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生物化学杂志。2011年9月2日；286(35): 30662–30669.
2011年7月11日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M111.267906号
预防性维修识别码：PMC3162427型
PMID：21757687

脯氨酸3-羟化酶2在纤维形成胶原翻译后修饰中的作用*

罗素·J·费尔南德斯,1 亚历克斯·法南德, 杰弗里·特雷格, 玛丽·安·魏斯,和大卫·R·爱
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

最近研究表明，I型、II型和V/XI型纤维性胶原在胶原三螺旋结构域中除已建立的初级Pro-986位点外的其他位点具有部分3-羟基脯氨酸（3Hyp）残基。这些位点在羟基化程度和D周期间隔模式方面表现出组织特异性。这表明在纤维超分子组装中起到了促进作用。分支A纤维性α1（II）、α2（V）和α1（I）胶原链中的位点与已知的α1（IV）链中的脯氨酰3-羟化酶2（P3H2）底物位点具有共同特征，暗示该酶的作用。我们利用发现高水平表达P3H2 mRNA的Swarm大鼠软骨肉瘤细胞系（RCS-LTC）来探索这种可能性。质谱测定表明，这些细胞制造的pN型II胶原蛋白中所有其他候选3Hyp底物位点都高度羟基化。在RNA干扰实验中，P3H2蛋白的合成与Pro-944、Pro-707的脯氨酰3-羟基化以及pNα1（II）链的C末端GPP重复序列协同受到抑制，但Pro-986仍保持完全羟基化。此外，当P3H2表达被关闭时，如在培养的SAOS-2骨肉瘤细胞中自然观察到的那样，α1（I）链中Pro-986的3Hyp完全占据未受影响，而α2（V）链中残基Pro-944的3-羟基化大部分丢失，α2（V）和α2（I）链条中Pro-707的3-羟基化度急剧降低。结果表明，P3H2在A层胶原链的3Hyp位点中具有优先的底物序列。

关键词：骨、软骨、软骨细胞、胶原蛋白、酶、羟化酶、质谱（MS）、成骨细胞、骨肉瘤、蛋白质自我组装

介绍

胶原蛋白是脊椎动物的主要结构蛋白，已进化出一系列翻译后修饰，对三螺旋组装和稳定性、分子间交联、纤维强度和组织功能至关重要。来自2-氧代-戊二酸依赖性双加氧酶家族的酶负责大多数这些修饰。例如，脯氨酸4-羟化酶催化脯氨酸4-羟基化，这是胶原蛋白二级和三级结构所必需的修饰(1,2)赖氨酸羟化酶同工酶催化赖氨酸羟基化，这是胶原蛋白分子间交联形成所必需的修饰(2–4).

脯氨酸3-羟基化酶1（P3H1），22-氧代戊二酸依赖性双加氧酶家族的另一个成员催化原纤维形成胶原蛋白中某些脯氨酸残基的翻译后3-羟基化。这种酶最近才从鸡组织中克隆出来(5)经过部分纯化后>25年前(6). P3H1被鉴定为大鼠leprecan的鸡同源物，这是一种首次从大鼠壁卵黄囊肿瘤细胞系分离的糖蛋白(7). 在过去的几年里，人类的新突变第3H1页研究表明，编码P3H1相关蛋白的基因和基因会导致隐性成骨不全(8–11). 通过质谱分析，我们和其他研究人员已经表明，这些患者骨骼和皮肤的α1（I）胶原链中的Pro-986可能严重缺乏3-羟基化。因此，I型胶原α1（I）链中Pro-986的3-羟基化需要P3H1酶(8,10). 尽管胶原蛋白中存在3-羟脯氨酸（3Hyp）是在50多年前发现的(12)这种相对罕见但重要的修饰在纤维形成胶原中的作用尚不清楚。詹金斯等。(13)观察到3Hyp对合成肽形成的胶原三螺旋有轻微的不稳定作用，但最近，进一步的研究将其修正为稳定性略有增加(14).

