ephrinB配体和EphB受体在心血管发育中的作用：动/静脉结构域的划分、血管形态发生和新生血管的萌芽

内皮-间充质界面上ephrins和Eph受体的表达

在体细胞发生过程中，ephrinB配体、EphB2和EphA4受体在体细胞生成中表达并部分需要，而在平行调节神经嵴迁移和运动轴突导向中(Durbin等人，1998年以及其中的参考）。我们现在显示了体间血管（通过Flk-1表达识别，图。​图3A）三A） 在体节边界形成的表达EphB3和EphB4受体（图。​（图3C、D）三C、 D）当ephrinB2在体节尾侧半部表达时（图。​（图3B）。三B） 。ephrinB2和PECAM-1的双重免疫染色表明，皮肤肌瘤的ephrinB2表达细胞与表达EphB受体的血管内皮细胞之间有密切接触（图。​（图3E、F）。三E、 F）。这表明体液ephrinB2和内皮Eph受体在体间血管和连接毛细血管网络的形态发生中存在功能性相互作用。起源于心脏附近静脉窦的脐静脉是间充质EphB受体和内皮细胞ephrinB配体之间可能发生功能性相互作用的另一个例子。EphB2表达，通过β-半乳糖苷酶染色观察ephB2–lacZ在紧邻脐静脉的间充质细胞中发现了杂合子（图。​（图3G），三G） 而静脉内皮细胞，通过PECAM-1染色鉴定（图。​（图3H），三H） ，表达ephrinB1和EphB3/EphB4受体（见图。​图2）。2).

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图3

表达配体和受体的内皮细胞和间充质细胞之间的细胞接触。如图所示，用反义探针在E9.5胚胎上进行整体原位氢化。显示躯干区域，吻部向上，背部向左(A–D). 的表达式flk-1（flk-1）(A类),单位B3(C类)、和ephB4型(天)在体间血管中。(B类)ephrinB2在体节的尾侧半部表达。Somite边界用括号表示。(E、 F类)用抗PECAM-1（棕色）抗体对E9.5野生型胚胎进行整体免疫组化，染色体间血管，并用肾上腺素B2（紫色）染色背侧体节。切面，背部向上，吻侧向左。白色方框所示区域的放大倍数更高(E类)显示了(F类). 请注意，内皮细胞与表达肾上腺素B2的体液细胞直接接触。(G公司)E10.5的横截面EphB2lacZ公司突变杂合子(Henkemeyer等人，1996年)在静脉窦附近的脐静脉水平，β-半乳糖苷酶活性染色，背部向上。如PECAM-1染色所示，在血管壁未染色内皮细胞附近的间充质细胞中可以看到EphB2（β-gal）的表达(H（H）).

卵黄囊和脐血管发育对ephrinB2和EphB2/EphB3受体的需求

小鼠靶向灭活肾上腺素B2基因(Bergemann等人，1995年)（见材料和方法）揭示了胚胎血管形成过程中对ephrinB2的需求。肾上腺素B2^−/−E9.5和E10的突变株生长迟缓，心包膨胀，心脏跳动，但胚胎中几乎没有血流（数据未显示）。E9.5野生型卵黄囊表现出分级组织的血管结构，具有许多大型卵黄血管，而肾上腺素B2^−/−同一阶段的突变体有苍白的卵黄囊（图。​（图4B）4B） 包含一个原始的血管丛，由一个均匀组织的相互连接的小血管网络组成（数据未显示），很像最近报道的ephrinB2/taulacZ突变体(Wang等人，1998年). 我们独立生成的肾上腺素B2^−/−因此，该突变体证实了ephrinB2在早期血管发育中具有重要作用。此外，我们得出结论，在部分重叠区域表达的ephrinB1无法弥补ephrinB2的缺乏，这表明这两种配体在胚胎内皮细胞之间的细胞间相互作用中具有不同的功能。

