细胞表面定位的基质金属蛋白酶-9蛋白水解激活TGF-β并促进肿瘤侵袭和血管生成

MMP-9在细胞表面的定位增强了其促进肿瘤侵袭和血管生成的能力

在之前的研究中，我们发现CD44将MMP-9的蛋白水解形式定位在TA3wt细胞表面，并且CD44–MMP-9复合物的表达与体内外TA3细胞的侵袭性相关(Yu和Stamenkovic 1999). 为了研究观察到的侵袭性是否依赖于MMP-9蛋白水解活性的细胞表面定位，用编码MMP-9序列和CD44跨膜和细胞内结构域（MMP-9/CD44fp，图。​图2A）。2A） ●●●●。在哺乳动物细胞中表达时，产生的融合蛋白被束缚在细胞表面。作为对照，用羧基末端v5表位标记的可溶性MMP-9（MMP-9v5，图。​图2A）。2A） ●●●●。通过Western blot分析（图。​（图2Ba2Ba和b）。通过无血清细胞培养上清液的明胶酶谱测定可溶性MMP-9v5和MMP-9/CD44融合蛋白的表达（图。​（图2B，c）2B、 c）和细胞膜裂解物（图。​（图2B，d），2B、 d）。MMP-9/CD44融合蛋白的分子量为～120 kD（图。​（图2B、d、，2B、 d，车道5,6），与MMP-9v5的～90 kD相比（图。​（图2B、c、，2B、 c，7–8车道）。所有转染体表达83 kD的内源性MMP-9水平相似。为了比较细胞表面连接的MMP-9–CD44fp和过度表达的可溶性MMP-9v5的功能，评估转染剂对G8成肌细胞单层侵袭的影响。观察到MMP-9–CD44融合蛋白的表达恢复了TA3sCD44细胞侵入G8单层的能力，而可溶性MMP-9v5的表达未能做到这一点（图。​（图2C）。2C） ●●●●。

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图2

TA3转染体的特性和G8成肌细胞侵袭试验。(A类)v5标记的MMP-9和CD44–MMP-9融合蛋白的示意图。显示了形成融合的氨基酸序列。（五十） 先导肽；（pro）前体蛋白；（Zn）锌结合域（活性位点）；（hemopex）hemopexin结构域；（tm）跨膜结构域；细胞内结构域；（v5）v5肽标签。(B类) (一)用抗CD44单克隆抗体IM7.8对TA3转染细胞裂解物和相应的浓缩无血清条件培养基（b）进行Western blot。内源性CD44表达在所有转染剂中具有可比性（a）。可溶性CD44表达在TA3sCD44、TA3sCD44mmp-9/CD44fp、TA3s CD44mmp-9v5细胞（b、lanes）中具有可比性3–8)而TA3wt细胞不表达可溶性CD44（车道1,2). （c，d）（c）无血清培养基和（d）转染的TA3细胞的粗膜制剂的明胶酶谱。细胞裂解物（a）、条件培养基（b、c）和粗膜制剂（d）来自以下各项：1, 2)TA3wt细胞；（车道3,4)TA3sCD44细胞；（车道5,6)TA3sCD44mmp-9/CD44fp细胞；（车道7,8)TA3sCD44MMP-9v5细胞。显示了分子质量标记。(C类)G8成肌细胞单层侵袭试验：TA3sCD44mmp-9/CD44fp细胞（a，箭头）表达MMP-9–CD44融合蛋白可以在与TA3wt细胞（c，箭头）相当的程度上挽救TA3sCD44（b，箭头）侵袭G8单层的能力，而可溶性MMP-9v5的过表达几乎没有影响（d，箭头）。棒材，80μm。