基因组数据库分析表明，脊椎动物脯氨酰3-羟化酶家族中存在由基因编码的三种同工酶，即P3H1、P3H2和P3H3LEPRE1公司,LEPREL1公司、和麻风2分别在人类中(15). 2-氧代-戊二酸依赖性双加氧酶超家族（cl01206，NCBI保守结构域数据库）中保守催化结构域的存在表明，P3H2和P3H3很可能参与胶原家族额外链中脯氨酸残基的3-羟基化，例如IV型胶原链(16). 通过Northern blots和定量PCR检测人类和小鼠P3H2的表达谱，发现其在胎盘、肺、心脏和肾脏中表达(15,17). 免疫电镜证实，P3H2在小鼠肾小管细胞、胰腺腺泡细胞和神经Schawnn细胞中表达(16). 因为这些组织富含含有IV型胶原蛋白的基底膜在体外使用重组P3H2和对应于α1（IV）胶原链序列的合成肽进行的研究表明，这些肽比对应于I型胶原α1（I）链中3Hyp位点（Pro-986）的合成肽能更有效地进行3-羟基化，这意味着P3H2可以在α1（IV）胶原链中3-羟基化特定脯氨酸残基(16).

P3H2与P3H1和P3H3在发育中的小鼠胚胎的各种组织中共表达，与原纤维胶原表达区域一致。这在间充质软骨冷凝、四肢软骨、下颌骨、发育中的和成年的眼睛、骨骼和皮肤区域尤为明显(17,18). P3H同工酶在小鼠胚胎胶原蛋白原纤维组织中的广泛表达模式，而不仅仅是基底膜，表明其在处理原纤维胶原蛋白方面具有更广泛的功能(18). 我们最近的研究结果支持了这一假设，即原纤维胶原I、II和V/XI对胶原三螺旋结构域中除原A1位点（Pro-986）外的其他位点的3-羟脯氨酸残基进行了部分修饰(19,20). 此外，这些位点位于胶原蛋白D期分子错位的三个残基内（234个氨基酸残基），表明它们在胶原蛋白原纤维组装中起作用。例如，在A族胶原链的进化群中(图1A类)，包括α1（I）、α2（I），α1（II）和α2（V），我们已经证明Pro-944的A2位点、Pro-707的A3位点和Pro-470的A4位点都部分3-羟基化(19). 这些位点是P3H2和P3H3的候选底物。我们使用Swarm大鼠软骨肉瘤细胞系（RCS-LTC）进行实验研究，该细胞系在长期单层培养中合成并翻译后交联II、IX和XI型胶原异聚纤维(21). 质谱测定表明，与控制软骨II型胶原相比，RCS-LTC II型胶原链中的所有候选3Hyp位点都高度羟基化，为研究操纵P3H同工酶活性对脯氨酸3-羟基化模式的影响提供了一个系统。利用RNA干扰，我们证明了P3H2蛋白的敲除可协同减少Pro-944、Pro-707处的3-羟基化，以及三螺旋C末端的GPP重复，但不减少a pNα1（II）胶原链支链的Pro-986处的GPP。我们进一步表明，当P3H2表达被关闭时，α2（V）链中残基Pro-944的3-羟基化几乎完全丧失，α2和α2（I）链中Pro-707的3Hyp占有率显著降低。结果确定了P3H2在a层胶原链中非A1脯氨酸残基的3-羟基化中的作用。

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排列的前胶原分子和微纤丝中脯氨酰3-羟基化位点的相对分子位置。 A类，占用的3Hyp站点表示为灰色方框在分子的三重螺旋区域内。发件人正确的到左边，这些是C端子（GPP）4重复，A1位于Pro-986，A2位于Pro-944，A3位于Pro-707，A4位于Pro-470。N-前肽的小三螺旋中的GPP重复由打开盒子。B类，在pN型II胶原微纤维中形成三功能分子间交联所需的轴向关系。胶原分子以234个氨基酸残基的典型胶原D周期交错排列。注意N-前肽GPP重复序列的位置(开箱)相对于相邻pN II型胶原分子中的A2位点和D交错的A2、A3和A4 3Hyp位点的排列。

