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神经科学杂志。2011年4月27日；31(17): 6277–6288.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.0450-11.2011
预防性维修识别码：PMC3160240型
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院291957
PMID：21525267

β-肾上腺素能受体拮抗剂预防反复社交失败引起的焦虑样行为和小胶质细胞反应

埃里克·沃勒布,1中，2,* 马克·汉克,1中，* 安吉拉·W·科罗纳,2 尼科尔·鲍威尔,1 拉托尼亚·M·斯蒂纳,1 迈克尔·T·贝利,1中，三 兰迪·J·纳尔逊,三，4 乔纳森·戈德布特,2,三，5和约翰·谢里丹通讯作者1中，2,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

心理社会应激与免疫功能改变和包括焦虑和抑郁在内的心理障碍的发展有关。在这里，我们表明，在小鼠中重复的社交失败会增加与恐惧和威胁评估相关的大脑区域的c-Fos染色，并以β肾上腺素能受体依赖的方式促进焦虑样行为。反复的社会失败也显著增加了CD11b的数量+/CD45型高的/Ly6C型高的向大脑输送的巨噬细胞。此外，社交失败后，小胶质细胞（CD14、CD86和TLR4）和巨噬细胞（CD14和CD86）表面的一些炎症标记物增加。反复的社交失败也增加了内侧杏仁核、前额叶皮层和海马中紊乱的小胶质细胞的存在。此外，小胶质细胞的mRNA分析表明，反复的社交失败增加了白细胞介素（IL）-1β的水平，降低了糖皮质激素反应基因[糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链（GILZ）和FK506结合蛋白-51（FKBP51）]的水平。β-肾上腺素能受体拮抗剂普萘洛尔可阻止小胶质细胞和巨噬细胞的应激依赖性变化。从社交失败小鼠中分离并培养的小胶质细胞体外与对照小鼠的小胶质细胞相比，经脂多糖刺激后产生的IL-6、肿瘤坏死因子-α和单核细胞趋化蛋白-1水平显著升高。最后，反复的社交失败增加了IL-1受体-1型缺陷小鼠的c-Fos活化，但在缺乏功能性IL-1受体1型的情况下，并没有促进焦虑样行为或小胶质细胞活化。这些发现表明，反复社交失败诱导的焦虑样行为和小胶质细胞反应性的增强依赖于β-肾上腺素能和IL-1受体的激活。

介绍

心理社会应激源激活神经内分泌途径，释放儿茶酚胺、糖皮质激素和细胞因子。这些应激源诱导的途径对人类和啮齿动物的行为、免疫和生理都有深远的影响(Blanchard等人，2001年;Kiecolt-Glaser和Glaser，2002年;Kinsey等人，2007年;Cole等人，2010年). 例如，在老鼠身上重复的社交失败会促进焦虑行为(Kinsey等人，2007年;Krishnan等人，2007年)改变对病毒和细菌挑战的免疫反应(Bailey等人，2009年;Mays等人，2010年). 这些免疫变化与外周髓细胞（CD11b）敏感性降低有关+)糖皮质激素（GC）抗炎反馈(Stark等人，2001年). 此外，社会失败促进了这些抗GC CD11b的贩运+从骨髓到脾和肺的细胞(Engler等人，2004年;Curry等人，2010年). 抗GC CD11b+社交失败小鼠的细胞更具炎症性，抗原刺激后炎性细胞因子、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子α和IL-1β的产生增加(Stark等人，2001年;Avitsur等人，2003年;Bailey等人，2009年). 这些髓细胞的炎症特征和GC敏感性增加可能是由IL-1β驱动的。为了支持这一前提，CD11b+缺乏白细胞介素-1受体1型（IL-1r1）的小鼠细胞−/−)在多次社交失败后，不要产生GC抵抗力(Engler等人，2008年). 尽管这些发现表明，反复的社交失败会增加外周血CD11b的促炎症特征+细胞，反复社交失败对常住CD11b炎症特征的影响程度+中枢神经系统的细胞未知。

这是相关的，因为CNS巨噬细胞和小胶质细胞是CD11b+在解释和传播脑内炎症信号中起关键作用的细胞(Nguyen等人，2002年;Davalos等人，2005年;Nimmerjahn等人，2005年). 例如，一些压力源包括不可避免的冲击(Frank等人，2007年)和约束应力(奈尔和邦诺，2006年;Tynan等人，2010年)增强小胶质细胞的炎症特征。应激激活小胶质细胞和巨噬细胞的途径尚不清楚。然而，似乎在应激期间β肾上腺素能受体的激活通过增加IL-1β的表达而增强CNS内的炎症(Johnson等人，2008年;McNamee等人，2010年). 此外，反复的社交失败会促进小鼠皮层中类似的炎症模式和β-肾上腺素能受体介导的基因表达（例如，GATA1），这与人类在长期社交应激后检测到的外周炎症增加相一致(Cole等人，2010年).

因此，本研究的目的是了解社交失败引发的炎症信号是如何在大脑中解释和传播的。我们的数据表明，反复的社交失败会增加与威胁和恐惧评估相关的大脑区域的c-Fos激活，并促进焦虑样行为。社交失败也增强了CD11b的炎症特征+大脑中的小胶质细胞和巨噬细胞。社交失败诱导的c-Fos激活、焦虑样行为和神经炎症被β-肾上腺素能受体拮抗阻断。最后，功能性IL-1受体1的缺失阻断了社交失败诱导的小胶质细胞激活和焦虑样行为。

材料和方法

动物

雄性C57BL/6（6-8周龄）和CD-1（12个月龄，退休育种者）小鼠从Charles River育种实验室获得，实验前允许其适应周围环境7-10天。白介素-1 r1−/−C57BL/6背景的老鼠是宁泉博士（俄亥俄州哥伦布俄亥俄州立大学）送的礼物。C57BL/6小鼠被饲养在三只小鼠的队列中，CD-1小鼠被单独饲养在11.5×7.5×6英寸的聚丙烯笼中。房间在12:12小时光照：暗循环下保持在21°C随意获得水和啮齿动物食物。随机选择小鼠纳入实验治疗组。此外，在整个笼子内注射普萘洛尔和溶媒，以避免任何阶段内的混乱。所有程序均符合NIH《实验动物护理和使用指南》，并经俄亥俄州立大学实验动物护理与使用委员会批准。

社会干扰压力

如前所述进行了社会干扰应激（SDR）(Avitsur等人，2001年). 简言之，将一只雄性入侵CD-1小鼠（12个月的退休繁育者）在17:00至19:00之间连续6晚引入已建立的C57BL/6小鼠雄性队列（每个笼子三只）的笼子中2小时。在每个周期中，顺从的行为包括直立姿势、逃跑和蜷缩(Avitsur等人，2001年;Stark等人，2001年)观察到。如果入侵者没有在5-10分钟内发起攻击，或者被任何常驻老鼠攻击，那么就会引入新的入侵者。在2小时的时间结束时，入侵者被移走，居民们保持原状，直到第二天重复这个范例。连续几晚使用不同的入侵者。家鼠控制（HCC）小鼠也分为三组，但在单独的房间里保持安静。在整个实验过程中，测定小鼠的健康状况。将受伤或奄奄一息的小鼠从研究中移除。与之前使用重复社交失败的研究一致(Avitsur等人，2001年;Stark等人，2001年)<5%的小鼠（300只中的15只）符合早期清除标准。服用普萘洛尔后，入侵小鼠与从属小鼠之间的相互作用与溶媒对照组相比没有明显差异。

实验协议

在第一项研究中，成年雄性C57BL/6小鼠经历了一到三个社交失败周期。对小鼠进行深度麻醉，然后用PBS经心灌注4%甲醛。收集、切片大脑并用于c-Fos分析(n个= 3).