通过将各自的TA3sCD44细胞转染体皮下注射到同基因A/Jax小鼠中，比较MMP-9-CD44融合蛋白和可溶性MMP-9v5表达对体内肿瘤生长、侵袭性和血管生成的影响。发现TA3sCD44细胞中细胞表面MMP-9/CD44融合蛋白的表达可以恢复体内肿瘤的侵袭性和生长，而可溶性MMP-9v5的过度表达几乎没有影响（图。​（图3三A、 B）。同样，MMP-9/CD44融合蛋白的表达，而非可溶性MMP-9v5的表达，恢复了TA3sCD44肿瘤血管生成，这是通过每10×显微镜视野中抗vWF染色血管的平均数量进行评估的（图。​（图3C）。三C） ●●●●。因此，MMP-9蛋白水解活性在细胞表面的定位，而不仅仅是其分泌，是促进体内TA3肿瘤侵袭和血管生成所必需的。

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图3

MMP-9–CD44融合蛋白的表达可恢复体内TA3sCD44细胞的侵袭性、生长和血管生成。(A类)来自皮下注射的TA3wt（a）、TA3sCD44（b）、TA3 sCD44MMP-9/CD44fp（c）和TA3 scd44MMP-9v5（d）细胞的代表性肿瘤的苏木精染色切片。总计2×10⁶注射活细胞，并于注射后1周采集肿瘤标本。(B类)在另一组动物中，在注射后3周评估肿瘤重量。在每个实验中，给六只小鼠注射每个转染剂。平均重量±标准差。显示了来自TA3转染体的肿瘤。(C类)根据抗vWF抗体的显示，肿瘤血管生成被评估并表示为TA3转染实体肿瘤切片中每10倍倍显微镜视野中毛细血管的平均数量。数字±标准差。表示10个随机选择的字段中总计数的每个显微镜字段的平均血管计数。棒材，300μm。

TA3wt/G8成肌细胞共培养条件培养基诱导血管内皮细胞小管生成

为了阐明MMP-9介导的肿瘤血管生成的分子机制，并确定参与促进血管生成的细胞表面定位MMP-9的假定底物，我们建立了由野生型或转染TA3细胞和固定的G8成肌细胞单层组成的共培养系统，近似肿瘤和基质细胞的相互作用，上调TA3细胞中MMP-9的表达(Yu等人1997; 数据未显示）。对来自共培养物的无血清条件培养基进行了测试，以验证其刺激I型胶原凝胶上生长的牛微血管内皮细胞（BME）形成毛细血管的能力。TA3野生型/G8和TA3sCD44/MMP-9-CD44fp/G8共培养条件培养基诱导BME小管形成（图。​（图4A、C），4A、 C），而TA3sCD44/G8和TA3sCD44/MMP-9v5/G8共培养条件培养基没有（图。​（图4B、D）。4B、 D）。来自固定的G8成肌细胞或仅存活的TA3wt细胞的无血清条件培养基对BME细胞没有成管作用（数据未显示）。因此，TA3细胞表面MMP-9活性似乎是通过共培养条件培养基诱导BME小管生成所必需的。

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图4

内皮细胞小管形成试验。BME细胞（3×10⁵/ml）接种在添加10%小牛血清的培养基中的I型胶原凝胶上。第二天，抽吸培养基，并用来自G8成肌细胞单层和TA3wt共培养的无血清条件培养基替换(A类)TA3sCD44型(B类)，TA3sCD44/MMP-9-CD44fp(C类)，或TA3sCD44/MMP-9v5(D类)单元格。总共30μg/ml pan特异性抗TGF-β(E类)或抗bFGF(F类)在用于检测之前，将抗体添加到TA3wt/G8共培养基中。管状物用箭头表示。棒材，140μm。

潜在TGF-β的激活是MMP-9依赖性小管生成的基础

在进行了一系列旨在确定BME小管生成促进因子某些特性的初步生化分析后，我们发现TA3wt-G8无血清共培养条件培养基中的小管生成活性不仅耐热（80°C，5分钟），而且被热激活（数据未显示）。这一观察结果使我们测试了一种可能性，即假定的血管小管诱导因子可能是TGF-β，它具有高度耐热性，可以通过热处理和酸处理从其潜在形式中激活(罗伯茨和斯波恩1993;Taipale等人，1998年)并且可以通过胶原凝胶中生长的血管内皮细胞诱导小管形成(Sankar等人，1996年).