实验程序

细胞培养

将RCS-LTC细胞系保存在高糖DMEM（Hyclone）、10%铁补充牛小牛血清（Hyclene）、10μg/ml的单层培养液中我-37°C和5%CO条件下的抗坏血酸2持续4周(22). 一些培养物还补充了β-氨基丙腈（Sigma）以抑制赖氨酰氧化酶。SAOS-2细胞系（ATCC目录号HTB-85）在含有10%FBS（Invitrogen）和50μg/ml抗坏血酸盐的McCoy培养基中作为单层培养物维持一个月(23,24). 人类软骨肉瘤细胞系，CH1.2(24)人乳腺癌细胞株MDA 231（ATCC目录号HTB-26）和MDA 361（ATCC-HTB-27）在含有10%FBS和50μg/ml抗坏血酸的高糖DMEM中培养。

胶原蛋白提取和纯化

用1提取RCS-LTC细胞层米氯化钠，50米米Tris，pH 7.5，含，1 m米PMSF，1米米苯甲脒和5m米EDTA在4°C下持续20小时，以溶解新合成的非交联胶原蛋白。在4°C和25000×克，上清液调整为4.5米NaCl并在4°C下搅拌20 h。离心后，在Laemmli样品缓冲液中使颗粒变性，并在SDS-PAGE上运行胶原链(25). 在培养一个月后，用1米氯化钠，50米米Tris，pH 7.5，含1m米PMSF，1米米苯甲脒和5 m米EDTA在4°C下2天。通过离心分离氯化钠提取物和不溶性残留物。用0.1 mg/ml胃蛋白酶在0.5中进一步消化残渣米在4°C下乙酸24小时，以溶解交联胶原蛋白。在0.8时，I型和V型胶原蛋白从胃蛋白酶消化物中沉淀米和2.2米NaCl，并通过离心收集。

凝胶电泳和质谱

在还原条件下用SDS-PAGE凝胶电泳分离胶原链，并用考马斯蓝染色鉴定。切下单个胶原蛋白α链并进行凝胶内胰蛋白酶消化(26). 使用配备在线LC（ThermoFinnigan）的LCQ Deca XP离子阱质谱仪，使用C8毛细管柱（300×150 mm；Grace Vydac 208MS5.315），以4μl/min的速度洗脱，对胰蛋白酶肽进行电喷雾质谱。LC流动相由缓冲液a（MilliQ水中0.1%甲酸）组成和缓冲液B（0.1%甲酸在3:1乙腈中：n个-丙醇（v/v）。序列搜索软件（ThermoFinnigan）用于使用NCBI蛋白质数据库进行肽鉴定。Sequest没有发现的许多大的胶原蛋白肽必须通过计算可能的MS/MS离子并将其与实际的MS/MS进行匹配来手动识别。特定部位的3-羟基化百分比是根据含有3Hyp的离子的丰度来确定的，该丰度是同一种胰蛋白酶肽的3Hyp和Pro版本总和的一部分。

PPIB、CRTAP、P3H1、P3H2和P3H3基因表达的RT-PCR分析

正常成年大鼠软骨RNA购自Zyagen（加利福尼亚州圣地亚哥）。SAOS-2细胞总RNA是使用我们描述的RNeasy试剂盒（Qiagen）从细胞中获得的(27). 对于RCS-LTC细胞，根据制造商的规范，使用PureLink RNA迷你试剂盒（Invitrogen）分离总细胞RNA。根据制造商的规范，使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）在热循环器（Bio-Rad）中从2μg RNA中产生cDNA。如上从各种大鼠和人细胞或组织RNA样品产生的cDNA用于产生脯氨酸顺反异构酶的基因产物，PPIB公司（大鼠100bp；人171bp）；软骨相关蛋白，CRTAP公司（大鼠189bp；人213bp）；第3H1页/LEPRE1公司（大鼠178bp；人226bp）；第3H2页/LEPREL1公司（大鼠233bp；人164bp）；和第3页3/麻风2（大鼠，130 bp；人类，270 bp）。使用的引物序列如下（5′至3′）：大鼠GAPDH（正向，ATGACTACCACGGAG；反向，TACTCACCAGCATCACC）和人GAPDHPPIB公司（正向，GGTGGATGCGCCTCTCG；反向，ACGGAGTCCAGCAGAA）和人类PPIB公司（向前，GCAAGATCGAGGTGGAGAG；向后，CTGTGGAATGTGAGGT），大鼠CRTAP公司（正向，GCGCGCAGTATGAGGCTAC；反向，AGTTGCGGTGCAGAGGCC），人类CRTAP公司（正向，GGTTTAAGGGCAGTCCTCTGGC；反向，GTGAAGACACATTGGAGGCTGAGG），大鼠第3H1页（正面，GTGAAGAGCTGGACCTGGAG；反面，ACCCAGACATGGTGTA），人类第3H1页（正向，GACTTCCTCCCATCGCATTA；反向，TTTCCAGTAGGCTTGTGT），大鼠第3H2页（正面，AAGCCACACCTGGAAAGCTA；反面，TGCTGACACCAGAACCTG），人类第3H2页（向前，GTGCAACTGTCCTGAAAGCA；向后，TCGGCAGACCATGTGTGTGTAT），大鼠第3页3（正向，CCCCTCATAGTCCTCCACGAA；反向，AAGGTGCTACTGCTCACT）和人类第3页3（向前，CGGACTCCTCTACCTCACACG；向后，TCTTCCTCCTCCTCGTGA）。