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图4

血管缺损肾上腺素B2^−/−和ephB2/ephB3双突变胚胎。E9.5野生型卵黄囊(A类),肾上腺素B2^−/−(B类)和ephB2/ephB3双纯合突变体(C类). 在新解剖的纯合子突变卵黄囊中缺乏可见的主要血管。(D–I型)PECAM-1的整体免疫组化。E10胚胎干区血管PECAM-1染色，吻侧向上，背侧向左。野生型胚胎中背主动脉（白色箭头）、主动脉弓（白色箭头方向）和前主静脉（黑色箭头方向）的外观(天)与…相比肾上腺素B2^−/−突变体(E、 F类)和一个ephB2/B3双突变体(G公司)显示出不规则形状或主要船只完全断裂。(H（H）)双杂合胚胎的躯干区域（het/het）显示完整的背主动脉和第四主动脉弓（白色箭头）。(我)的主干区域ephB2/ephB3双突变胚胎，第四主动脉弓和靠近主动脉弓的背主动脉有缺陷（白色箭头）。(J、 K（K）)胚胎主动脉弓横截面图H（H）和我，罗斯特拉尔站起来了。注意正常血管管腔(J型)在双突变体中没有形成(K（K）).

在卵黄囊中观察到EphB2和EphB3受体的表达，以及在胚胎间质和内皮细胞中分别观察到EfB2和EphB3的表达，这促使我们检查ephB2/ephB3双突变小鼠(Orioli等人，1996年)血管重塑缺陷。利用30%的外显率（32个双突变体中的10个），我们回收了具有血管缺陷的双纯合胚胎。这些突变体显示出淡黄色的卵黄囊，几乎没有血管（图。​（图4C），4C） 与正常窝友相比，它们生长迟缓，偶尔心包囊扩大（数据未显示）。未观察到单个血管缺陷ephB2型或ephB3纯合子，可能是由于外显率很低。在胚胎中，血管缺陷与肾上腺素B2^−/−突变体。在PECAM-1染色的野生型胚胎的躯干区，背主动脉、主动脉弓和大的前主静脉很容易辨认（图。​（图4D）。4D） ●●●●。图​图4E4E表示代表肾上腺素B2^−/−突变胚胎，背主动脉原基形成正常，而第四主动脉弓和前主静脉异常。在更严重的情况下肾上腺素B2^−/−突变体，我们观察到胚胎有一条或没有背主动脉，而主静脉总是异常的（图。​（图4F）。4F） ●●●●。受到严重影响ephB2/ephB3双纯合子的主要血管原基形状异常（图。​（图4G）。4G） ●●●●。受影响程度较轻的胚胎显示出正常的主动脉背侧和主静脉，但缺乏形成心脏流出道的功能性第四主动脉弓（图。​（图4H，I）。4H、 I）。通过躯干这一区域的横截面显示，内皮细胞未能组织成管腔血管（图。​（图4J、K）。4J、 K）。综上所述，这些数据表明，很大一部分胚胎需要EphB2/EphB3受体才能正常发育血管。两者都有肾上腺素B2^−/−和ephB2/ephB3双突变体显示出通过血管生成形成大血管原基的可变表型，这表明其他配体（可能是ephrinB1）和受体（如EphB4）在这一过程中相互合作。

ephrinB2和ephB2/ephB3突变胚胎中头部、心脏和体间血管的缺陷性血管生成

在E10，野生型胚胎头部包含高度组织化的血管系统，从前主静脉延伸出直径较大的分支（图中的箭头）。​图5A）5A） 和颈内动脉。相反，肾上腺素B2^−/−突变体显示出原始的脉管系统，具有大小均匀、组织不良的血管（图。​（图5B）。5B） 。同样地，ephB2/ephB3双纯合子头部血管较少，直径较小（图。​（图5C）5C） 或者，在严重的病例中，在初级毛细血管丛阶段被阻止（数据未显示），表明血管生成没有发生或严重延迟。AP融合蛋白的整体染色显示，头部血管（包括头部毛细血管床）中ephrinB配体和EphB受体的部分重叠表达（图。​（图2K，L）。2K、 L）。