向TA3/G8共培养基中添加一种中和的泛特异性抗TGF-β抗体，阻断了其诱导BME小管形成的能力，而分别用抗VEGF抗体和抗bFGF抗体对两种主要血管生成因子（VEGF和b-FGF）的条件培养基进行免疫耗竭，并经Western blot分析验证，没有效果，与对照兔IgG相似（图。​（图4E、F；4E、 F；数据未显示）。

细胞表面MMP-9激活潜伏的TGF-β2和TGF-α3

为了进一步证明共培养液中的血管小管诱导因子是TGF-β，我们使用水貂肺上皮报告细胞（TMLC）进行了荧光素酶报告分析稳定转染纤溶酶原激活物抑制剂1启动子（PAI-1，由纽约大学Dan Rifkin善意提供）TGF-β反应部分下游的荧光素酶cDNA。将来自几个TA3细胞转染体和G8细胞共培养物的条件培养基应用于TMLC，并测量相应的荧光素酶活性（图。​（图5）。5). 这些分析的结果证实，在TA3和G8成肌细胞共培养物中观察到的TGF-β活化至少部分需要MMP-9的细胞表面蛋白水解活性，因为可溶性CD44的表达降低了TGF-α活化，可能是通过破坏内源性CD44聚集和蛋白水解活性MMP-9的细胞表面定位（图。​（图5A）。5A） ●●●●。正如预期的那样，当与G8成肌细胞单层共培养时，膜栓化MMP-9/CD44融合蛋白的表达恢复了TA3sCD44细胞诱导TGF-β活化的能力，而可溶性MMP-9v5的过度表达仅产生轻微影响（图。​（图5A）。5A） ●●●●。当向TA3/G8共培养物中添加一系列蛋白酶抑制剂，并在TMLC荧光素酶分析中测定相应条件培养基的TGF-β活性时，发现基质金属蛋白酶、1，10-菲咯啉和MMPI的广谱抑制剂阻断了TGF-，但不是通过特定的MMP-3抑制剂肽、纤溶酶抑制剂抑肽酶或半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64、亮氨酸蛋白酶和蛋白染色剂a（数据未显示）。

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图5

CD44锚定的MMP-9激活TGF-β。(A类)显示了TA3转染剂-G8成肌细胞共培养液刺激TMLC荧光素酶活性的能力。指示测试的条件共培养基。(B类)使用泛特异性TGF-β抗体（30μg/ml）或特异性TGF-α1抗体（100 ng/ml）、TGF-γ2抗体（100ng/ml。一个单位的荧光素酶活性对应于5 pg纯化人TGF-β1（R&D）产生的活性。

用于小管生成实验的泛抗TGF-β特异性抗体对TGF-。经RT-PCR和Western blot分析（数据未显示）评估，TA3细胞表达所有三种TGF-β亚型和TGF-α受体I、II和III型。为了确定细胞表面MMP-9活性是否优先激活任何单一的TGF-β亚型，使用无血清条件培养液进行荧光素酶分析，该条件培养液来源于TA3wt细胞和G8单层细胞的共培养，同时存在单独的抗TGF-。抗TGF-β2抗体可阻断大部分荧光素酶活性，而抗TGF--β3抗体可部分阻断荧光素素酶活性。抗TGF-β1和抗bFGF抗体没有阻断作用（图。​（图5B；5B类；数据未显示）。