在第二项研究中，成年雄性C57BL/6小鼠在六个社交失败周期的每一个周期之前接受皮下注射赋形剂（无菌盐水中0.2%乙醇）或10 mg/kg普萘洛尔（盐酸普萘洛耳；Sigma-Aldrich）。普萘洛尔是一种脂溶性非选择性β-肾上腺素能受体拮抗剂，可跨越血脑屏障，在外周给药后至少12小时内有效(Johnsson和Regárdh，1976年;Salako等人，1979年). 在第六个社交失败周期结束后，立即对小鼠进行深度麻醉，并用PBS经心灌注，随后再灌注4%甲醛。收集、切片大脑并用于c-Fos分析(n个= 4–10).

在第三项研究中，成年雄性C57BL/6小鼠在六个社交失败周期的每一个周期前1小时皮下注射赋形剂或普萘洛尔（10 mg/kg）。在最后一轮社交失败后14小时，确定了对光/暗的偏好(n个= 10–16). 小鼠被一氧化碳杀死2行为测试完成后窒息。测定脾脏重量(n个= 7–18). 用EDTA衬里的1ml注射器通过心脏穿刺采集血液。离心全血，收集血浆，测定IL-6水平(n个= 8–10).

在第四组研究中，成年雄性（6-8周龄）C57BL/6小鼠在六个社交失败周期的每一个周期前1小时皮下注射赋形剂或普萘洛尔（10 mg/kg）。在第六个社交失败周期后14小时，小鼠被CO杀死2通过不连续的Percoll密度梯度分离窒息和小胶质细胞/巨噬细胞。细胞用于流式细胞术分析CD11b、CD45、TLR4、CD14、MHC-II、CD86和Ly6C的表达或总RNA分离/定量PCR（IL-1β、GR、GILZ和FKBP51）(n个= 6–8). 在细胞分离和流动分析之前，对小鼠的亚组进行经心灌注。在一组相关的研究中，C57BL/6小鼠经历了六个社交失败周期，14小时后被处死。通过不连续Percoll密度梯度分离细胞并培养体外.

在第五组研究中，成年雄性（6-8周龄）C57BL/6小鼠在六个社交失败周期的每一个周期前1小时皮下注射赋形剂或普萘洛尔（10 mg/kg）。在第六次社交失败14小时后，对小鼠进行深度麻醉，并用PBS经心灌注，然后再灌注4%甲醛。收集、切片大脑，并用于电离钙结合适配器分子-1（Iba-1）分析(n个= 3–4).

在最后一组研究中，成年男性（6-8周龄）C57BL/6野生型或IL-1r1−/−老鼠们遭受了反复的社会失败。第六个周期后14小时，确定了对光/暗的偏好。行为测试后，对小鼠进行深度麻醉，经心灌注PBS，然后灌注4%甲醛，并取出大脑进行Iba-1和c-Fos分析(n个= 4–5).

c-Fos染色。

如前所述进行c-Fos染色(Trainor等人，2008年). 简而言之，收集大脑并在4°C下将其固定在5%丙烯醛中24小时，然后清洗，再在30%蔗糖中培养24小时。冷冻保存的大脑，然后使用Microm HM550低温恒温器（Mikron Instruments）切片（40μm）。根据立体定向小鼠脑图谱，通过参考标记物对脑区进行解剖鉴定(帕西诺斯和富兰克林，2004年). 用1%硼氢化钠揭开抗原，用20%正常山羊血清和0.3%过氧化氢封闭切片。接下来，将切片与含1%NGS的兔抗鼠c-Fos抗体（Calbiochem）在4℃孵育过夜。清洗切片，然后用生物素化山羊抗兔二级抗体孵育2小时。使用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）方案进行c-Fos染色。切片放入猪明胶（10%）中，转移到载玻片上，盖上玻片。使用尼康Optishot显微镜和三洋CCD摄像机拍摄图像，并使用NIH ImageJ软件测定c-Fos阳性细胞的数量。

焦虑样行为。

如前所述，使用光/暗偏好测试确定焦虑行为(Kinsey等人，2007年). 简言之，试验装置由一个40×40×25 cm有机玻璃盒组成，该有机玻璃盒被划分为相等的区域（即亮区和暗区），并带有连接两侧的门道。暗区是封闭的，光线明显较少（<3勒克斯）。为了开始测试，将小鼠置于轻侧，使用自动系统（AccuScan仪器）记录运动活动5分钟，并使用VersaMap软件进行分析。

IL-6。

根据制造商的说明（BD Biosciences），使用BD OptEIA小鼠IL-6 ELISA从血浆中测定IL-6。简而言之，96个酶免疫分析板涂有抗小鼠IL-6捕获抗体，并在4°C下培养过夜。添加样品和IL-6标准品（0–1000 pg/ml），并在室温（RT）下培养2 h。洗板并用生物素化抗小鼠IL-6抗体孵育。将板洗涤并与链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物一起孵育。在RT下孵育1小时后，洗涤平板并与四甲基联苯胺液体底物孵育15分钟。终止反应并使用Spectramax Plus在450nm处读取吸光度384读板器（分子器件）。该试验对10 ng/ml IL-6敏感，试验间和试验内变异系数<10%。

小胶质细胞的分离。

如前所述，从全脑匀浆中分离出小胶质细胞(Henry等人，2008年,2009;Wynne等人，2010年). 简而言之，通过70μm尼龙细胞过滤器，在pH 7.4的HBSS中使大脑均匀化。结果匀浆在600×克去除上清液，并在室温下将细胞颗粒重新悬浮在70%等渗Percoll（GE Healthcare）中6分钟。不连续Percoll密度梯度分层如下：70%、50%、35%和0%等渗Percoll。梯度离心20分钟，2000×克从70%和50%Percoll层之间的间期收集小胶质细胞(Frank等人，2006年a;Nair等人，2007年). 清洗细胞，然后将其重新悬浮在无菌HBSS中。用血细胞仪和0.1%台盼蓝染色法测定活细胞数。每次脑提取产生约3×105活细胞。根据先前的研究，这些细胞将被称为富集小胶质细胞，研究表明，通过Percoll密度梯度从脑匀浆中分离出的活细胞产生>90%的小胶质细胞(Henry等人，2009年;Wynne等人，2010年).