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图5

脑、心脏和体节血管的血管系统缺陷肾上腺素B2^−/−和ephB2/ephB3受体双突变体。PECAM-1全身染色E10胚胎头部区域(A–C). 直径较大的前主静脉分支用白色箭头表示(A类). 请注意ephB2/ephB3双突变胚胎(C类). 在更严重的受体双突变体示例中（数据未显示）肾上腺素B2^−/−突变胚胎(B类)头部脉管系统仍然组织为原始的毛细血管丛。PECAM-1染色的野生型心脏(天),肾上腺素B2^−/−(E类),ephB2/ephB3双突变体(F类)E10处。注意心脏较小，心室小梁减少肾上腺素B2^−/−(E类)和电子线B2/电子线B3双突变体(F类)与野生型心脏相比(天). (G、 H（H）)PECAM-1染色的野生型心脏切片(G公司)和ephB2/ephB3双突变体(H（H）). (I–M公司)PECAM-1（E10）染色显示躯干腰段间血管。(我)野生型胚胎显示体间血管（白色箭头）和毛细血管网的分段模式肾上腺素B2^−/−突变体(J型).ephB2/ephB3双突变体表现出较温和的缺陷，例如来自体间血管的异常背芽（箭头，K（K）). (五十、 M（M）)PECAM-1染色胚胎的矢状切面。(L（左）)野生型胚胎。(M（M）)肾上腺素B2^−/−胚胎显示两个体节在体节边缘有正常血管（*），几个体节有异常的芽伸入体节（黑色箭头）。

正常的心室充满了大量的心肌小梁，心肌壁的指状突起由PECAM-1阳性心内膜细胞排列（图。​（图5D、G）。5D、 G）。相反，肾上腺素B2^−/−和电子线B2/电子线B3变异心脏较小，心室内折叠的小梁越来越少（图。​（图5E、F、H）。5E、 F、H）。这种表型让人想起缺乏Ang1的胚胎(Suri等人，1996年)或其受体Tie-2(Sato等人，1995年).

在野生型胚胎的主干区，体节间血管排列在体节边界之间。在背部，它们被重塑成高度树枝状的毛细血管网络（图。​（图5I）。5一） ●●●●。在肾上腺素B2^−/−突变体，间质血管表现出较差的组织，并且它们的分支比野生型胚胎中的对应物少（图。​（图5J）。5J） ●●●●。受影响的ephB2/ephB3双纯合子，在正常的分段模式中存在体间血管。然而，观察到异常的背侧支（图中的箭头）。​图5K）。5K） 。PECAM-1染色切片显示体节内类似的异常分支肾上腺素B2^−/−突变体（图。​（图5M，5M、 箭头）。这些结果表明，EphB2和EphB3在心脏发育以及头部和体节血管系统重塑中是必需的。

麻黄碱体外调节毛细血管芽的形成

我们还首次证明了内皮细胞对肾上腺素的直接反应，即可溶性肾上腺素B配体在体外诱导内皮细胞的发芽行为，其效力与已知的血管生成因子（如Ang1和VEGF）相当。这些发现表明，肾上腺素在毛细血管芽的形成中具有刺激作用。另外，ephrin–Eph信号可能参与内皮细胞接触抑制的调节。外源性提供的ephrinB可能通过增加细胞运动来缓解细胞接触抑制，从而使发芽在本试验中发生。这项相对简单的测试给出了一个出乎意料的复杂读数，为深入了解肾上腺素对该细胞群的作用提供了机制上的见解。未聚集的ephrinB1能够诱导毛细血管芽，而只有未聚集的ehrinB2表现出相同的活性。虽然不能排除在没有聚集抗体的情况下，在一些ephrinB1嵌合体的制备中发生了一定程度的自发聚集，但我们的发现与已发表的神经元实验密切相关，这些实验表明，未聚集的ephrinB1-在体外崩塌实验中是活跃的。此外，ephrinB2-Fc需要预先聚集以激活EphB4受体(Meima等人，1997年). 这些观察的体内相关性尚不确定。一方面，未聚集的ephrinB1在体外的功效可能意味着该配体在体内有效，即使在低表达水平下也会阻止聚集配体的出现。另一方面，体外对聚集的ephrinB2的需求可能意味着，体内细胞以聚集和未聚集的形式呈现ephrinB2，例如，由于不同的表达水平或对未知分子信号的反应，可能会促进内皮细胞的定性不同反应。