纯化的MMP-9激活潜在的TGF-β亚型

为了确定MMP-9是否能直接激活TGF-β，用v5/组氨酸标记的MMP-2、MMP-3、MMP-9和TGF-。MMPs和TGF-β亚型的表达和纯度通过酶谱、Western blot和考马斯蓝染色SDS-PAGE分析确定（数据未显示）。瞬时转染编码TGF-β1、TGF-α2或TGF-γ3的cDNA的COS细胞的浓缩无血清上清液与蛋白A Sepharose-bound，p-氨基苯汞醋酸盐（AMPA；长濑1997)-激活MMP-2、MMP-3和MMP-9并应用于TMLC荧光素酶分析。MMP-9和MMP-2激活了潜在的TGF-β，而MMP-3只起到了边际作用（图。​（图6A）。6A） ●●●●。有趣的是，TGF-β2似乎是三种亚型中对MMP-9介导的活化最敏感的。用亲和纯化的v5/his标记的潜伏TGF-β2和蛋白A结合的AMPA激活的MMPs重复这些实验，结果证实，潜伏TGFβ2可以被纯化的活性MMP-9和MMP-2激活（图。​（图6B）。6B） ●●●●。为了获得MMP-9激活的潜在TGF-β池的部分指标，我们比较了等分热量和纯化的MMP-9处理的TGF-？1、TGF-α2和TGF-γ3转染COS细胞的浓缩上清液诱导的TMLC荧光素酶活性。当上清液加热到80°C持续5分钟时，可获得最大的荧光素酶诱导。纯化的MMP-9激活了约12%、11%和4%的TGF-β2、TGF-α3和TGF-γ1可热激活池，如TMLC荧光素酶诱导所评估的（数据未显示）。

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图6

TGF-β被纯化的MMP-9激活。(A类)含有所示潜在TGF-β亚型的浓缩COS细胞上清液与所示纯化AMPA激活的MMPs孵育后诱导的TMLC荧光素酶活性。通过Western blot分析和热处理（80°C持续5分钟）后TMLC-luciferase诱导评估，上清液中存在相当数量的潜在TGF-β1、TGF-(B类)亲和纯化TGF-β2与所示纯化活化MMP孵育后诱导的TMLC荧光素酶活性。活性以相对光单位（RLU）表示，其中800 RLU对应于1 pg纯化的人TGF-β1（研发）产生的萤光素酶活性。(C类)TGF-β被MMP-9和MMP-2蛋白水解切割。纯化v5标记的TGF-β2（车道1)与蛋白A结合的、AMPA激活的MMP-9（lane2)，MMP-2（车道三)和MMP-3（车道4)在37°C下保持90分钟。孵育后，将上清液从珠中分离，进行SDS/12%PAGE，转移到Hybond-C膜上，并用抗v5抗体印迹。(D类)MMP-2/CD44融合蛋白的表达促进TA3sCD44细胞中TGF-β的活化。TMLC荧光素酶检测是使用暂时转染有所示cDNA的TA3sCD44细胞的无血清共培养基进行的。

为了确定转化生长因子β2是否被基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-2切割，将羧基末端v5/组氨酸标记的转化生长因子-β2 cDNA转染COS细胞的浓缩上清液与蛋白A Sepharose-bound、AMPA激活、基质金属蛋白酶9、基质金属酶-2或基质金属蛋白酶-3在37℃孵育90分钟，用抗v5抗体进行Western blot分析以评估TGF-β的裂解（图。​（图6C）。6C） ●●●●。在转染COS细胞的条件培养基中检测到两种约50和25 kD的TGF-β2，对应于proTGF-。​（图6C，6C、 车道1）。MMP-9和MMP-2分别产生约28和35/37 kD的潜在TGF-β裂解产物，而作为对照的MMP-3未诱导可检测到的TGF-α裂解。这些观察结果表明，MMP-9和MMP-2在不同的位置裂解潜在的TGF-β2，由于裂解产物的大小，这些裂解产物很可能位于TGF-？潜伏相关蛋白中。

