了15.8小时的人口倍增时间，这与之前的数据一致(Tam and Snow 1981年;劳森和黑格1994). 相反，两条回归线的海拔差异表明，杂合子中PGC的创始种群较小。（C57BL/6×CBA）背景下的野生型胚胎的平均出生人口为45(劳森和黑格1994)；将野生型的回归线外推到该值，并与同一阶段杂合子的回归线进行比较，得出杂合子中的平均PGC创建种群为17（减少62%）。（129/SvEv×Black Swiss）上PGCs数回归线的斜率（图。B） 和（C57BL/6×CBA）背景无法区分。然而，（129/SvEv×Black Swiss）胚胎中野生型和杂合子系的海拔高于（C57BL/6×CBA）胚胎(P（P） < 0.001). 这与野生型的平均创始种群为66，杂合子为30（129/SvEv×黑瑞士）一致（减少55%）。
图中野生型（C57BL/6×CBA）回归线的外推A在−1.2S时达到了预期的45个创始人口规模，而不是相当于大约−8S的预期分配时间（0S阶段前12小时）。这种差异表明，在整个坐骑中，PGC数量一直被低估，但这并不影响野生型和杂合子之间PGC数量的相对差异，也不影响杂合子中创始种群规模减少>50%的推断。如果杂合子中的PGC数量较低仅仅是由于PGC分配延迟或PGC增殖开始延迟，而不是由于发现群体较小，则回归线升高差异所暗示的延迟长度为22小时（14.7个体节当量）。数据不支持这种解释。另一种可能性是杂合子中一半以上的PGC创始人在分配后第一次分裂前死亡，这与对分配的细胞数量的直接影响无法区分。
总之，尽管英国标准普尔4对于PGC的正常维持、增殖和开始迁移来说足够了，在中游晚期/条纹晚期阶段通常在E7.2左右分配的创始种群的大小取决于Bmp4的剂量。
小鼠早期发育过程中Bmp4表达的时空模式
因为英国标准普尔4显然对原肠胚形成非常重要，了解原肠胚发育前后其精确的时间和空间表达至关重要。要检测英国标准普尔4此时的表达具有高灵敏度和单细胞分辨率，我们在ES细胞中使用同源重组来取代英国标准普尔4带有编码β-半乳糖苷酶（β-gal）和氨基末端核定位信号的报告盒的基因（图。). 胚胎纯合子Bmp4型lacZneo公司（129/SvEv×黑瑞士）背景上的突变具有与英国标准普尔4原肌球蛋白1纯合子（图。M、 N）。此外，移除新盒式磁带对lacZ公司表达或突变表型（数据未显示）。
有针对性地替换英国标准普尔4带有a的基因lacZ公司记者录音带。(A类)野生型和突变等位基因的基因组组织和靶向载体的结构。编码和非编码外显子分别用实心和阴影矩形表示。这个英国标准普尔4lacZneo公司靶向载体含有1.6kb的5′同源性。6.1-kb 3′同源臂包括来自英国标准普尔4tm1blh公司靶向载体(Winner等人，1995年)两侧是疱疹病毒胸苷激酶盒（HSV-tk公司)用于否定选择(Soriano等人，1991年). 编码外显子3替换为两者lacZ公司和新第页电阻盒；箭头指示新第页转录。液氧磷站点（▸）侧翼新第页磁带。正确重组的基因座在非编码之间产生融合转录物英国标准普尔4序列和lacZ公司不破坏相邻内含子的结构。500 bp巴姆HI–高英国标准协会用作外部5′探针的I片段如野生型所示英国标准普尔4轨迹。在12C靶向ES细胞系中，外显子3和4之间的内含子发生重组，这由Winner等人（1995）. (B类)家蚕回交后代的Southern blot分析英国标准普尔4lacZneo公司等位基因。通过使用5′外部探针和Spe公司消化后，野生型和靶向位点分别产生6.3和11.1条杂交带。（B）巴姆你好；（B）英国标准协会我；（C）克拉我；（E）生态RI；（H）Hin公司dIII；（N）不是我；（P）Pst（磅/平方英尺）我；（Sf）斯菲我；（小）Sma公司我；（西班牙语）Spe公司我；（十）Xba公司一、（+/+）野生型；（+/-）杂合子。