小胶质细胞染色和流式细胞术。

如前所述，对小胶质细胞表面抗原进行染色(Henry等人，2008年,2009). 总之，Fc受体被抗CD16/CD32抗体（eBioscience）阻断。清洗细胞，然后用适当的结合抗体CD45、CD11b、CD14、TLR4或CD45、CD11b、CD86、MHC-II或CD45，CD11b（eBioscience）和Ly6C（BD Bioscienses）培养45分钟。清洗细胞，随后将其重新悬浮在FACS缓冲液中（HBSS中2%的FBS和1 mg/ml叠氮化钠）进行分析。使用非特异性、同型匹配抗体评估非特异性结合。使用Becton-Dickinson FACSCaliber四色细胞仪测定抗原表达。每个样品和同种型匹配的缀合物记录了一万个事件。使用FlowJo软件（Tree Star）对数据进行分析，并根据相应阴性同型染色对照的非特异性结合来确定每个抗体的门控。

小胶质细胞的形态学分析。

为了染色Iba-1，小鼠被深度麻醉，并经心灌注无菌PBS（pH 7.4，EDTA）和4%甲醛。大脑在4%甲醛中后固定24小时，在20%蔗糖中再培养24小时。使用异戊烷（−78°C）冷冻固定的大脑，并使用Microm HM550低温恒温器（Mikron Instruments）切片（20μm）。根据立体定向小鼠脑图谱，通过参考标记物识别脑区(帕西诺斯和富兰克林，2004年). 切片安装在载玻片上，并用5%的正常山羊血清封闭。接下来，将切片在含有1%BSA的PBS中洗涤，并与兔抗小鼠Iba-1抗体（Wako Chemicals）一起孵育。对于荧光染色，切片在PBS中清洗，然后与荧光铬结合的二级抗体（Alexa Fluor 594）孵育。切片用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚DNA染色进行复染。将切片盖在25%甘油溶液中，并储存在−20°C下。对于非荧光Iba-1染色，大脑的制备和处理如上所述。切片在生物素化山羊抗兔二级抗体中培养，并使用DAB协议进行开发。这些剖面被Permount（Fischer-Scientific）覆盖。使用Leica DM5000B荧光显微镜观察荧光和DAB染色切片。使用徕卡DFC300 FX相机和成像软件拍摄图像。为了量化小胶质细胞的表型变化，数字图像分析（DIA）(Donnelly等人，2009年)Iba-1染色。在放大20倍的条件下，从每个脑区拍摄6张代表性图像。确定每个图像的阳性染色阈值，并使用ImageJ软件对阈值靶点进行密度扫描。比例面积被报告为所有代表性图片的正阈值中的平均百分比面积。

RNA分离和实时PCR。

使用RNeasy plus mini-kit（Qiagen）从Percoll-分离细胞中分离出RNA，通过分光光度法（Eppendorf）测定RNA浓度，并使用RT-RETROscript试剂盒（Ambion）将RNA反向转录到cDNA。如前所述，使用Applied Biosystems Assay on Demand Gene Expression协议进行定量PCR(Godbout等人，2005年). 简言之，cDNA通过实时PCR扩增，其中目标cDNA（如IL-1β、GR、GILZ和FKBP51）和参考cDNA（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）使用带有5′荧光报告染料（6-FAM）和3′猝灭染料（NFQ或TAMRA）的寡核苷酸探针同时扩增。在ABI PRISM 7300序列检测系统（应用生物系统）上测定荧光。使用比较阈值循环法对数据进行分析，结果表示为倍差。

通过细胞仪珠阵列进行原代小胶质细胞培养和细胞因子测定。

通过Percoll梯度分离收集的小胶质细胞进行计数，并将其接种在10万个细胞上-我-赖氨酸涂层96个钢板。将细胞置于完全RPMI中（含有10%热灭活胎牛血清、0.075%碳酸氢钠、10 m米HEPES缓冲液，100U/ml青霉素G，100μG/ml硫酸链霉素，1.5 n米 我-谷氨酰胺和0.0035%2-巯基乙醇），并用生理盐水或0.40μg/ml脂多糖（LPS；Sigma）、载体（0.2%乙醇）和0.10或5μ米皮质酮（西格玛）在37°C和5%CO下放置18小时2根据制造商的说明（BD Biosciences），采集上清，并使用小鼠炎性细胞因子细胞计数珠阵列（CBA）试剂盒检测分泌细胞因子（TNF-α、IL-12p70、IL-10、IFN-γ、MCP-1和IL-6）的浓度。为了进行比较，数据被标准化，并以来自同一治疗组的非皮质酮治疗培养物的百分比表示。

统计分析。

为了确保数据呈正态分布，使用统计分析系统（SAS）统计软件对数据进行Shapiro-Wilk检验。第一个和第三个四分位数的观察值>3个四分位范围被视为异常值，并在随后的分析中排除。为了确定主要影响因素和主要因素之间的交互作用，使用SAS的一般线性模型程序，使用单因素（应力，普萘洛尔）、双因素（应力克心得安）或三因素（应压力克心得安乐克区域）方差分析对数据进行分析。在适当的情况下，通过F类-受保护的t吨使用SAS的最小显著差异程序进行测试。所有数据均表示为处理平均值±SEM。

结果

反复社交失败诱导的中枢神经系统c-Fos激活是β-肾上腺素能受体依赖性的

重复的社交失败促进了随机红CD-1和近交C57BL/6小鼠的焦虑行为(Kinsey等人，2007年). 为了了解社交失败在中枢神经系统中是如何解释的，在与恐惧和威胁评估相关的几个脑区测定了c-Fos免疫反应，包括前额叶皮层（PFC）、外侧隔（LS）、终纹床核（BNST）、下丘脑室旁核（PVN）、内侧杏仁核（MeA）和海马（HPC）(Kollack-Walker等人，1997年;Martinez等人，2002年;科瓦奇，2008年). 在第一个实验中，C57BL/6小鼠经历了一到三个社交失败周期，并测定了c-Fos染色。社交失败周期的数量是显著的，因为至少需要三次重复暴露才能引起外周CD11b的糖皮质激素抵抗+单元格(Avitsur等人，2002年). PFC中c-Fos染色的代表性图像如所示图1A类.图1B类研究表明，一个和三个社交失败周期增加了大脑中c-Fos阳性细胞的数量（主要是压力的影响；F类(2,69)= 61.58,第页<0.0001）以脑区域依赖的方式（压力×区域相互作用；F类(10,69)= 3.95,第页< 0.0005). 例如，一个和三个社会失败周期显著增加了PFC中的c-Fos染色(第页<0.0001），LS(第页<0.002），BNST(第页<0.02），PVN(第页<0.005）和MeA(第页< 0.0001).