观察到纯化的MMP-2可以在体外蛋白水解切割和激活潜在的TGF-β，以及MMP-2通过αvβ3整合素定位在细胞表面的概念(Brooks等人，1996年)，使我们测试了细胞表面系留的MMP-2可能提供与MMP-9类似的潜在TGF-β活化的细胞机制的可能性。通过MMP-2–CD44融合蛋白的表达，可以在TA3sCD44细胞中恢复TMLC荧光素酶诱导能力（图。​（图6D），6D） 提供证据表明，定位于细胞表面的MMP-2可以替代MMP-9作为潜在TGF-β的激活剂。

TA3细胞表面CD44–MMP-9复合物的表达有助于TA3实体瘤潜在的TGF-β活化

为了确定细胞培养系统的观察结果是否反映了TA3肿瘤的体内情况，我们使用TMLC荧光素酶分析法测量了TA3wt、TA3sCD44、TA3s CD44/MMP-9-CD44fp和TA3sCD44/MMP9-9v5细胞的固体肿瘤提取物中的TGF-β活性。皮下肿瘤在注射肿瘤细胞后7天和10天被切除，并对来自相应提取物的等量蛋白质进行测试，以确定其诱导TMLC荧光素酶活性的能力。TA3wt和TA3sCD44/MMP-9-CD44fp肿瘤的裂解物诱导的荧光素酶活性显著高于TA3sCD44和TA3s CD44/MPP-9肿瘤的荧光素酶活性（图。​（图7A）。7A） ●●●●。

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图7

在肿瘤提取物和角质形成细胞培养物中检测到CD44锚定的MMP-9激活TGF-β。(A类)在50 m的培养基中提取来自TA3wt、TA3sCD44、TA3s CD44/MMP-9-CD44fp和TA3s cd44/MMP9-9v5细胞的7天和10天实体瘤米三氯化氢，（pH7.5），75米米氯化钠，10米米将EDTA（含AEBSF（1μg/ml）、抑肽酶（0.05单位）、亮氨酸蛋白酶（1μg/ml）、胃蛋白酶抑制素A（2μg/ml。(B类)野生型（lane）无血清条件培养基（a）和粗细胞膜提取物（b）的明胶酶谱分析1a和b）和CD44-空（车道2在a和b）角质形成细胞中。(C类)用来自野生型和CD44阴性角质形成细胞的无血清条件培养基进行TMLC荧光素酶分析。(D类)暂时转染MMP-9/CD44fp、MMP-9v5和sCD44 cDNA的CD44空角质形成细胞培养物无血清条件培养基TMLC荧光素酶检测。荧光素酶活性以相对光单位（RLU）表示，其中800 RLU对应于1 pg纯化人TGF-β1（R&D）产生的活性。

MMP-9细胞表面定位在侵袭和血管生成中的重要性

与大多数已知的MMPs类似，MMP-9是分泌的，但最近的证据表明，MMP-9可能在促进肿瘤侵袭中发挥主要作用(Kim等人，1998年). 我们目前的观察结果表明，MMP-9在细胞表面的定位可能是提供其蛋白水解活性以促进肿瘤侵袭和血管生成的关键事件。细胞表面MMP-9活性因可溶性CD44的表达而被抑制的TA3细胞在体内和体外失去了侵袭皮下组织和成肌细胞单层的能力，而在同基因小鼠中的相应肿瘤显示出明显的血管生成减少。在这些细胞中，v5标记的可溶性MMP-9的过度表达不能充分重建血管生成和侵袭性，而MMP-9–CD44融合蛋白的表达可以恢复这两种特性，该融合蛋白旨在迫使MMP-9定位到细胞表面。与这些观察结果一致，整合素αvβ3介导的蛋白水解活性MMP-2的细胞表面定位已被证明在某些肿瘤类型中促进血管生成和侵袭(Brooks等人，1996年,1998). 因此，ECM粘附受体将MMPs保留在细胞表面可能为细胞调节MMP活性提供了一种一般机制，并产生了一些重要后果。首先，它可以帮助将蛋白水解活性集中在细胞和ECM之间的接触点，为细胞提供对底物降解发生方式的控制措施。第二，MMPs与对接ECM受体共聚集而产生的局部浓度可能会诱导MMPs自动激活，这与至少一些MMPs可以启动或维持其自身激活的概念一致(长濑1997). 第三，细胞表面对接可能提供了一种保护MMP活性免受TIMP抑制的机制。TIMP是已知的主要MMP抑制剂，大多数可溶性MMP活性被认为是TIMP与MMP结合的结果。然而，TIMP似乎与TA3细胞中的CD44–MMP-9复合物无关，尽管存在丰富的固有TIMP生成，支持了细胞表面可能为MMP-9活性提供特权位点的观点（Q。Yu和I.Stamenkovic 1999年，未着色）。CD44是否阻断TIMP结合或其他膜相关因子是否保护MMP-9免受TIMP介导的抑制尚待确定。