英国标准普尔4lacZneo公司在早期小鼠胚胎中表达。(A类)在Nomarski光学下观察的E5.5胚胎。β-gal活性的低水平首先在未切除的胚胎外外胚层（xe）中检测到。（【箭头】）胚胎和胚胎外区域之间的交界处。(B类)原肠胚形成开始时（早期条纹，ES），英国标准普尔4lacZneo公司在胚外外胚层中继续表达，位于外胚层（ep）附近的环中。(C、 D类)随着原肠胚形成的进行，英国标准普尔4lacZneo公司胚外外胚层内的表达持续存在，在后羊膜皱襞（paf）的中层条纹（MS）到晚期破裂（LS）阶段之间尤为明显。(E类)通过MS/LS胚胎的矢状切面。胚胎外中胚层（箭头）内的低水平β-半乳糖活性在这一阶段首次被检测到，因为外体腔（exo）开始形成(F类)晚破期胚胎。(G–L)英国标准普尔4尿囊发育过程中的表达。lacZ公司在显性尿囊形成之前的胚外中胚层后部堆积处检测到表达（星号克)在尿囊芽（ab）和尿囊（a）内，尿囊通过体腔外腔延伸。羊膜（am）、卵黄囊（ysm）和外腔绒毛膜（cm）的胚外中胚层成分也持续表达。(M、 N个)英国标准普尔4lacZneo公司头褶期的纯合子空胚。(M（M）)整体安装，侧视图。(N个)副矢状切面M（M）在羊膜和卵黄囊中胚层以及原始条纹（ps）后面的胚外中胚层（*）中检测到较强的β-gal活性。前部（A）在B–N类.（c）合唱；（xn）胚外内胚层；（ES）早连败；（OB）无芽；（EB）早芽；（NP）神经板；（LNP）晚期神经板。比例尺英寸A类，100微米；在里面B类对于B–J类，200微米；在里面K（K）对于K（K）和L（左），100微米；在里面M（M）对于M（M）和N个，200微米。
为了确定英国标准普尔4体内表达，英国标准普尔4lacZneo公司从E3.5开始，对杂合子胚胎进行β-gal活性分析。即使延长染色时间，在完整的囊胚或E4.5胚胎中也无法检测到阳性细胞（数据未显示）。在E5.5时，低水平英国标准普尔4lacZneo公司首先在未激活的胚外外胚层中检测到表达，包括与外胚层相邻的细胞（图。A） ●●●●。到～E6.0，在显性条纹形成之前lacZ公司表达局限于紧邻外胚层的胚外外胚层区域（图。B类；另请参见Waldrip等人，1998年). 当原肠胚形成开始时，这些β-半乳糖阳性的胚外细胞被侵入的胚外中胚层移向近端，随后形成绒毛膜（图。C–F）。英国标准普尔4lacZneo公司在中游阶段，当体腔开始形成时，在新形成的胚外中胚层中检测到表达（图。E） 。然后，在发育中的羊膜、绒毛膜和内脏卵黄囊的尿囊和中胚层成分中，其表达强度增加（图。G–L）。此时，在原始条纹中看不到任何表情。β-gal和AP活性的双重染色显示英国标准普尔4在PGC附近的细胞中表达，但明显被排除在外（图。A、 C、D）。原始尿囊芽基部条纹后面的区域，在其中可以首次识别PGC，在野生型胚胎中始终大于杂合子（图。A、 B）。
(A–D)ICR×胚胎切片英国标准普尔4lacZneo公司/+β-gal和AP活性染色。(A类)杂合子，晚条纹（LS）阶段。胚胎/胚外交界处后部的矢状面。β-半乳糖染色（箭头），代表英国标准普尔4表达于体腔外的间皮细胞中。三个AP-阳性PGC（箭头所示）（共七个）位于β-半乳糖染色区内部，不染蓝色。(B类)野生型，晚条纹阶段，胚胎同胞A类，矢状截面如所示A类初生尿囊（箭头）底部的11个PGC簇（箭头）大于杂合子。该胚胎中有33个可识别的PGC。(C类)杂合子，头巾（hf）期。头巾（hf）和尿囊底部水平的横截面（a）。（暗场）β-Gal染色呈粉红色。尿囊周围有较强的β-半乳糖活性，但核心没有。(D类)部分的高功率、明亮视野视图C类β-Gal在尿囊素基部的外周染色，但在位于更中心的AP阳性PGCs中没有染色（箭头）。