每个PCR扩增周期包括在94°C下变性20 s，在55°C下退火20 s，以及在72°C下延伸1 min，共30个周期。样品在2%琼脂糖凝胶（研究产品国际公司）上运行，该凝胶在含有溴化乙锭（Invitrogen）的Tris acetate-EDTA缓冲液中染色。

P3H基因表达的实时PCR（定量PCR）分析

大鼠mRNA的鉴定第3H1页,第3H2页、和第3页3使用TaqMan基因表达分析探针和每个基因的引物集（Applied Biosystems）对每个cDNA样本执行三次，第3H1页（Rn01642789_m1），第3H2页（Rn01404939_m1），以及第3页3（01459473_m1卢比）。使用Applied Biosystems 7900HT实时PCR系统分析样本。ΔΔ阈值循环C类T型)方法以真核18S rRNA（Hs03928990_g1，Applied Biosystems）为参考基因，以RCS-LTC细胞和正常成年大鼠软骨的混合cDNA为校准物，进行基因扩增分析。

基因沉默

预先设计的大鼠隐形RNAiTM公司siRNA-Select RNAi构建物（Invitrogen）被用于特异性敲除RCS-LTC细胞中的P3H1（leprecan 1，目录号RSS300139）、P3H2（lepercan like 1，目录编号RSS305239）、P3H3（leprecan-like 2，目录号RSA55963）。隐形RNAiTM公司siRNA阴性对照药物GC（目录号12935-300，Invitrogen）作为对照。将含有25μg/ml抗坏血酸和100μg/mlβAPN的无血清OptiMEM中的RCS-LTC细胞转染200 n米小核糖核酸/5×105细胞，根据制造商的方案使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染Rat1细胞系。转染72小时，每24小时添加一次新鲜培养基和siRNA。在此期间，从细胞层提取pN II型胶原蛋白，并通过质谱分析脯氨酸3-羟基化。P3H2蛋白通过Western blotting检测，如下所述。

免疫印迹分析

通过用D-PBS（Hyclone）冲洗培养细胞平板，添加含有蛋白酶抑制剂（Roche Applied Science）的放射免疫沉淀分析缓冲液（Sigma），以及冻融三个周期（偶尔出现漩涡），制备培养细胞平板的总裂解物。通过10000×离心将裂解液中的不溶物清除克用SDS-PAGE在6%聚丙烯酰胺凝胶上分离样品中等分的蛋白质，并转移到PVDF膜上。根据使用P3H2抗体（Sigma HPA007890，1:1000）的标准程序封闭并探测印迹。使用增殖细胞核抗原抗体（Stressgen Biotechnologies，1:1000）控制蛋白质负载(28). 用山羊抗兔或山羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶（Bio-Rad，1:5000）作为二级抗体。使用SuperSignal West Pico底物（Thermo Scientific）通过化学发光进行检测(21).

结果

RCS-LTC细胞中P3H同工酶的基因表达及A类胶原中3Hyp的表达

RT-PCR分析表明，正常成年大鼠软骨和RCS-LTC细胞均表达脯氨酸3-羟基化复合物的所有成分（P3H1、CRTAP和PPIB）以及同工酶P3H2和P3H3(图2A类). 三种P3H同工酶的正常大鼠软骨定量PCR显示P3H2的表达最低，但RCS-LTC细胞表达的P3H2 mRNA比正常大鼠关节软骨高8倍。此外，与大鼠软骨相比，RCS-LTC细胞以相对较高的水平表达所有P3H同工酶(图2B类).