MMP-9和MMP-2激活TGF-β

TGF-β1、TGF-α2和TGF-γ3是一种多功能细胞因子的密切相关亚型，参与调节胚胎发育以及组织损伤后的修复和再生(马萨格1990;Roberts和Sporn 1993年). 所有三种亚型都分泌在由成熟的TGF-β及其前体TGF-α潜伏相关蛋白（β-LAP）组成的潜伏、非活性复合物中。成熟TGF-β在分泌途径中通过一种呋喃样加工内蛋白酶从其前肽中裂解(Munger等人，1997年)，但前肽仍然通过非共价相互作用与TGF-β相关，使复合物具有潜伏期(Munger等人，1997年). LAP通常通过二硫键与潜在的TGF-β结合蛋白（LTBP）相连，这为TGF-？沉积到ECM中提供了一种机制，在ECM中隔离了大量的TGF--。在生理条件下，与LAP结合的潜在形式相比，自由活性TGF-β可以忽略不计，并且不能通过其特定受体启动信号转导。因此，ECM的释放和潜在形式的激活被认为是调节TGF-β功能的关键事件。虽然体内TGF-β激活的确切机制尚不清楚，但已发现一些候选分子，包括纤溶酶、血小板反应蛋白1和αvβ6整合素，可以激活潜伏的TGF-(Lyons等人，1990年;Sato等人，1990年;Schultz-Cherry等人，1994年;Crawford等人，1998年;Munger等人，1999年)在纤溶酶的情况下，通过潜在复合物的蛋白水解，或通过直接物理相互作用导致的构象变化。我们目前的观察结果表明，MMP-9和MMP-2可能为体内潜在TGF-β的蛋白水解激活提供了替代途径。这些途径的潜在生理相关性得到以下观点的支持：潜在TGF-β的激活发生在细胞表面，在β-糖苷聚糖附近，β-糖甙聚糖将配体呈现给其细胞表面受体(Taipale等人，1998年). 有趣的是，通过Western blot分析评估，MMP-9和MMP-2产生不同的TGF-β蛋白水解产物，表明不同的识别/切割位点。观察到的裂解产物本身是否显示出活性或构成随后裂解生成活性TGF-β的非活性中间体，尚待确定。

目前，三种潜在TGF-β亚型对MMP-9介导的活化敏感性差异的基础尚不清楚，其解释还需要进一步的研究。一种可能的解释是，亚型之间的结构变化影响了切割位点的可及性。