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社交失败诱导的中枢神经系统c-Fos反复激活是β肾上腺素能依赖性的。雄性C57BL/6小鼠接受一个或三个周期的SDR，在最后一个周期后立即收集大脑，并在PFC、LS、BNST、PVN、MeA和HPC中检测c-Fos染色。A类，显示了前额叶皮层（20×）c-Fos染色的代表性图片。B类，c-Fos阳性细胞的平均数量。C类,D类在一项相关研究中，在六个社交失败周期的每一个周期之前，向雄性C57BL/6小鼠皮下注射赋形剂或普萘洛尔（10 mg/kg）。在第六个社会破坏周期后立即收集大脑，并如上所述测定c-Fos染色。C类，显示了前额叶皮层（20×）c-Fos染色的代表性图片。D类，c-Fos阳性细胞的平均数量。误差条代表平均值±SEM(n个= 6–8). 不同字母（a、b或c）的平均值有显著差异(第页<0.05）。

因为这些大脑区域与儿茶酚胺能通路整合(Ulrich Lai和Herman，2009年)接下来，我们检查了非选择性β-肾上腺素能受体拮抗剂普萘洛尔阻止反复社交失败诱导的c-Fos表达的程度。尽管图1,A类和B类显示，在一个和三个社交失败周期后，c-Fos表达增强，在这些普萘洛尔研究中选择了六个社交失败的周期，因为六个周期促进外周CD11b的GC-抵抗+细胞并诱导长时间焦虑样行为(Avitsur等人，2002年;Kinsey等人，2007年). 在这些研究中，在六个社交失败周期的每一个周期之前，给C57BL/6小鼠注射载体或普萘洛尔，并在第六个社交挫折周期之后立即收集大脑。PFC中c-Fos染色的代表性图像如所示图1C类.英寸图1D类图中显示了每个脑区c-Fos阳性细胞的平均数量。方差分析显示，反复的社交失败增强了大脑中的c-Fos染色（压力、，F类(1,154)= 22.38,第页<0.0001），这种增加取决于大脑区域(F类(5,154)= 1.98,第页= 0.09).后hoc分析表明，反复的社交失败增加了PFC中的c-Fos染色(第页<0.002），LS(第页<0.002），PVN(第页<0.0001）和MeA(第页< 0.0001). 在所检查的区域中，反复社会失败后，PVN和MeA的c-Fos水平最高，但HPC和BNST的c-Fos水平没有变化。此外，普萘洛尔预处理阻止了应激诱导的c-Fos（应激×普萘洛耳相互作用，F类(1,154)= 22.8,第页<0.0001）在PFC中检测到(第页=0.07），LS(第页=0.08），PVN(第页<0.0001）和MeA(第页< 0.0001). 总的来说，这些数据表明，社交失败促进了大脑中独特的c-Fos激活模式，而这种激活模式被β-肾上腺素能受体拮抗剂预处理所阻断。

β-肾上腺素能受体拮抗剂可防止反复社交失败引起的焦虑样行为

由于用普萘洛尔阻断β-肾上腺素能受体可降低c-Fos的激活，因此研究了普萘洛耳对反复社交失败诱导的焦虑样行为的影响。C57BL/6小鼠在社交失败的每个周期之前服用普萘洛尔，并在社交失败第六个周期14小时后测定光/暗偏好。之所以选择这个时间点，是因为此时在CD-1和C57BL/6小鼠中检测到重复的社交失败诱导的焦虑样行为(Kinsey等人，2007年,2008).图2A类显示了亮/暗偏好范式中小鼠的典型运动图。与HCC小鼠（35.2±6.4 s）相比，遭受多次社会性失败的小鼠进入试验装置黑暗区的速度更快（17.2±4.9 s）（主要是应激效应，F类（1,45）=4.37，第页< 0.05) (图2B类).图2C类表明，反复的社会失败导致了在黑暗地带所花时间的显著增加（压力的主要影响，F类(1,45)= 11.55,第页< 0.002). 此外，用普萘洛尔对小鼠进行预处理后，随着进入暗区时间的增加，焦虑样行为减少（普萘洛耳的主要作用是，F类(1,45)= 5.39,第页< 0.03) (图2B类)并减少了在黑暗区的总时间（普萘洛尔的主要作用，F类(1,45)= 7.26,第页< 0.002) (图2C类). 值得注意的是，普萘洛尔单独治疗有助于降低肝癌小鼠的基线焦虑水平(第页= 0.10).

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反复普萘洛尔预处理阻断了反复社交失败诱导的焦虑样行为。在每六个SDR周期之前，将载体或普萘洛尔（10 mg/kg）皮下注射到雄性C57BL/6小鼠。在第六次社交失败后14小时，确定了对光/暗的偏好。A类，光明/黑暗测试范式中使用的小鼠的代表性运动路径。B类，进入暗区的平均时间。C类，在黑暗区的平均时间。条形代表平均值±SEM(n个= 10–16). 按照上述方法处理小鼠。D类,E类，脾脏重量(D类)和血浆IL-6水平(E类)已确定。条形代表平均值±SEM(n个= 9). 不同字母（a或b）的平均值有显著差异(第页<0.05）之间的差异。

在促进焦虑行为的同时，反复的社交失败会增加脾脏重量（即脾肿大）(Avitsur等人，2003年)、血浆IL-6水平(Stark等人，2001年,2002)和皮质酮水平(Avitsur等人，2001年). 这些变化被用来衡量对反复的社会失败的反应的稳健性。在每个社交失败周期后，皮质酮显著增加；然而，在第六次社交失败后14小时，皮质酮水平恢复到基线水平（数据未显示）。因此，在第六次社交失败14小时后测定脾脏重量和血浆IL-6水平。不出所料，社交失败增加了脾脏重量（压力的主要影响，F类(1,56)= 9.74,第页< 0.003) (图2D类)普萘洛尔预处理（应激×普萘洛耳相互作用，F类(1,56)= 7.24,第页< 0.01).图2E类显示了应激和普萘洛尔在IL-6水平上的类似相互作用。反复社交失败后，血浆IL-6升高（压力的主要影响，F类(1,35)= 7.72,第页<0.01），并通过普萘洛尔预处理（应激×普萘洛耳相互作用，F类(1,35)= 9.53第页< 0.005). 总之，这些数据表明，普萘洛尔预处理阻止了C57BL/6小鼠反复社交失败诱导的脾肿大，降低了血浆IL-6水平的升高，并使焦虑样行为恢复到基线水平。