动脉和静脉域之间的边界形成

体内ephrinB和Eph受体功能的机制尚不清楚。情况很复杂，因为（1）内皮细胞和相邻结构上存在几种不同的配体和受体，至少部分重叠表达模式（本报告；Pandey等人，1995年)，（2）ephrinB配体与各种EphB受体表现出很大程度的混杂结合(弗拉纳根和范德哈根1998)（3）活性配体受体复合物需要更高阶的肾上腺素簇（本报告；Davis等人，1994年;Gale和Yancopoulos 1997;Stein等人，1998年)，（4）ephrinB配体和EphB受体具有双向信号传递的能力(Holland等人，1996年;Brückner等人，1997年). 基于动脉上ephrinB2和静脉上EphB4受体的互补表达，人们认为这两种分子的双向信号传导对胚胎血管系统的发育至关重要(Wang等人，1998). 通过类比它们在神经系统中已知的排斥性相互作用，有人认为，ephrinB2–EphB4相互作用可能在动脉和静脉区域之间形成一个边界，从而简单地防止细胞混合（图。​（图7A；7A；Yancopoulos等人，1998年). 有人认为，边界处的相互作用也可能阻止动脉和静脉结构融合成更大的血管，从而确保它们重塑为毛细血管网络。该模型可能在一定程度上是正确的，但需要体外数据显示内皮细胞之间通过ephrin–Eph相互作用的排斥性相互作用。我们对静脉中ephrinB1、EphB3和EphB4共表达的证明证明了更复杂的相互作用。基于排斥的模型需要由ephrinB2与EphB4相互作用介导的信号事件，这与与共表达ephrinB1和EphB3的相互作用不同。

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图7

血管重塑过程中推测的肾上腺素和Eph受体的作用机制和部位。(A类)动脉上表达的ephrinB2配体与静脉上表达的EphB3和EphB4受体的相互作用划定了动脉和静脉结构域之间的边界。通过与神经系统中的作用类似，有人认为，肾上腺素与Eph的相互作用可能会阻止动脉和静脉内皮细胞的混合，并且在内皮细胞发芽后，可能会导致毛细血管网络的形成(Yancopoulos等人，1998年). 然而，该模型是基于ephrinB2和EphB4的排他性和互补性表达。(B类)配体和受体在同一类型血管（例如静脉）上的共表达为内皮细胞提供了细胞间信号，这可能是刺激性的，有助于促进形态发生和萌发。(C类)邻近血管的间充质细胞也表达肾上腺素或Eph受体，可能有助于血管系统的模式化。在体节中，这种信号可能被抑制并阻止发芽，而在其他区域，刺激信号是可以想象的。间充质细胞也是血管生成因子的来源，如Ang1和VEGF，它们可能调节ephrinB–EphB受体信号。

血管形态发生过程中的Ephrin–Eph相互作用

我们的原位杂交分析和AP全染色，以及之前发表的体外观察结果(Stein等人，1998年)表明内皮细胞可以共同表达ephrin配体及其同源Eph受体，表明ephrin-Eph信号参与内皮细胞间的通讯。观察到的主动脉弓缺陷肾上腺素B2^−/−和ephB2/ephB3双突变胚胎表明内皮细胞上的ephrinB2、EphB3和ephrinB1之间存在这种相互作用。大静脉原基上的ephrinB1、EphB3和EphB4的共表达和相互作用可能是静脉结构重塑所必需的。我们认为，同一血管类型的内皮细胞之间通过ephrin/Eph系统的细胞间相互作用产生刺激信号，促进内皮形态发生和发芽，最终形成功能性血管（图。​（图7B）。7B） 。在这个过程中触发的信号事件可能与发生在动静脉边界的信号有质的不同。配体聚集和单向与双向信号传递可能为这种信号传递差异提供了分子基础。

内皮细胞与间充质细胞的相互作用

ephrin与Ephf相互作用的另一个潜在部位是内皮细胞与间充质细胞的界面（图。​（图7C）。7C） ●●●●。我们观察到表达ephrinB2的皮肤肌瘤间充质细胞与表达EphB3和EphB4受体的体间血管密切接触。这种表达与血管重塑具有功能相关性，因为它与体间毛细血管床的减少有关肾上腺素B2^−/−和ephB2/ephB3双突变体。此外，在体细胞发生过程中，ephrinB2在体细胞的尾侧半部表达（见图。​图3B；三B类；Wang和Anderson 1997)可能参与体间血管的节段性组织。与这个假设相一致，我们发现在肾上腺素B2^−/−突变体和穿透体节的异常芽ephB2/ephB3突变体。基于这些表型，我们推测体液性ephrinB2与内皮EphB受体相互作用的性质可能是抑制芽，因此在突变体中可以看到芽。因此，EphB3和EphB4受体在这种结构中具有细胞自主功能，而间充质肾上腺素B2可以作为这些受体的配体。在脐静脉中观察到相互作用的情况，表达EphB2的间充质细胞与表达配体ephrinB1的PECAM-1阳性内皮细胞紧密接触。虽然我们在ephB2/ephB3突变纯合子，可能是由于与其他EphB受体的功能冗余或外显率低的结果，我们推测内皮细胞附近细胞表达的Eph受体可能作为内皮细胞肾上腺素的配体，它与前连合神经元的反向信号传递机制非常相似(Henkemeyer等人，1996年;Orioli等人，1996年).