(E、 F类)R26.1 ES章节↔ 英国标准普尔4原肌球蛋白1/+ × 英国标准普尔4原肌球蛋白1/+嵌合体β-gal和AP活性染色：野生型ES细胞染色为蓝色。(E类)75%嵌合野生型胚胎的后遗症，显示从ES细胞衍生的β-gal阳性PGC（箭头）和受体衍生的β-gal阴性PGC（箭形）。(F类)（C57BL/6×CBA）背景下4S期>95%嵌合体纯合无胚的矢状切面。外胚层衍生细胞是野生型ES细胞来源的细胞，并且没有来自仅限于绒毛膜外胚层（c）和内脏卵黄囊内胚层（ys）的突变细胞的可检测贡献。表型是典型的纯合性缺失，没有尿囊（箭头），没有PGCs，内脏卵黄囊小，卵黄囊血管化缺陷。胚胎外胚层和绒毛膜外胚层的AP染色与表型无关（参见A类和B类). （am）羊膜；（c） 绒毛膜；（h） 心；（ps）原始条纹；内脏胚外内胚层。比例尺英寸A–E，50微米；在里面F类，100微米。
胚胎外外胚层产生的Bmp4可能需要用于诱导英国标准普尔4近端外胚层胚外中胚层衍生物的表达。为了探索这种可能性，英国标准普尔4在英国标准普尔4lacZneo公司β-gal染色法检测纯合无胚。在头褶期，在位于体腔外的胚胎外中胚层中检测到强烈的β-半乳糖活性，在羊膜与后原始条纹交界处积聚的细胞中，在发育中的尿囊通常占据的位置（图。M、 N）。英国标准普尔4因此，外胚层衍生物的表达与Bmp4型在胚外外胚层中表达。
嵌合体分析表明胚胎外外胚层Bmp4的作用
上述时间和空间表达模式与胚胎外外胚层、胚外中胚层或两者分泌的Bmp4在PGC分配中的作用兼容。为了区分这些可能性，我们利用了这样一个事实，即当胚胎干细胞注射到囊胚中或与桑椹胚聚集时，它们几乎只在外胚层定植(贝丁顿和罗伯逊1989). 相反，受体胚胎形成滋养层外胚层和胚外内胚层衍生物，并可形成外胚层。含有100%ES-衍生外胚层的嵌合体将具有ES-衍生胚外中胚层和PGC以及受体衍生胚外外胚层。在这里的实验中，ROSA 26.1 ES细胞在基因上标记有广泛表达的lacZ公司将报告基因注入胚泡或与来自英国标准普尔4原肌球蛋白1杂合杂交。以标称E8.5回收得到的胚胎，进行基因分型，并在组织学切片上分析嵌合程度和PGC数。
32%（C57BL/6×CBA；n个 = 72）和50%（129/SvEv×黑瑞士；n个 = 80）个回收的胚胎为嵌合体：ES细胞在聚集嵌合体中的贡献往往更强，39%的嵌合体胚胎在外胚层衍生组织中显示>95%的嵌合体（表). 通常，整个胚胎的嵌合体是细粒度的，但在12/40胚泡注射嵌合体和5/23聚集嵌合体中，胚胎外中胚层、胚胎后部，有时前表面外胚层的嵌合体明显较少。这一结果可以从外胚层的命运图中预料到(Lawson等人，1991年)原肠胚形成前外胚层细胞混合不完全。PGC中的嵌合现象（图。E） 与野生型胚胎和杂合子中后体细胞嵌合体的大致估计程度密切相关（表)这表明，根据受体胚胎的基因型或ES细胞来源，生殖细胞的命运没有正选择或负选择。
表1
R26.1 ES细胞与Bmp4胚胎的嵌合原肌球蛋白1×Bmp4原肌球蛋白1交配
受体基因型
| 胚胎总数
| 平均体节数（范围）
| 嵌合百分比
|
|---|
0
| ≤25
| >25–50
| >50–75
| >75–95
| >95
|
|---|
| 桑椹聚集(C57BL/6×CBA) |
| 野生型 | 19 | 8.4 (0–15) | 14 | 0 | 1 | 0 | 2 | 2 |
| +/− | 40 | 8.1 (0–15) | 30 | 三 | 1 | 2 | 0 | 4 |
| −/− | 13 | 2.8 (0–6) | 5 | 0 | 1 | 2 | 2 | 三 |
| 囊胚注射(129/SvEv×黑瑞士) |