反复的社会失败增加了CD11b的百分比+/CD45型高的/赖氨酸6C高的中枢神经系统中的巨噬细胞

先前的研究表明，反复的社会失败显著改变了髓源性CD11b的表型+外周细胞（如巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞）(Bailey等人，2009年;Powell等人，2009年;Curry等人，2010年)并增加了从骨髓到脾和肺的运输倾向(Engler等人，2004年;Kinsey等人，2008年;Curry等人，2010年). 因此，我们接下来试图确定CD11b的程度+反复的社会失败改变了中枢神经系统的细胞。在这些实验中，小鼠在每次社交失败之前都会服用载体或普萘洛尔。社交失败最后一个周期后14小时，采用Percoll密度梯度法收集小胶质细胞和巨噬细胞。图3A类显示了每个实验条件下CD11b和CD45染色的代表性双变量点图；小胶质细胞（CD11b+/CD45型低的)和巨噬细胞（CD11b+/CD45型高的)根据CD45表达进行区分(Nair等人，2007年).图3B类表明反复社会失败后巨噬细胞的百分比增加（压力的主要影响，F类(1,80)= 31.10,第页< 0.0001). 例如，巨噬细胞的近似百分比从HCC载剂小鼠的2.44%增加到社会干扰应激（SDR）载剂小鼠中的7.36%(图3A类,B类). 此外，反复社交失败后巨噬细胞的增加被普萘洛尔预处理（应激×普萘洛耳相互作用，F类(1,80)= 7.37,第页< 0.008).

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反复的社会失败增加了CD11b的百分比+/CD45型高的/赖氨酸6C高的中枢神经系统中的巨噬细胞。在每六个SDR周期之前，将载体或普萘洛尔（10 mg/kg）皮下注射到雄性C57BL/6小鼠。在第六次社交失败后14小时收集大脑CD11b+通过Percoll梯度分离富集细胞，并通过流式细胞术测定CD11b、CD45和Ly6C的表达水平。A类，CD11b/CD45染色的代表性双变量点图。B类，CD11b的平均数量+/CD45型高的巨噬细胞(n个= 10).C类，Ly6C/CD45染色的代表性双变量点图。D类，CD11b的平均数量+/CD45型高的/赖氨酸6C高的检测到巨噬细胞(n个= 5). 条形表示平均值±SEM。不同字母（a或b）的平均值有显著差异(第页<0.05）。E类在一项相关的研究中，小鼠遭受了反复的社会失败，一半的小鼠在收集大脑进行流式细胞术分析之前进行了灌注(n个= 6). 条形代表平均值±SEM。不同字母（a或b）的平均值有显著差异(第页<0.05）。APC，别藻蓝蛋白；PerCP，周苷叶绿素蛋白。

因为巨噬细胞向中枢神经系统的运输与Ly6C的表达增加有关(Mildner等人，2007年)在多次社会失败后测定Ly6C水平。图3C类显示Ly6C和CD45染色的代表性双变量点图。Ly6C的百分比高的与所有其他治疗组相比，SDR载体小鼠的巨噬细胞显著增加(第页< 0.02) (图3D类). 此外，普萘洛尔预处理阻止了Ly6C百分比的增加高的反复社交失败后中枢神经系统中的巨噬细胞（普萘洛尔的主要作用，F类(1,26)= 10.21,第页< 0.004) (图3D类). 值得注意的是，反复的社会失败并没有增加小胶质细胞上Ly6C的表达(图3C类).

确保CNS巨噬细胞数量增加不会因CD11b的存在而混淆+在中枢神经系统血管系统中循环的单核细胞是一种小鼠亚群，在第六次社交失败后14小时，对其进行反复社交失败，并经心灌注无菌PBS。收集小胶质细胞和巨噬细胞进行流式细胞术分析。图3E类表明反复的社交失败增加了中枢神经系统中巨噬细胞的百分比，而这种增加不受灌注的影响（应激的主要影响，F类(1,15)= 19.01,第页< 0.0006; 灌注效应，F类(1,18)= 1.05,第页< 0.33). 总之，这些数据表明，反复的社会失败增加了Ly6C的百分比高的向中枢神经系统输送的巨噬细胞。

反复社交失败后小胶质细胞和CNS巨噬细胞表面炎症标记物的蛋白表达增加

进一步描述小胶质细胞（CD45）的特征低的)和CNS巨噬细胞（CD45高的)在多次社交失败后，对这些细胞进行了几种与炎症相关的表面标记物的分析。在第六次社交失败14小时后，测定与先天免疫相关的两个标记CD14和TLR4的表面表达，以及与抗原呈递相关的两种标记MHC-II和CD86的表面表达。图4A类显示了小胶质细胞和巨噬细胞的CD11b和CD14染色的代表性双变量点图。图4,B–D类，表明反复的社会失败增加了CD14的百分比+(F类(1,17)= 29.56,第页< 0.0001) (图4B类)，TLR4级+(F类(1,17)=33.83，第页< 0.001) (图4C类)，和CD86+(F类(1,16)= 26.32,第页< 0.0001) (图4D类)小胶质细胞。此外，反复的社会失败也提高了CD14的百分比+(F类(1,16)= 22.98,第页< 0.0002) (图4B类)和CD86+(F类(1,16)= 15.77,第页< 0.002) (图4D类)巨噬细胞。然而，反复社交失败后，巨噬细胞TLR4的表达没有显著增强(图4C类). 此外，反复的社会失败并不影响小胶质细胞或巨噬细胞上MHC-II的表达(图4E类). 这些数据表明，反复的社交失败会增加小胶质细胞和CNS巨噬细胞的炎症特征。

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反复社交失败后，小胶质细胞和CNS巨噬细胞上炎症标记物的表面表达增加。雄性C57BL/6小鼠接受六个周期的SDR。在第六次社交失败后14小时收集大脑CD11b+通过Percoll梯度分离富集细胞，并测定CD11b、CD45、CD14、TLR4和CD86的表达水平。小胶质细胞上的细胞被选通（CD45低的)或巨噬细胞（CD45高的).A类，CD11b/CD14显示了代表性的双变量点图。B–E类，CD14阳性细胞的平均百分比(B类)，TLR4级(C类)，CD86(D类)和MHC-II(E类)如图所示。条形代表平均值±SEM(n个= 9). 星号表示细胞类型内的HCC和SDR显著不同(第页<0.05）之间的差异。在一项单独但相关的研究中，雄性C57BL/6小鼠在六个社交失败周期的每一个周期之前，皮下注射赋形剂或普萘洛尔（10 mg/kg）。在第六次社交失败后14小时收集大脑，如上所述测定CD11b、CD45和CD14水平。F类,G公司代表性双变量点图和CD14阳性细胞的平均百分比。条形代表平均值±SEM(n个= 10–12). 不同字母（a、b或c）的平均值有显著差异(第页<0.05）之间的差异。APC，别藻蓝蛋白；异硫氰酸荧光素。