表达结构和RT-PCR

根据制造商的说明，使用Trizol试剂（GIBCO-BRL）从小鼠胎盘和TA3细胞中分离出总RNA。用上标II RNase H逆转录酶（GIBCO-BRL）从5μg总RNA合成cDNA。PCR按所述进行(Yu和Stamenkovic 1999). 为了生成由小鼠MMP-9和CD44跨膜和细胞质结构域组成的嵌合结构，使用合适的合成寡核苷酸引物对通过PCR扩增相应的cDNA。对于MMP-9，使用正向引物5′-CACGATAAGCTTTATGAGTCCCTGGCCCTGCTC-3′和反向引物5’-CACGAGATCTAGGGCACTGCTGCAGGT-3′。对于CD44，引物如下：正向，5′-CACGATAGATCTCCAGAAATGCTCATCTTGGCA-3′；背面为5′CACGATCTCGAGCTACCCAATCTATGTCACC-3′。用适当的限制性内切酶消化PCR生成的两个片段，在框架中连接在一起，并插入到pcDNA6/V5-His载体中，该载体包含一个抗急变碱基因（Invitrogene，Carlsbad，CA），通过使用含有新霉素抗性基因的质粒已经稳定导入的细胞，允许后续生成双转染剂。用正向引物5′-CACGACGATCATGAGTCCCTGGCCCCCTGCTCCTGTGTG-3′和反向引物5’-CACGATGGGCGCCGCAGGGCGCCAGTGCAGGAGGTCGGTGT-3′通过RT-PCR产生可溶性MMP-9，并克隆到pcDNA6/V5-His载体中，构建羧基末端V5表位标签融合子（Invitrogen）。用合适的寡核苷酸引物通过PCR产生MMP-2、MMP-3和TGF-β1、TGF-α2和TGF--β3 cDNA，并插入pcDNA6/V5-His载体。PCR反应中使用的引物对分别对应于正向和反向适当编码序列5′端和3′端的30个核苷酸，省略了终止密码子以允许与标签编码序列融合。cDNA序列来自GenBank，注册号为M84324型和X66402型分别针对MMP-2和MMP-3，以及M13177型,X57413型、和M32745号分别用于TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。MMP-2-CD44融合构建物的生成方式与MMP-9-CD44嵌合体的生成方式相同。通过双脱氧链终止法进行DNA测序，证实了插入物的真实性和正确定向。

瞬时和稳定转染

用Lipofectamine（GIBCO-BRL）转染TA3细胞，用含有编码可溶性CD44、MMP-9-CD44和MMP-2-CD44嵌合体的cDNA的表达载体、可溶性MMP-9和单独的表达载体转染。针对G418（1.5 mg/ml）和短梗霉素（10μg/ml）耐药性选择稳定的转染剂，并在选择培养基中生长2-3周后挑选耐药菌落。通过ELISA、酶谱和/或Western blot分析对转染体的培养上清液和裂解液进行相应基因产物的表达测试。为了产生v5-和His标记的TGF-β1、TGF-α2和TGF-γ3，以及MMP-2、MMP-3和MMP-9，用DEAE/Dextran瞬时转染COS细胞的相应cDNA(Aruffo等人，1990年). 根据制造商的建议，将来自野生型和CD44阴性小鼠的原代角质形成细胞瞬时转染superect（Qiagen）。在感染后72小时使用瞬时转染子进行检测。

肿瘤生长与血管生成

转染TA3细胞（2×10⁶在0.2 ml Hank’s平衡溶液中，每只小鼠注射HBSS）至雄性同基因A/Jax小鼠（马萨诸塞州巴尔港Jackson实验室）皮下。每个转染剂至少使用两个独立的分离物。每天观察动物。注射后1周处死两只注射了每种转染剂的小鼠，固定并切片以评估其侵袭性。注射三周后，处死六只注射了每种转染剂的小鼠，分离、称重并切片以评估血管生成。

组织学和免疫细胞化学

将实验动物的肿瘤解剖并固定在PBS中的4%多聚甲醛（Fisher）中，用PBS洗涤，用30%、70%、95%和100%乙醇和二甲苯脱水，并包埋在石蜡（Fisher）中。共切取5-10μm切片，安装在载玻片上，用Gill-2苏木精（Shandon）染色进行组织学分析，用抗WF（Dako）抗体评估肿瘤血管生成，用单克隆抗体IM7.8检测CD44的表达和定位，用抗MMP-9（癌基因）检测MMP-9的表达。