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的表达式PPIB、CRTAP,第3H1页,第3H2页、和第3页3在RCS-LTC细胞系和大鼠软骨中。 A类，RCS-LTC细胞转录所检测的全部基因。与成年正常大鼠软骨相比，RCS-LTC细胞表达丰富的P3H2。B类，通过定量PCR进行定量比较第3H1页,第3H2页、和第3页3RCS-LTC细胞和正常成年大鼠软骨之间的mRNA表达使P3H1的表达适度增加，P3H3的表达增加了约2倍，而RCS-LTC细胞中的P3H2增加了8倍。数据代表n个每种同工酶=3。

为了确定高P3H同工酶表达是否对RCS-LTC细胞合成的A链胶原中脯氨酸残基的3-羟基化有影响，在凝胶内胰蛋白酶消化后，用离子阱串联质谱分析基质pNα1（II）胶原链。Pro-986的主（A1）站点显示3Hyp占用率为100%(图3A类)与RT-PCR数据一致，表明P3H1蛋白复合物的所有三个组分均表达。此外，A2站点的3Hyp占用率较高，Pro-944（56%），A3站点的3Hyp占用率适中，Pro-707（45%），A4站点的Pro-470占用率较低（<10%）。（GPP）中的候选脯氨酸残基4-胶原蛋白三螺旋C末端的含有重复序列的肽显示，每个肽的质量高达3个3Hyp残基，如下图所示图3A类。根据母体离子梯，每个肽的3Hyp残基含量从零到三个不等。该多个站点和其他单个站点的估计平均占用率总结如下图3B类。

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RCS-LTC pNα1（II）胶原链的串联质谱分析。 A类，pNα1（II）的胰蛋白酶肽LC-MS图谱的全扫描质谱，穿过包含Pro-986、Pro-944和Pro-707、Pro-470和C末端（GPP）的翻译后变体的洗脱窗口4重复。所示离子的相对丰度提供了A1、A2、A3、A4和C末端GPP重复位点3-羟基化程度的指数。如图所示，Pro-944占3Hyp的56%，Pro-986占3Hyp的100%。B类，来自RCS-LTC细胞外基质的pNα1（II）胶原链中位点的脯氨酸残基3-羟基化的相对丰度（%）的总结。

因为RCS-LTC细胞不能处理pN II型胶原分子并在基质中沉积pN II型微纤维聚合物(22)，这使得能够搜索N-前肽小螺旋中是否存在3Hyp（参见图1A类). 结果显示，在（GPP）内的四个候选脯氨酸中没有检测到3Hyp4重复发生在小螺旋的C末端。

基因沉默为P3H2的首选底物提供线索

RCS-LTC细胞中P3H2的高相对丰度和pN-α1（II）胶原链中3-羟基脯氨酸残基的异常高含量表明，这种酶可能负责非A1位点的脯氨酸3-羟基化。为了研究这一点，RCS-LTC细胞在特异性干扰和沉默P3H2同工酶的siRNA寡核苷酸存在下培养72小时。如中所示图4A类，当用P3H2特异性抗体探测细胞裂解物时，观察到P3H2蛋白的显著敲低。与对照siRNA或P3H1和P3H3 siRNA处理的培养物相比，这种下降是明显的，P3H2水平没有重大变化。

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RCS-LTC细胞系培养中P3H2的RNA干扰。 A类对来自siRNA处理的培养物的等分细胞裂解物进行Western blot检测P3H2蛋白。P3H2抗体在siRNA-处理和对照siRNA--处理的培养物中与80-kDa带强烈反应。仅在P3H2 siRNA处理的培养物中观察到谱带强度明显降低。检测增殖细胞核抗原蛋白作为负荷对照。采用球蛋白分子量标准。B类考马斯蓝染色凝胶显示，从P3H2 siRNA-处理和未处理培养物中提取的pNα1（II）胶原链数量相似。通过质谱分析了来自控制siRNA和P3H2 siRNA处理通道的这条带。软骨寡聚基质蛋白(压缩机)，α1（IX）胶原链和软骨基质蛋白1(化学机械抛光)细胞系合成的产物也通过质谱鉴定。采用球蛋白分子量标准。C类，用串联质谱法测定pNα1（II）胶原链中脯氨酸残基的3-羟基化程度（%）。来自P3H2 siRNA处理和对照siRNA处理的通道的pNα1（II）链进行凝胶内胰蛋白酶消化，并分析含有3Hyp位点的肽。由于P3H2蛋白的抑制，所有非A1位点的3Hyp占有率均下降。