| 野生型 | 13 | 13.7 (0–21) | 10 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| +/− | 43 | 15.4 (0–26) | 15 | 10 | 7 | 8 | 2 | 1 |
| −/− | 24 | 5.3 (0–14) | 15 | 5 | 1 | 三 | 0 | 0 |
表2
基因型
| 嵌合百分比（后部）
|
|---|
≤25
| >25–50
| >50–75
| >75–95
| >95
|
|---|
| 野生型 | 1.6 (1) | 35.2 ± 0.3 (2) | 73.6 (1) | 72.0 ± 32.5 (2) | 94.5 ± 4.9 (2) |
| 英国标准普尔4原肌球蛋白1/+ | 4.1 ± 6.7 (12) | 20.7 ± 12.8 (14) | 47.1 ± 33.1 (5) | 83.4 ± 6.3 (2) | 95.0 ± 4.9 (5) |
杂合子中PGC的数量不受外胚层衍生组织中野生型群体大小的影响（图。A、 B）：在嵌合体中，无论是在任何遗传背景下，都没有迹象表明PGC数量从非嵌合体水平增加到野生型水平，即使在外胚层衍生组织中没有检测到杂合贡献的嵌合体中也是如此。因此，杂合子中PGC群体的较小规模是由于减少Bmp4型来自胚外外胚层，并且不能由来自野生型胚外中胚层的Bmp4进行补偿。
R26.1 ES细胞嵌合体中的PGC（根据组织切片估计）与野生型和英国标准普尔4原肌球蛋白1/+胚胎。(A类)与（C57BL/6×CBA）受体的聚集嵌合体。(B类)囊胚注射嵌合体与（129/SvEv×黑瑞士）受体。（开放符号，虚线）通配符收件人；（实心符号，实线）杂合受体；（圆圈）非嵌合体；（正方形）≤25%嵌合；（三角形）>25%–50%嵌合；（钻石）>50%–75%嵌合；（四角星）>75%–95%嵌合；（五角星）>95%嵌合。嵌合体胚胎中PGC的数量属于同一基因型的非嵌合体胚胎的分布范围，与嵌合体的程度无关。绘制的回归线适用于嵌合体和非嵌合体组合胚胎。回归方程中的值（参见图的图例。)在中A类，（野生型）2.165=1.876+0.0361（8.0）；（杂合子）1.631=1.205+0.0483（8.8）；B类，（野生型）2.364=1.976+0.0283（13.7）；（杂合子）2.155=1.775+0.0246（15.4）。
野生型ES细胞与纯合无胚结合无法挽救突变表型：即使胚胎的外胚层衍生成分不含可检测到的突变细胞，尿囊和PGC也不存在（>95%野生型ES淋巴细胞贡献）（表; 图。F） ●●●●。因此，胚外外胚层产生的Bmp4是外胚层生成尿囊和PGC所必需的，并且不能被野生型胚外中胚层产生Bmp4所取代。
表3
| 嵌合百分比（%）
| n个
| 索米提斯
| 尿囊炎
| PGC公司
|
|---|
| 桑椹聚集 | 0 | 5 | 0–6 | 0 | 0 |
| （C57BL/6×CBA） | <95 | 5 | 2–4 | 0 | 0 |
| >95 | 三 | 0–4 | 0 | 0 |
| 囊胚注射 | 0 | 15 | 0–14 | 1一 | 1? |
| （129/SvEv×黑瑞士） | ≤75 | 9 | 0–10 | 1b条 | 0? |
讨论
长期以来，人们已经确定，所有胎儿谱系，包括体细胞系和生殖系，都是从大约植入时留下的外胚层中衍生出来的。早期分配的胚胎外细胞谱系，即滋养外胚层和原始内胚层，没有为胎儿提供后代，但提供了胚胎植入和营养所需的组织（综述见罗桑特1986). 现在有证据表明，除了支持功能外，这些胚胎外谱系在胚胎发育中发挥着更密切的作用。例如，前神经模式的早期事件需要在邻近的内脏胚胎内胚层（原始内胚层的衍生物）中表达特定的基因（有关综述，请参阅Beddington和Robertson 1998年). 这里报道的结果表明，生殖系和尿囊的启动依赖于第一个建立的胚外谱系，即滋养层的信号。