在一项相关实验中，用溶媒或普萘洛尔对小鼠进行预处理，然后进行六次社交失败。在小胶质细胞上测定CD14的细胞表面表达。CD11b/CD14染色的代表性双变量点图如所示图4F类.与上述实验一致(图3B类)，反复的社会失败增加了CD14的百分比+小胶质细胞（压力的主要影响，F类(1,44)= 5.20,第页< 0.03). 用普萘洛尔预处理（应力×普萘洛耳相互作用，F类(1,44)= 4.29,第页< 0.05) (图4G公司). 这些数据表明，反复的社交失败导致炎症蛋白表达的变化在一定程度上是由β肾上腺素能途径介导的。

普萘洛尔阻止了反复社交失败诱导的活化小胶质细胞形态

因为在反复的社会失败后，小胶质细胞表面检测到了几种炎症标志物(图4)，使用抗Iba-1抗体在PFC、MeA、PVN和HPC中测定小胶质细胞形态的改变。Iba-1用于区分与小胶质细胞活化相关的形态学变化(Imai和Kohsaka，2002年).图5A类,我和ii（ii），分别显示HCC和SDR小鼠MeA中Iba-1的代表性荧光染色。这些图像表明，HCC小鼠的小胶质细胞具有长而细的突起（即分支），但社交失败小鼠的小神经胶质细胞表现为肥大，突起较短且较厚（即错构）。为了量化这些差异，测定了Iba-1染色的DIA(Donnelly等人，2009年). DIA的结果(图5B–E类)证实来自社交失败小鼠的小胶质细胞与来自对照小鼠的小神经胶质细胞相比，其面积比例增加（压力的主要影响，F类(1,52)= 15.52,第页< 0.0003).临时的分析表明，反复的社交失败显著增加了包括MeA在内的所有受检脑区小胶质细胞的比例面积(第页<0.01）(图5B类)、PFC(第页< 0.04) (图5C类)，高性能混凝土(第页< 0.0002) (图5D类)和PVN(第页< 0.0001) (图5E类). 此外，代表性图像表明，MeA中普萘洛尔预处理阻断了反复社交失败后活化小胶质细胞的增加(图5Aiii公司,iv（四）). DIA证实，普萘洛尔预处理可阻止应激诱导的小胶质细胞比例面积增加（应激×普萘洛耳相互作用，F类(1,52)= 11.83,第页<0.002）。然而，在PVN中，应激诱导的Iba-1染色比例面积增加不受普萘洛尔预处理的影响(图5E类). 总之，这些数据表明，反复的社交失败导致MeA、PFC和HPC内激活的小胶质细胞发生形态学变化，而这被普萘洛尔阻断。

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反复社会失败后小胶质细胞活化形态增加。在每六个SDR周期之前，将载体或普萘洛尔（Prop；10 mg/kg）皮下注射到雄性C57BL/6小鼠。在第六个社交失败周期后14小时，灌流小鼠，收集大脑进行Iba-1染色。A类，Iba-1染色的代表性图片[荧光(i–iv)和DAB(v–viii)从内侧杏仁核（40×）显示）。插图包括Iba-1的放大图像+箭头指示的单元格。B–E类，杏仁核内侧Iba-1染色的比例区域(B类,n个=3），前额叶皮层(C类,n个=3），海马体(D类,n个=3）和室旁核(E类,n个= 3). 条形代表平均值±SEM。不同字母（a或b）的平均值有显著差异(第页<0.05）。

在强化的小胶质细胞培养物中，反复社交失败增加了IL-1β，降低了GILZ和FKBP51 mRNA水平

因为CD11b+外周细胞对GC耐药，在反复社交失败后产生较高水平的炎性细胞因子(Stark等人，2001年;Bailey等人，2009年;Powell等人，2009年)下一个实验检测了IL-1β、糖皮质激素受体（GR）和两个含有糖皮质激素反应元件的基因（GILZ和FKBP51）在富集的小胶质细胞中的基因表达(图3A类).表1结果表明，反复的社交失败增加了丰富的小胶质细胞中IL-1βmRNA的水平（压力、，F类(1,23)= 4.50,第页< 0.05). 尽管GR mRNA的表达在反复社交失败后未受影响，但GILZ的mRNA水平（压力的主要影响，F类(1,28)=19.83，第页<0.0001）和FKBP51（应激的主要作用，F类(1,26)= 8.84,第页<0.007）因反复社会失败而显著降低。此外，普萘洛尔预处理阻止了反复社交失败诱导的IL-1β升高(第页<0.04）和GILZ减少(第页<0.006）和FKBP51(第页< 0.0007). 此外，β-肾上腺素能受体拮抗剂增强了反复社交失败小鼠FKBP51的mRNA水平。这些数据表明，反复社交失败增加了丰富的小胶质细胞中IL-1βmRNA的表达，降低了两个GC反应基因的mRNA，而阻断β肾上腺素能受体刺激使IL-1β水平恢复到基线水平，并增强了FKBP51水平。

表1。

反复社交失败增加了丰富的小胶质细胞中IL-1β和糖皮质激素反应元件mRNA的表达

基因HCC（折叠变化）SDR车辆（折叠变换）SDR普萘洛尔（折叠变化）
IL-1β1.10 ± 0.26一2.83 ± 0.63b条1.00 ± 0.10一
希腊1.10 ± 0.16一1.26 ± 0.10一1.34 ± 0.48一
GILZ公司1.13 ± 0.18一0.62 ± 0.05b条1.47 ± 0.53一
FKBP51型0.8 ± 0.12一0.43 ± 0.06b条2.46 ± 0.85c（c）

表中表示平均值±SEM。

a、 b、c平均值显著不同(第页<0.05）之间的差异。

反复的社会失败增加了富含小胶质细胞培养上清液中的IL-6、TNF-α和MCP-1蛋白水平

基于蛋白质、形态学和mRNA数据，下一项研究的目的是确定反复社交失败后小胶质细胞炎性特征增加的功能后果。为了解决这个问题，体外从HCC和SDR小鼠中建立富集的小胶质细胞培养物。细胞以1×10的比例进行培养5在生长培养基中96 well培养板中的每孔细胞数，在有无皮质酮的情况下用0.40μg/ml LPS处理。收集上清，用CBA测定IL-6、TNF-α、IL-12p70、IL-10、IFN-γ和MCP-1蛋白水平。在HCC或SDR衍生的富集小胶质细胞培养物中，LPS没有增加IFN-γ和IL-12（数据未显示）。图6显示与从HCC小鼠建立的培养物相比，用LPS处理在来自社交失败小鼠的培养物中诱导了更高的IL-6、TNF-α和MCP-1的产生（应激的主要影响：IL-6，F类(1,7)= 25.35第页< 0.005; 肿瘤坏死因子-α，F类(1,7)= 2.83第页= 0.14; MCP-1，F类(1,7)= 21.88第页< 0.005). IL-10对LPS的反应类似（数据未显示）。此外，糖皮质激素以剂量依赖的方式降低细胞因子的产生（IL-6，F类(1,23)= 14.22第页<0.001；肿瘤坏死因子-α，F类(1,23)= 12.80第页<0.001；MCP-1，F类(1,23)= 58.09第页<0.001），但这种减少与反复的社会失败无关。总的来说，这些数据表明，与从HCC小鼠获得的富集小胶质细胞相比，从社交失败小鼠获得的强化小胶质细胞在LPS后产生的IL-6、TNF-α和MCP-1水平显著升高。