P3H2 siRNA处理、对照siRNA、P3H1和P3H3 siRNA处理的培养物提取物中总胶原蛋白的SDS-PAGE显示，从细胞层提取的II型胶原蛋白数量没有明显差异(图4B类). 与对照培养物相比，pN-α1（II）胶原链胰蛋白酶消化物的质谱显示，除P3H2靶向siRNA培养物中的Pro-986残基外，所有底物脯氨酸中的3Hyp占有率均降低(图4C类). Pro-944、Pro-707和C末端GPP重复序列分别减少了56-43%、47-30%和64-43%。1723.8时的所有三个肽离子2+, 1730.82+, 1739.52+与对照组相比，GPP重复肽中的一个、两个和三个3Hyp在P3H2靶向siRNA培养物中被抑制(图4C类). 与对照培养物相比，P3H3靶向siRNA培养物在Pro-944、Pro-470和Pro-986的3Hyp占用率没有变化。Pro-707和C末端GPP重复序列分别减少了47-38%和64-52%。由于Pro-986（P3H1同工酶的底物）与对照组保持不变，减少的P3H2酶的作用仅在非A1位点，这意味着P3H2参与Pro-944、Pro-707和C末端GPP重复的3-羟基化。

P3H2负责α2（V）和α2（I）胶原链中特定脯氨酸残基的3-羟基化

为了证实P3H2 3-羟基化非A1位点的发现，对其他A链胶原链进行了检测。由于RNAi基因沉默不能完全敲除RCS-LTC细胞中的P3H2活性，因此采用了不同的方法。根据最近的一份报告，P3H2在一些癌细胞中被表观遗传学沉默(29)在Western blots上筛选培养的人乳腺癌、软骨肉瘤和骨肉瘤细胞的细胞裂解液中的P3H2蛋白。图5A类显示了在MB 231乳腺癌细胞的裂解液中检测到的P3H2蛋白，正如预期的那样，据报道这些细胞表达该基因(29). P3H2也在人软骨肉瘤细胞系CH1.2细胞中检测到。图5A类还显示，在SAOS-2骨肉瘤细胞的裂解液中未检测到P3H2蛋白。当在MB 361乳腺癌细胞的裂解液中未检测到P3H2时，确认了P3H2抗体的特异性(图5A类). 这个第3H2页据报道，这些细胞中的基因表观遗传沉默(29). RT-PCR证实在SAOS-2细胞中不存在P3H2信息，而P3H1、PPIB、CRTAP和P3H3则强烈表达(图5B类).

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的表达式PPIB公司,CRTAP公司,第3H1页,第3H2页、和第3页3在SAOS-2细胞系中。 A类用P3H2抗体在Western blots上检测MBA 361和MBA 231人乳腺癌细胞、CH1.2人软骨肉瘤细胞和SAOS-2人骨肉瘤细胞的细胞裂解物。该抗体未能检测到MBA 361和SAOS-2细胞中的P3H2蛋白。B类，RT-PCR证实第3H2页SAOS-2细胞。第3H1页,CRTAP公司,PPIB公司、和第3页3表达强烈。C类，考马斯蓝染色凝胶，显示I型胶原蛋白(中间车道)和V型胶原蛋白(右车道)从培养的SAOS-2细胞的细胞外基质中提取。对照组为人骨I型胶原蛋白(左车道). 切断α1（I）、α2（I）和α2（V）带，并用质谱法分析3Hyp占位。