间充质细胞也是血管生成因子的来源，如VEGF和Ang1，后者是重塑胚胎血管系统所必需的。这两个信号系统在发展中的脉管系统中如何相互作用？EphrinB–EphB相互作用可能调节Ang1或其受体Tie-2和Tie-1的表达。然而，我们的初步RT-PCR表达分析表明Ang1、Tie-2、和第1级mRNA转录肾上腺素B2^−/−突变体（数据未显示）。或者，Ang1和VEGF可能调节ephrinB–EphB信号传导。与此假设一致，我们表明Tie-2至少在体外可以直接磷酸化ephrinB2的细胞质结构域。虽然体内数据尚不可用，但Ang1的作用之一可能是通过诱导酪氨酸磷酸化和肾上腺素逆转信号传导来激活ephrin–Eph信号传导。无论机制如何，我们认为间充质细胞通过分泌因子和通过ephrinB–EphB系统的细胞间信号传导与内皮细胞相互作用（图。​（图77C） ●●●●。

神经系统血管生成

神经系统的血管发育涉及从邻近血管向神经外胚层组织的血管生成性萌芽，可能由类似的机制介导，如内皮-间充质相互作用。有趣的是，血管生成性神经系统的萌芽在肾上腺素B2^−/−纯合子（数据未显示；Wang等人，1998年). 这些工作人员认为，在与神经管中EphB2表达细胞相互作用后，动脉内皮细胞需要ephrinB2配体信号。然而，我们在ephB2/ephB3双基因敲除胚胎（数据未显示）。这可能是由于神经系统中其他EphB受体（如EphB1）的重叠表达和功能补偿所致。或者，在神经管不同水平表达的ephrinB2可能向EphB3/EphB4-表达的静脉内皮细胞提供萌芽诱导信号，从而刺激毛细血管向神经管内长入。对神经系统中缺乏ephrinB配体的条件突变小鼠的分析有望澄清这个问题。

ephrin–Eph相互作用诱导的信号事件

一些证据表明，在这里展示的两类突变胚胎中观察到的血管表型至少部分是由于EphB受体信号的干扰。我们的体外数据显示，可溶性（聚集性）肾上腺素能诱导出芽，证明EphB受体在介导这种反应中的直接作用，这模拟了体内血管重塑的某些方面。已知活化的EphB受体与Ras GTPase激活蛋白RasGAP结合(Holland等人，1997年)它反过来又招募其他信号分子，这些信号分子最终可能介导细胞反应，如肌动蛋白聚合和细胞形状的改变(布吕克纳和克莱因1998). 有趣的是，缺乏RasGAP的小鼠表现出与此处描述的小鼠表型相似的血管重塑缺陷(Henkemeyer等人，1995年)，增加了RasGAP介导内皮细胞中EphB受体信号的可能性。

ephrinB配体的反向信号传导也可能有助于此处所述小鼠的表型。观察到的血管重塑缺陷ephB2/ephB3双突变小鼠必须至少部分地将外源性信号反射到内皮细胞，因为在血管上没有观察到EphB2的表达。间充质EphB2和内皮EphB3受体之间的功能冗余可能是由于与内皮ephrinB1的相互作用，其主要功能可能是受体。关于ephrins下游的信号传导事件知之甚少。活化的ephrinB配体在酪氨酸上磷酸化，从而启动磷酸化酪氨酸介导的信号传递，同时通过在同一细胞中表达的活化受体酪氨酸激酶抑制信号传递(Brückner等人，1997). 这表明内皮细胞中的ephrinB信号可以和许多已知对血管生成和血管生成至关重要的受体酪氨酸激酶相互作用(里索1997).