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反复的社会失败增加了小胶质细胞的反应性。雄性C57BL/6小鼠接受六个周期的SDR。在第六次社交失败后14小时收集大脑。通过Percoll梯度分离收集富集的小胶质细胞并进行培养体外.A–C细胞与LPS和皮质酮（Cort）（0、0.1或5μ米)和IL-6(A类)，肿瘤坏死因子-α(B类)，MCP-1(C类)在18小时后收集的上清液中测定蛋白质水平。条形图表示相对于对照±SEM的百分比增加。不同字母（a、b或c）的平均值有显著差异(第页<0.05）。

反复社交失败增强了IL-1r1中c-Fos的激活−/−但不促进焦虑样行为或小胶质细胞激活

社交失败增加了小胶质细胞的炎症特征，并增加了IL-1β的mRNA水平。因此，社交失败诱导c-Fos激活、焦虑样行为和小胶质细胞激活的程度在IL-1r1中确定−/−老鼠。来自IL-1r1的MeA的c-Fos染色的代表性图像−/−小鼠显示在图7A类与野生型（WT）小鼠的结果相似(图1C类,D类)，反复的社会失败增强了IL-1r1的MeA中的c-Fos染色−/−小鼠与IL-1r1的比较−/−–HCC小鼠（应激的主要影响，F类(1,10)= 14.52,第页< 0.004). 在其他大脑区域检测到类似的c-Fos激活模式（数据未显示）。在光/暗偏好测试中，反复社交失败的WT小鼠进入黑暗区的时间缩短(第页< 0.005) (图7C类)增加了在黑暗区的时间(第页<0.01）(图7D类). 然而，反复社交失败的影响取决于功能性IL-1受体1型的表达（基因型×应激相互作用，F类(1,24)= 10.39,第页< 0.005). 白介素-1 r1−/−多次社交失败的老鼠没有表现出焦虑的行为。值得注意的是，IL-1r1−/−–HCC小鼠的基线焦虑样行为高于WT–HCC鼠。IL-1r1的这些基线行为差异−/−然而，老鼠并没有受到反复的社会失败的影响。

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反复的社交失败增强了c-Fos的激活，但不影响IL-1r1的行为或小胶质细胞的激活−/−老鼠.男性IL-1r1−/−C57BL/6小鼠接受六个周期的SDR。A类，MeA（20×）c-Fos染色的代表性图片。B类，MeA中c-Fos阳性细胞的平均数量(n个= 5).C–F类，在另一组研究中，WT或IL-1r1−/−对C57BL/6小鼠进行多次社会性失败，并在第六次社会性失败后14 h测定光/暗偏好。C类，进入暗区的平均时间。D类，在黑暗区的平均时间(n个= 6–8). 行为测试后，灌流小鼠并收集大脑进行Iba-1免疫组织学检查。E类，MeA的Iba-1染色代表性图像（40×）。插图包括Iba-1的放大图像+箭头指示的单元格。F类，MeA中Iba-1染色的比例区域(n个= 3). 条形表示平均值±SEM。星号表示基因型内的显著差异(第页< 0.05). 不另作说明，不重要。

为了确定小胶质细胞的激活水平，在MeA中进行Iba-1染色。图7E类显示了WT–HCC、WT–SDR和IL-1r1的MeA中Iba-1的代表性染色−/−–SDR小鼠。DIA的结果表明，与对照小鼠的小胶质细胞相比，WT-SDR小鼠的小神经胶质细胞在MeA中的比例面积增加（应激×基因型相互作用，F类(1,11)= 46.77,第页< 0.0001). 在社交失败的IL-1r1中未检测到小胶质细胞比例面积的这些变化−/−老鼠。总之，这些数据表明，尽管反复的社交失败增加了大脑中c-Fos的激活，但它并没有诱导焦虑样行为或IL-1r1中的小胶质细胞激活−/−老鼠。

讨论

反复的社交失败会显著改变外周免疫反应，并导致长期焦虑样行为(Stark等人，2001年;Engler等人，2004年;Berton等人，2006年;Kinsey等人，2007年;Krishnan等人，2007年;Bailey等人，2009年;Powell等人，2009年;Curry等人，2010年;Mays等人，2010年). 我们发现，社交失败引发的焦虑样行为与大脑中与恐惧和威胁评估相关的区域c-Fos激活的独特模式相吻合。此外，普萘洛尔预处理可预防应激诱导的焦虑样行为和c-Fos激活(图1,​,2).2). 社交失败也增加了Ly6C的数量高的中枢神经系统中的巨噬细胞(图3)并增加小胶质细胞/巨噬细胞的炎症特征(图4,​,5;5;表1). 普萘洛尔可阻断应激诱导的小胶质细胞/巨噬细胞炎症变化。丰富的小胶质细胞炎症特征增加的一个功能性后果是细胞因子的过度分泌体外LPS刺激(图6B类). 最后，反复的社交失败增加了IL-1r1内侧杏仁核中c-Fos的激活−/−小鼠，但在缺乏功能性IL-1受体1型的小鼠中不促进焦虑样行为或小胶质细胞活化。

研究发现，反复的社交失败会增加焦虑行为(图2)与之前关于社会失败的研究一致(Berton等人，2006年;Kinsey等人，2007年;Krishnan等人，2007年). 我们的研究结果表明，在一次社交失败后，大脑中c-Fos的表达增加，并且随着重复的循环，大脑中的激活或保持或增强(图1). 社交失败后被激活的区域整合在儿茶酚胺能通路中，并与恐惧和威胁评估有关(Samuels和Szabadi，2008年;Roozendaal等人，2009年;Ulrich-Lai和Herman，2009年). 其他关于啮齿类动物社交失败的研究表明，c-Fos在类似的脑区激活(Martinez等人，2002年). 虽然暴露于一个社交失败周期足以诱导c-Fos激活，但很可能需要反复失败周期来促进持续的焦虑样行为，这种焦虑样行为在压力源停止8天后即可检测到(Kinsey等人，2007年). 例如，需要三个社会失败周期来建立与应激源相关的持久免疫变化(Avitsur等人，2002年). 我们目前的研究扩展了这些先前的发现，并表明普萘洛尔预处理可以阻止c-Fos表达的诱导以及由反复社交失败引起的焦虑样行为(图1,​,2).2). 虽然c-Fos的诱导依赖于β肾上腺素能受体的激活，但并不依赖于功能性IL-1受体1的存在(图7A类). 值得一提的是，在六个社交失败周期后急性注射普萘洛尔并没有减弱对压力源的任何生理或行为反应（数据未显示）。因此，这些集体数据表明，β-肾上腺素能受体的激活在威胁和恐惧信号的初步解释以及在反复社交失败后焦虑样行为的诱导中发挥着积极作用。