小鼠胚胎中PGCs和尿囊形成的规范模型
在本文中，我们报告了三组独立的观察结果，它们共同提出了可能的模型，在这些模型中，胚胎外细胞产生的Bmp4定量地调节外胚层中PGC前体的命运以及胚胎中PGC初始种群的大小。这些模型强调了细胞间相互作用在哺乳动物生殖系形成中的重要性(Tam和Zhou，1996年)，并打开了信号通路和相关基因的分子分析。
第一组观察结果是，小鼠胚胎没有功能英国标准普尔4基因完全缺乏PGC和尿囊，尿囊是由位于近端外胚层原肠胚形成之前的前体细胞产生的细胞类型(劳森和黑格1994). 此外，杂合子英国标准普尔4原肌球蛋白1胚胎中的PGC比野生型少，尽管尿囊看起来正常。根据PGC数与发育阶段的回归分析（图。)，这种差异显然可以归因于杂合子中的创始群体较小，而不是增殖率较低。
第二组发现是英国标准普尔4在原肠胚形成之前在胚外外胚层中表达，在与近端外胚层交界处的细胞中表达水平最高。当用β-加仑记者插入内生英国标准普尔4等位基因。英国标准普尔4随后在胚外中胚层（包括尿囊）和第一个可识别PGC附近的细胞中表达。然而，英国标准普尔4似乎没有在PGC本身中表达（图。A、 D）。此外，纯合的胚外中胚层中存在β-半乳糖活性英国标准普尔4lacZneo公司胚胎暗示胚胎外外胚层中的Bmp4不需要启动Bmp4型在胚外中胚层的表达（图。M、 N）。
第三组观察结果表明英国标准普尔4将野生型ES细胞注射到囊胚中或与桑椹胚聚集，都无法挽救突变胚胎。在产生的嵌合体中，野生型ES细胞只对外胚层衍生组织有贡献，而胚外外胚层和内胚层则来自突变细胞。即使在外胚层衍生物中含有明显100%野生型细胞的嵌合体也显示出突变表型，并且缺乏PGC。同样，杂合胚胎嵌合体中PGC的数量不受嵌合体程度的影响：只有野生型外胚层细胞的嵌合体具有杂合胚胎特征的PGC数量较少。
模型一：胚外外胚层Bmp4是唯一的信号
数据表明，Bmp4在调节PGC形成中的作用的最简单模型如下：胚胎外外胚层分泌的Bmp4以浓度依赖的方式调节外胚层中的细胞命运。最靠近胚外外胚层的近端外胚层细胞接收到最高的Bmp4信号。在这些细胞中，<50%的细胞成为PGC和部分尿囊细胞（以及其他胚外衍生物）的前体。离胚外外胚层较远的细胞接收到较低的Bmp4信号，并将参与所有类型的胚外中胚层，包括尿囊，但不参与PGC。只有外胚层中PGC前体的少数后代在分配时实际成为PGC（E6前体3.7代后的平均后代为2.6代，E6.5前体1.6代后的1.5代；劳森和黑格1994). 外胚层细胞分裂后的细胞混合(Lawson等人，1991年;加德纳和科克罗夫特1998)可以确保只有一些后代与Bmp4的来源保持足够的距离，以接收足够的信号来形成PGC。或者，信号梯度可能需要时间来建立。在这两种情况下，临界浓度只有在分配PGC之前不久才能达到。
活性Bmp4蛋白的精确局部水平和外胚层细胞暴露于其下的时间取决于多种因素，例如可以结合Bmp4并阻止其与外胚层中的受体（如BmpRII和BmpR1A（Alk3））相互作用的蛋白水平(Mishina等人，1995年;Roelen等人，1997年). 编码拮抗剂类cerberus（mCer-1）和卵泡抑素的基因首先分别在前内脏内胚层表达(Belo等人，1997年;Biben等人，1998年;肖洛特等人，1998年)和后条纹(Albano等人，1994年;Feijen等人，1994年)在原肠胚形成早期。Bmp4蛋白的可用性也可能由裂解这些结合蛋白的蛋白酶的活性调节，例如属于包含Bmp1和tolloid的虾青素家族的蛋白酶(Cho和Blitz 1998;马林斯1998).