从SAOS-2细胞形成的基质中纯化的胶原在电泳上显示出I型和V型胶原链，这与成骨细胞表型的预期一致(图5C类). 因为α2（V）胶原链（来自人类骨骼）在所有A链分支的A1、A2、A3和A4位点具有最完整的3Hyp残基占据模式(19)，评估SAOS-2培养物中α2（V）的占据模式。图6A类与正常人体骨骼中的α2（V）相比，Pro-944的3-羟基化率为12.5%，Pro-707的羟基化率则为18%（分别为59%和76%）。图6B类总结了结果并表明，与正常骨相比，α2（V）中的Pro-986和Pro-470未受影响。与正常骨骼一样，来自SAOS-2细胞的α1（I）在Pro-986处完全羟基化，在GPP重复序列的C末端或α2（V）链中未检测到3Hyp。只有肌腱α1（I）链在该部位严重3-羟基化(20).

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SAOS-2细胞沉积的基质胶原中3Hyp的串联质谱分析。 A类,B类将SAOS-2细胞系的α2（V）链与人骨进行比较。显示了包含Pro-986（A1）、Pro-944（A2）和Pro-707（A3）的翻译后变体洗脱窗口中α2（V）的胰蛋白酶肽LC-MS图谱的全扫描质谱。C类，总结了SAOS-2细胞和正常人骨骼中α2（V）、α2（I）和α1（I）胶原链部位的%prolyl3-羟基化水平。

讨论

研究结果表明，P3H2同工酶可以在原纤维胶原链的特定Gly-Pro-4Hyp位点上产生3-羟基脯氨酸。以前使用重组酶的研究在体外已经表明P3H2可以3-羟基化合成肽，该肽与α1（IV）胶原链中已知3-羟基化位点的序列相匹配(16). 由于两个原因，推测P3H2存在额外的底物。首先，这种同工酶的mRNA在表达纤维胶原的胚胎和成人组织以及富含基底膜的组织中表达(17,18). 第二，最近在A分支纤维胶原链中发现的非A1位点与IV型胶原中已知的脯氨酸3-羟基化位点具有相同的序列特征，尤其是A2和A3位点脯氨酸底物残基的苯丙氨酸N末端。在α1（IV）和α2（IV）链中都存在类似的含3Hyp序列(30).

结果与P3H2一致，P3H2至少部分负责Pro-944、Pro-707和C末端（GPP）的3-羟基化4α1（II）链中的重复位点。RCS-LTC细胞高水平表达P3H2（是正常大鼠软骨细胞的8倍；图2)，支持这一点。由于该水平如此之高，这可能解释了为什么在敲除实验中，pNα1（II）胶原蛋白A2位点的3Hyp占有率仅受到适度抑制(图4C类). SAOS-2细胞缺乏P3H2蛋白，与α2（V）A2位点3Hyp低相关(图6)也符合P3H2主要负责α1（II）Pro-944羟基化。剩余的3Hyp可能由P3H1或P3H3产生。有充分证据表明，由P3H1缺失突变患者的皮肤成纤维细胞制造的α1（I）胶原链在Pro-986具有较低但显著的3Hyp占有率(8–10). 与正常骨相比，SAOS-2细胞中缺乏P3H2酶表达，Pro-707α2（V）和α2（I）胶原链中3Hyp的占有率低(图6)支持P3H2是负责这种羟基化的主要酶。与骨骼相比，α2（V）Pro-470的3Hyp水平相似，表明P3H2可能不会改变该部位。siRNA处理的RCS-LTC培养物中pNα1（II）Pro-470的3Hyp水平不变(图4C类)与此一致。SAOS-2中Pro-707处的残余3Hyp可能是由P3H3引起的。P3H3 siRNA-处理的RCS-LTC培养物中pNα1（II）Pro-707的3Hyp水平略微降低与此一致。P3H1酶与CRTAP和亲环素B的复合物似乎只负责α1（I）、α1（II）和α2（V）链中Pro-986的羟基化(8,11)，而P3H2和P3H3可能只在其他部位有活性。此外，A1位点的氨基酸序列基序与非A1位点的不同(19). P3H2和P3H3的不同底物特异性以及调节其活性的任何蛋白质复合物的性质在很大程度上尚未探索。

因为SAOS-2和RCS-LTC细胞都不合成IV型胶原，所以他们无法了解P3H2在IV型胶原3Hyp形成中的作用。P3H1、P3H2和P3H3在IV型胶原脯氨酸3-羟基化中的相对作用尚不清楚，尽管这三种蛋白都在IV型富含胶原蛋白的基底膜中表达(7,16,17). 事实上，P3H1最初是作为leprecan分离出来的，leprecan是一种来自大鼠壁卵黄囊肿瘤细胞系的基底膜相关蛋白聚糖(7).