侵入性分析

按所述制备G8成肌细胞单层(Yu等人，1997年). 将转染的TA3细胞接种在固定的G8单层膜上，接种量为5×10^三6孔板中的细胞/孔。培养7至10天后，通过显微镜观察细胞的侵袭性。所有实验均一式三份，每个转染剂至少使用两个独立的分离物。

内皮小管形成试验

内皮小管生成按照蒙特萨诺和佩珀（1993）BME细胞（由Roberto Montesano善意提供）。简单地说，将BME细胞接种到I型胶原凝胶上并培养过夜。第二天，将来自G8成肌细胞单层和TA3转染剂共培养物的条件培养基添加到内皮细胞中（详见图例），这些转染剂经过处理或没有抗体、蛋白酶抑制剂、热量或酸。每天观察细胞，并在加入共培养条件培养基72小时后通过光学显微镜记录内皮小管形成。所示结果代表了至少三个独立实验。

转化生长因子β活性的荧光素酶测定

为了测量无血清细胞培养基和肿瘤提取物中TGF-β的活性，我们使用了转染了TGF-？反应性人PAI-1启动子并融合到荧光素酶报告基因的水貂肺上皮细胞（TMLC，由纽约大学纽约医学中心细胞生物学系Daniel Rifkin博士善意提供）。将TMLC接种到24孔板（2×10⁵细胞/孔/ml（10%FBS DMEM），并允许附着3小时。然后清洗细胞，并将不同的共培养条件培养基和待测试的肿瘤提取物添加到细胞中，如图图例所示。16小时后，根据制造商的说明，使用荧光素酶测定系统（密歇根州麦迪逊市普罗米加）测量荧光素醇酶活性。所有实验均一式三份。

样品制备、酶谱和Western blot分析

收集来自野生型和CD44敲除小鼠的培养TA3转染物和角质形成细胞的无血清上清液，并按说明提取附着细胞(Yu和Stamenkovic 1999). 粗膜制剂在50 m的RIPA缓冲液中溶解米含150 m的三氯化氢（pH7.4）米氯化钠，5米米EDTA、1%Triton®声波风廓线仪、0.1%十二烷基硫酸钠、2 m米PMSF、2μg/ml亮蛋白肽和0.05 U/ml抑肽酶。去除RIPA缓冲液不溶物质后，剩余上清液用于明胶酶谱。用含有1 mg/ml明胶的10%SDS-PAGE分离来自转染TA3细胞和角质形成细胞的总共50μl无血清上清液和来自TA3细胞及角质形成淋巴细胞的粗膜裂解液的50μg蛋白质（Fisher，Columbia，MD）。电泳后，用2.5%Triton X-100清洗凝胶以去除SDS，并用50 m米Tris-HCl（pH 8.0），含5 m米氯化钙₂和0.02%叠氮化钠在37°C下放置24小时。用0.5%考马斯蓝染色凝胶，观察凝胶活性。对于Western blots，电泳后的凝胶被印在Hybond-ECL膜上（伊利诺伊州阿灵顿高地阿默沙姆）。用单克隆抗体IM7.8（ATCC）、抗TGF-β1、TGF-α2和TGF-γ3抗体（R&D系统）和抗v5表位标签单克隆抗体（Invitrogen）分别检测CD44、TGF--β1、TGF-β2和TGFβ3，以及v5表表位标签蛋白。

我们感谢Tak Mak的CD44缺失小鼠，Roberto Montesano的BME细胞，Dan Rifkin的TMLC。这项工作得到了NIH拨款CA55375和GM48614的支持。Q.Y.得到了NIH培训拨款CA09216的支持。

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