虽然对PGC的观察与胚胎外外胚层形成的形态梯度相一致Bmp4型原肌球蛋白1表型不是。卵黄囊中胚层和卵黄囊血管的存在和数量在Bmp4型根据遗传背景确定无胚胎(Winner等人，1995年)但无论遗传背景如何，尿囊都无法发育，与野生型ES细胞的嵌合体中也没有尿囊，这表明胚外外胚层Bmp4是尿囊形成的绝对必要条件。杂合子中正常尿囊的存在表明，低于PGC形成所需的阈值Bmp4浓度允许尿囊发育。这一点得到了谱系分析的支持，谱系分析表明尿囊不仅来源于最近端的外胚层，还来源于与胚胎外外胚层交界处的外胚叶细胞，在那里Bmp4浓度预计较低(劳森和佩德森1992;劳森和黑格1994). 在杂合子中，与野生型相比，暴露在这种低浓度下的外胚层细胞更少，尿囊预计会更小，否则其形成的开始会延迟。我们没有发现这方面的证据。
模型II：生成PGC和尿囊需要两个信号
如上所述，尿囊炎的明显正常表型与英国标准普尔4杂合子和Bmp4作为形态原的简单模型，在不同阈值浓度下指定PGC和尿囊。对此的一种解释可能是，尿囊细胞与PGC血统密切相关，也就是说，那些从最靠近外胚层、最接近Bmp4来源的相同前体衍生而来的细胞，对于启动尿囊芽的形成过程。因此，我们建议最高Bmp4浓度不需要指定模型I中的PGC，而是指定一组细胞，其后代在穿过条纹后将成为假定的尿囊起始细胞或PGC（图。A、 B）。这一群体的规模将与最近端外胚层中的细胞数量以及它们所接触到的胚外Bmp4信号的强度和持续时间有关。
PGC分配的Bmp4调节的双信号模型。(A类)原初条纹阶段。Bmp4由靠近近端外胚层（ep）的胚外外胚层产生，并建立一个梯度（蓝色箭头），近端外胚细胞对其作出反应，并指向尿囊起始剂/PGC命运（○）。（a）前；（P） 后部；（Pr）近端；（D） 远端的。(B类)早期原始条纹阶段。Bmp4继续由胚外外胚层产生。细胞外拮抗剂mCer-1（红色）的前位和卵泡抑素（绿色）的后位可使梯度变陡。这些也可能限制时间窗口英国标准普尔4可以在外胚层发挥作用。与其他表成细胞一起，尿囊素起始物/PGC祖细胞以6.5–7.0小时的生成时间分裂，子代向后条纹排列并开始穿过后条纹。(C类)中速阶段。新形成的胚外中胚层（xm）的一部分来自最近端的外胚层，并被指定对假定的第二个信号（黑色箭头）作出响应。这与Bmp4型在胚外中胚层的表达。(D类)中/晚连胜阶段。到～E7.2，前体细胞已分离为尿囊起始细胞（▴）和PGC（●）谱系。
前体细胞群建立后，必须将细胞导入尿囊起始剂池或PGC谱系。这很可能是对第二个局部信号的响应，无论是在细胞穿过原始条纹之前还是之后（图。C、 D）。我们目前支持第二种情况，因为先前的克隆分析表明，PGC分配的时间为～E7.2，此时PGC在早期尿囊底部的集群中首次可识别。当细胞不再进入或离开群体时，就发生了分配(迈凯轮1976)也就是说，人口已经成为血统限制和自我延续的群体。不太可能在外胚层中进行分配，因为在PGC谱系限制之前，早期条纹胚中平均有1.6个细胞周期（6.8小时），而破胚前平均有3.7个细胞周期(劳森和黑格1994).
第二个信号的确切性质和位置未知。然而，一些证据使我们推测，对第二个信号的反应有利于产生足够的细胞来启动尿囊，尿囊是胎盘哺乳动物发育所必需的结构，并使剩余的种群可分配给PGC谱系。因此，最终分配的PGC数量将取决于前体池的大小以及用于形成尿囊的比例。所有关于PGC的当前发现都与该模型相一致，即（1）存在正常尿囊，但杂合子中的PGC数量减少，（2）没有PGC，但在（C57BL/6×CBA）背景，（3）野生型（C57BL/6×CBA）和（129/SvEv×Black Swiss）之间PGC创始种群大小的差异，以及（4）杂合子中PGC延迟出现（图。)以及首次识别PGC的较小区域（图。A、 B）。双信号模型不要求胚胎外胚层Bmp4在PGC分配时具有功能。
如果这个双信号模型是正确的，预测是胚胎中含有影响尿囊表型的基因突变，但允许发育异常尿囊，可能会有PGC，但缺乏尿囊的表型不会。为了支持这一预测，纯合子电子设备(浮士德等人，1995年),T型(腕表)（V.Wilson和R.Beddington，pers.comm.）和其他2突变体（K.Lawson，unpubl.）均表现出尿囊发育异常，但其细胞具有PGC特有的AP-染色模式。第二个信号的性质或来源未知。它是早期胚外中胚层产生的Bmp4的可能性，将来将通过纯合嵌合体分析进行测试英国标准普尔4突变ES细胞。
Bmp4可能间接作用和/或与其他信号因子协同作用
在上述模型中，我们假设胚胎外外胚层分泌的Bmp4直接作用于外胚层。然而，我们目前不能排除Bmp4间接作用的可能性，例如通过调节胚胎外外胚层和/或内胚层产生的另一个信号分子。Bmp4也有可能与胚胎外胚层或外胚层产生的另一种因子协同作用，PGC前体命运由多种因素的组合决定。未来，这些可能性可以通过用不同的胚胎外组织或信号因子组合培养的远端外胚层进行培养，并在体外检测PGC的出现来进行测试。此外，如果Bmp4与其他必需因子协同作用以确定PGC细胞的命运，编码这些因子的基因中的无效突变可能会导致PGC的完全缺乏或数量减少。相反，缺少拮抗Bmp4功能基因的胚胎可能会有更多的PGC和胚外组织。在这方面，检测Smad2公司有胚外中胚层但很少有胚胎中胚层(Waldrip等人，1998年).