RT-PCR分析

通过标准程序从野生型卵黄囊和胚胎中提取mRNA，并用寡核苷酸（dT）进行反转录₁₅引物和PCR扩增。检测各种肾上腺素/肾上腺素基因，使用以下引物对：肾上腺素B2，5′-CTGTGGCCAGACCAAGAG-3′（正义），5′-CAGCAGAACTTGCATCTTGTC-3′（反义）；肾上腺素-B1，5′-AAGCCACCAGAAATCCGC-3′（有义），5′-CGGTGCCCGCTGTACCACTAC-3’（反义）；ephB2型，5′-ATGCCTTCTCCACCCTCTCCC-3′（正），5′-TCTTCCTAGTTATGAGTTCTAC-3′（反义）；ephB3，5′-GCTGGTGAGTTTGGGAAGTG-3′（有义），5′-GTGACCAATCCTTAGC-3′（反义）；ephB4型，5′-CAGGTGGTCAGCGCTCTGGAC-3′（有义），5′-ATCTGCCACGGTGGTGAGTCC-3′（反义）。

整体免疫组化

根据已公布的方案，分离、固定野生型和突变胚胎，并用抗PECAM-1的大鼠抗体（Pharmingen 1:100稀释）和抗大鼠IgG的二级抗体以及亲和素结合过氧化物酶（Vector）进行染色。对于双重免疫组化，胚胎被固定，用5%H漂白₂O（运行）₂在甲醇中培养5小时，用3%速溶脱脂奶粉、0.1%Triton X-100在PBS中封闭2小时，同时用PECAM-1（Pharmingen，1:100）和ephrinB2（Santa Cruz，1:50）的一级抗体在4°C封闭溶液中培养过夜。在封闭溶液中进行大量清洗后，胚胎再次在4%多聚甲醛中固定2小时，在PBS中清洗，并在65°C下培养30分钟以灭活内源性磷酸酶。然后，如前所述，用二级抗体（生物素化抗鼠IgG，Vector，1:100；抗兔IgG碱性磷酸酶偶联物，Sigma，1:100）孵育2小时。最后，对胚胎进行广泛清洗，用碱性磷酸酶反应染色，用亲和素结合过氧化物酶（Vector）孵育过夜，再在封闭缓冲液中清洗，并在3,3′-二氨基苯并胺四氢氯化物（DAB）中发育。

碱性磷酸融合蛋白的整体染色

对野生型胚胎（CD1）的胚胎和卵黄囊进行解剖，在室温下用Dent的固定剂（20%二甲基亚砜，80%甲醇）处理30分钟，用PBS洗涤三次（每次5分钟），并用融合蛋白孵育（10 n）米)Eph受体或肾上腺素和人分泌的碱性磷酸酶(Brambilla等人，1995年)DMEM中，10%小牛血清，0.1%NaN_三.如前所述进行磷酸酶的洗涤、热灭活和显色(Cheng和Flanagan 1994).

全支架原位杂交

如前所述进行原位杂交(Haramis等人，1995年)用蛋白酶K处理未漂白的E9.5胚胎15分钟。探针使用如下：法兰-1(Millauer等人，1993年);肾上腺素B1，与全长编码区相对应的1.1-kb片段(Bouillet等人，1995年);肾上腺素B2，一个从核苷酸4延伸到894的890 bp的片段(Bergemann等人，1995年);ephB3(Orioli等人，1996年);ephB4型，一个1146 bp的片段，从核苷酸104延伸到1250(Ciosek等人，1995年);lacZ公司，一个2.2kb的片段，编码β半乳糖苷酶羧基末端790个氨基酸。

体外萌芽血管生成试验

描述了Ang1*的测定和生成(Koblizek等人，1998年). 纯化的Fc融合蛋白如前所述(Davis等人，1994年;Gale等人，1996年). 如前所述，对ephrinB2-Fc进行聚类(Wang和Anderson 1997).

我们感谢A.Plück-Becklas和欧洲分子生物学实验室转基因核心设施的同事们创造了嵌合小鼠，感谢动物馆的工作人员提供的专家支持，感谢K.McNagny、S.Adams和M.Schorpp-Kistner在表型G的初始表征方面提供的帮助。Yancopoulos用于建议体外发芽试验。纯化的重组VEGF是M.Clauss的礼物。我们感谢T.Graf和K.Kullander批判性地阅读了手稿。对这项研究的支持部分来自德国Forschungsgemeinschaft（DFG，Kl948/2-1），来自人类前沿科学计划组织，来自欧盟生物技术网络对R.K的资助，以及来自德国克雷布希尔夫和马克斯·普朗克学会对C.W.、U.D.和W.R.的支持。R.H.A.获得了欧洲分子生物学组织博士后奖学金的支持。

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