正常哺乳动物软骨中，α1（II）的Pro-707或Pro-470不存在3Hyp(19). 鸡软骨α1（II）Pro-707为18%3-羟基化(31). 我们得出结论，RCSα1（II）链中从Pro-470到Pro-707再到Pro-944的3Hyp水平逐渐升高是P3H2过度表达的结果，GPP的3Hyp也是如此4在C终点重复。后一个位点与大鼠尾腱α1（I）和α2（I）胶原链中的水平相当(20).

RCS-LTC细胞对完全未处理的pN II型胶原的基质沉积(22)允许我们检查N-前肽的小三螺旋中的候选脯氨酸残基是否3-羟基化。在软骨中，该结构域通常在纤维生成时从前胶原分子中移除。从正常软骨中纯化II型N-丙烯酰亚胺是一项挑战，因此我们无法检测（GPP）4通过质谱在该域的C末端重复3Hyp，直到现在。结果清楚地表明，尽管与正常大鼠软骨相比，RCS-LTC细胞中所有三种P3H同工酶的水平都很高，但在该GPP重复序列中没有脯氨酸3-羟基化(图2B类). 在主螺旋中的位点从C末端到N末端观察到的3Hyp含量逐渐降低，这与从C末端开始并随着三螺旋折叠而停止的3-羟基化一致(图3).

我们已经报道了α1（II）胶原蛋白A2位点（Pro-944）3-羟基化程度的变化是组织特异性的，范围从牛关节软骨<10%，椎间盘髓核40%，到眼睛玻璃体90%(19). 在本研究中，我们观察到RCS-LTC细胞（57%）pNα1（II）A2位点的3Hyp水平也很高。P3H2在成年小鼠眼组织中的表达也很高(17). 因为RCS-LTC细胞系对II型胶原蛋白的加工被阻滞在Ⅱ型胶原蛋白pN阶段(22)玻璃体中II型胶原的功能形式主要是pN II型胶原(32)很容易推测N-前肽的保留和独特的脯氨酰3-羟基化模式可能相关。N-前肽在胶原分子的主三螺旋上折回，这可能是ADAMTS-3切割的结构先决条件，ADAMTS-3是软骨中II型胶原的前胶原N-前肽酶(33–37). 在纤维内的这种构象中，N-前肽裂解位点可能与4D-周期交错的相邻分子中的Pro-944紧密对齐，如图1B类Pro-944、Pro-707和Pro-470处的脯氨酰3-羟基化是否会改变N-脯氨酸裂解的敏感性，或者相反，N-脯肽去除失败是否会导致短纤中三螺旋结构域的脯醛3-羟基化继续？这是高度推测性的，但鉴于目前对胶原蛋白组装和脯氨酰3-羟基化调节机制的理解范围，这在可能性范围内。

总之，肿瘤衍生细胞系RCS-LTC和SAOS-2已被证明是研究胶原翻译后修饰控制机制的有用系统。除了本文报道的脯氨酰3-羟基化外，先前的研究表明，与正常成骨细胞相比，SAOS-2细胞过度表达PLOD1（赖氨酰羟化酶1）(23)以及RCS-LTC细胞沉积的pN II型聚合物中的高水平羟基吡啶交联(21).

致谢

我们感谢David M.Hudson博士对手稿的批判性审查，感谢James Wu博士的有益讨论，感谢Lammy Kim博士的技术专长。

*这项工作得到了国立卫生研究院、NIAMS拨款AR057025（发给R.J.F.）和AR036794和AR037318（发给D.R.E.）的全部或部分支持。这项工作还得到了国家研究资源中心拨款TL1 RR025016（给A.W.F.）和华盛顿大学欧内斯特M.伯吉斯捐赠主席研究项目的支持。

2使用的缩写如下：

第3H1页
脯氨酰3-羟基化酶1
3液压
3-羟脯氨酸。

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会