模型三：Bmp4控制生长和细胞运动
上述模型的另一种可能是Bmp4，而不是调节PGC/尿囊前体细胞的命运，而是控制近端外胚层细胞的生长及其向胚外区域的后条带移位。根据该模型，PGC及其后代的外胚层前体细胞英国标准普尔4空胚可能会从近端外胚层异常移位到条纹的前部。如果已经完全确定，它们将在外胚层变成PGC：这些还没有被发现。如果在横穿条纹后正常发生规格和分配，则最初的近端细胞可能会受到条纹前部信号的影响，并有助于当时胚胎中胚层的形成。我们不能排除这种可能性，因为尽管淋巴结前的发育在英国标准普尔4无胚胎，解释是混乱的，因为在突变体原肠胚形成开始时，生长总体上明显减少。未来测试该模型的一种方法是对突变体中的近端外胚层进行克隆分析。
材料和方法
小鼠菌株
以下是英国标准普尔4tm1blh公司无突变(Winner等人，1995年)本研究中使用了。C57BL/6–Bmp4型原肌球蛋白1男性(Dunn等人，1997年)与（C57BL/6×CBA）交配一层楼女性。后代杂交一代，杂合雄性回交保持系为（C57BL/6×CBA）一层楼女性。该品系用于PGC分析和桑椹胚聚集嵌合体。为了产生胚胎进行胚泡注射英国标准普尔4原肌球蛋白1通过交叉杂交，突变保持在（129/SvEv×黑瑞士）背景上。Bmp4型lacZneo公司保存在（129/SvEv×黑瑞士）背景和胚胎上，用于PGC和表达模式分析，该分析来自于与ICR雌性的杂合交配和交配。
靶向ES细胞的电穿孔、选择和鉴定
共19×106用150μg不是I消化靶向载体DNA并进行正选择和负选择(Winner等人，1995年). 双抗克隆的DNA用Spe公司I用于使用500-bp 5′外显子进行Southern blot分析英国标准协会I–巴姆HI探头（图。A、 B）和内部lacZ公司和新第页探针（未显示数据）。将一个靶向正确的细胞系12C注射到C57BL/6NHsd（Harlan Sprague-Dawley）囊胚中，其中3′同源重组发生在编码外显子3和4之间的内含子内；由此产生的雄性嵌合体与远交的黑瑞士（Taconic）雌性交配。一层楼Bmp4型lacZneo公司杂合子连续回交到黑瑞士。英国标准普尔4lacZneo公司杂合子通过PCR分析进行常规鉴定新(Dunn等人，1997年)或lacZ公司目标等位基因内的序列（见下文）。
嵌合体的产生和回顾性基因分型
注射嵌合体
按说明生成注射嵌合体(布拉德利1987;Hogan等人，1994年). 囊胚来自英国标准普尔4原肌球蛋白1/+（129/SvEv×Black Swiss）杂交后代注射12–15个ROSA26.1（R26.1）ES细胞（由Elizabeth Robertson善意提供；Varlet等人，1997年). 移植后，胚胎在E8.5和9.5之间恢复，固定，并进行双β-半乳糖和AP染色。通过酶分离卵黄囊内胚层的PCR分析，回顾性地确定了宿主胚泡的基因型(Hogan等人，1994年). 通过PCR分析内胚层DNA制剂中可能污染的中胚层lacZ公司具有以下引物序列的基因：lacZ公司1，5′-TCTGCTTCAATCAGCGTC-3′和lacZ公司2，5′-GCCGTCTGAATTTGACCTGA-3′。
聚集嵌合体
八细胞期胚胎与ES细胞的聚集基本上如所述(Nagy和Rossant 1993年). 简单地说，R26.1 ES细胞培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞上。为了聚集，将ES细胞胰蛋白酶化，使成纤维细胞重新附着到组织培养塑料上30分钟。随后，将ES电池转移到较小体积中2小时，以形成聚集团。在E2.5时从英国标准普尔4原肌球蛋白1/+（C57BL/6×CBA）背景上的交配。用酸性Tyrode溶液去除透明带，单个胚胎在20μl M16培养基液滴中的聚集孔中聚集10–15 ES细胞团，并在37°C和5%CO中培养过夜2(Zwijsen等人，1999年). 第二天将胚胎移植到E2.5假孕（C57BL/6×CBA）中一层楼收件人。胚胎以标称E8.5回收，并如上所述进行进一步处理和基因分型。在Reichert膜的顶叶内胚层上对发育迟缓的胚胎进行基因分型。
发展指数
根据形态特征评分判断的胚胎发育阶段（修改自布朗1990)或体节对的数量，在同一标称胎龄的一窝婴儿之间和一窝婴儿内变化很大。形态评分与体节数线性相关，最多20个体节对，在（C57BL/6×CBA）背景下，野生型和杂合子的关系相同（数据未显示）。在正常发育过程中，平均每90分钟形成一对体节，至少多达30个体节(Tam 1981年). 因此，Somite数被用作测量单个胚胎的发育年龄。
β-Gal染色
英国标准普尔4lacZneo公司胚胎和蜕膜在4°C的PBS中的4%多聚甲醛中固定30分钟，摇晃，在4°CPBS中洗涤两次10分钟，转移到新制备的X-gal溶液中，并在37°C下染色过夜（或更长时间(Hogan等人，1994年). 用PBS冲洗后，胚胎在4%多聚甲醛中进行后固定。一些胚胎在PBS中的80%甘油中被清除。
对于组织学分析，染色蜕膜脱水成100%异丙醇，用1:1异丙醇/石蜡清洗两次，嵌入蜡中，并用曙红对7μm切片进行轻微复染。
检测和计数PGC
整个底座
从蜕膜上分离E7.5和E9.5之间的胚胎，并反射Reichert膜。卵黄囊从正在或已经完成旋转的胚胎的外胎盘锥中分离出来。卵黄囊和羊膜都被反射，但仍附着在胚胎上。将胚胎在4°C的PBS中的4%多聚甲醛中固定2小时。胚胎在PBS中清洗三次，在此期间根据大小进一步解剖。胚胎至~6S（早期后肠）保持完整；将～7S和～11S之间的胚胎在S4/5水平横切成前部和后部；对较老胚胎的卵黄囊进行修剪，然后在前肠门水平或前肢芽出现时在S10水平切割胚胎。这些较老胚胎的后部沿着背主动脉的线纵向分裂，形成两条弯曲的条带，一条由后肠、尿囊、中胚层和侧板中胚层组成，并反射卵黄囊和羊膜；另一块位于背部，包含神经管、体节和节前中胚层。保留所有片段，并在4°C下用70%乙醇处理至少1小时。用蒸馏水洗涤三次后，用α-磷酸萘酯/固红TR对其进行染色(Ginsburg等人，1990年)在室温下保持13分钟。然后用水冲洗，并用70%的甘油清除。仍完好的胚胎（高达～6S）被分成前半部分和后半部分，其中包含PGC；不含PGCs的卵黄囊被切除。在～7～～11S期，模糊的神经管和近轴中胚层被从后肠分离出来，在较老的阶段，尿囊和后腹中胚层也被分离出来。胚胎后部的染色片在盖玻片下用70%的甘油略微压平，用25倍物镜在复合显微镜中识别和计数PGC。保留胚胎的前部进行基因分型。
小节
将胚胎固定在上述4%多聚甲醛中，通过冷乙醇系列快速脱水至96%乙醇，用冷乙二醇甲基丙烯酸甲酯（Technovit 8100）渗透1-2小时。然后在4°C下聚合塑料。根据制造商的说明，用ASMX/Fast Red TR（Sigma）对7μm切割的连续切片进行30–90分钟的AP活性染色。这些切片用迈尔血块复染，并安装在阿奎蒙特（Gurr）。使用25倍物镜，根据AP阳性细胞质斑点的密集染色对PGCs进行计数(Ginsburg等人，1990年;劳森和黑格1994).
β-半乳糖和AP联合染色
如上所述，将胚胎固定在4%多聚甲醛中2小时，并在37°C下对β-半乳糖进行染色4小时（与R26.1 ES细胞嵌合体）或8小时(英国标准普尔4lacZneo公司胚胎）。然后将其脱水，包埋在Technovit 8100中，切片，并如上所述进行AP活性染色，无需复染。