社会失败增加了髓细胞从骨髓中的流出，并将这些细胞贩运到脾脏和肺部(Engler等人，2004年;Curry等人，2010年). 这里我们提供了新的数据，表明反复的社会失败显著增加了Ly6C的百分比高的向中枢神经系统输送的巨噬细胞(图3). 社交失败后这些巨噬细胞的存在不受经心灌注的影响(图3E类)这表明这些巨噬细胞存在于血管周围间隙或薄壁组织中。因为Ly6C高的巨噬细胞有向炎症组织运输的倾向(Mildner等人，2007年;King等人，2009年)大脑中这些细胞的存在支持了我们的结论，即反复的社会失败会加剧神经炎症。

反复的社会失败也增强了小胶质细胞和中枢神经系统巨噬细胞的炎症特征。例如，负责识别LPS的先天免疫标记物CD14和TLR4在小胶质细胞表面增强(图4A类,B类). CNS巨噬细胞上的CD14也增加(图4A类). 此外，CD86是抗原提呈所必需的共刺激分子，在社交失败后小胶质细胞和CNS巨噬细胞上增强(图4D类). 此外，在所有被检查的大脑区域中都有更多的失神经小胶质细胞(图5)反复社交失败后，小胶质细胞IL-1βmRNA增加(图6). 应激诱导的炎症标记物、形态学和mRNA的变化表明，反复的社交失败会启动小胶质细胞和中枢神经系统巨噬细胞。

随着年龄增长，启动或反应性小胶质细胞增多(Godbout等人，2005年)，早期感染(Bilbo等人，2005年,2008)、神经退行性疾病(Cunningham等人，2005年)和自身免疫(Raivich和Banati，2004年). 小胶质细胞启动增加与免疫刺激后大脑中过度的炎症反应有关。例如，在LPS刺激后，来自老年或朊病毒感染小鼠的启动的小胶质细胞产生过度水平的炎性细胞因子，包括IL-1β(坎宁安等人，2005年;Frank等人，2006b;Henry等人，2009年). 此外，来自社交失败小鼠的启动小胶质细胞刺激体外与对照组相比，LPS产生的IL-6、TNF-α和MCP-1水平增加(图6B–D类). 在不可避免的足部休克中也有类似的发现，LPS增加了海马小胶质细胞中IL-1βmRNA的表达体外(Frank等人，2007年). TLR4和CD14（LPS的主要受体和共受体）的表面表达增加可能与反复社交失败后对LPS的敏感性增加有关(图4). 这些数据提供了直接证据，表明反复的社会失败增加了小胶质细胞对随后炎症挑战的敏感性。

以前的报告表明，其他应激源，包括不可避免的足部休克，增加了大脑中的IL-1βmRNA，而IL-1β的增加可通过β-肾上腺素能受体拮抗来阻止(Johnson等人，2005年,2008). 此外，由于米诺环素（一种据称的小胶质细胞抑制剂）也减少了中枢神经系统中与应激相关的IL-1βmRNA的增加，因此提示小胶质细胞的激活(Blandino等人，2006年). 在其他研究中，β-肾上腺素能受体激动剂的使用增加了大脑中IL-1βmRNA的表达(McNamee等人，2010年). 此外，最近对社交失败小鼠大脑皮层的微阵列和转录元件聆听系统分析发现炎症基因诱导（GATA-1）与β肾上腺素能受体刺激有关(Cole等人，2010年). 此外，中枢神经系统中较高水平的IL-1β与行为改变有关，包括社交退缩、焦虑和抑郁样行为(Anisman等人，2005年;Berton等人，2006年;古和杜曼，2009年). 因为反复社交失败引发的焦虑被普萘洛尔阻止了(图1)β-肾上腺素能受体激活促进小胶质细胞/巨噬细胞激活，从而促进焦虑样行为，这一点似乎是合理的。为了支持这一观点，我们的数据表明，社交失败诱导的焦虑和小胶质细胞激活需要功能性IL-1受体1(图7). 此外，最近的证据表明，NFκB信号通路是一种由包括IL-1β在内的炎症细胞因子激活的通路(Nadjar等人，2003年)，对于社交回避和慢性社交失败引起的树突棘密度增加至关重要(Christoffel等人，2011年).

在一些模型系统中，MHC-II表达的增加与小胶质细胞启动有关，但在反复社交失败后14小时，其表达没有增加(图4E类). 这与使用不可避免休克的研究不同(Frank等人，2007年)其中，小胶质细胞中MHC-II mRNA水平增加。尽管如此，我们的数据与一项研究一致，该研究表明Iba-1的MHC-II没有增加+约束应激后中枢神经系统中的细胞(Tynan等人，2010年). 使用束缚应激的研究也表明存在增殖(奈尔和邦诺，2006年)或小胶质细胞的迁移(Tynan等人，2010年). 虽然反复的社会失败促进了巨噬细胞向中枢神经系统的贩运，但对小胶质细胞的分析没有显示任何增殖或迁移的证据（数据未显示）。这些差异可能在于压力源的性质(Sheridan等人，2004年).

虽然目前的数据表明应激后中枢神经系统中β-肾上腺素能受体依赖性变化，但考虑糖皮质激素对小胶质细胞和中枢神经系统巨噬细胞的影响很重要。最近的一项研究表明，用糖皮质激素预处理原代巨噬细胞可增强LPS刺激后炎症细胞因子的分泌(Frank等人，2010年). 此外，外围CD11b+社交失败小鼠的细胞产生更多炎性细胞因子，并且对GC敏感(Avitsur等人，2001年,2002;Stark等人，2001年). 我们的数据表明体外与对照组相比，LPS刺激社交失败小鼠富集的小胶质细胞导致细胞因子产生过度。糖皮质激素介导的LPS或糖皮质激素诱导的小胶质细胞凋亡诱导的炎症蛋白减少无差异（数据未显示）。尽管如此，社交失败小鼠的小胶质细胞mRNA图谱表明体内糖皮质激素反应性。例如，反复的社交失败会降低两个GC反应基因GILZ和FKBP51小胶质细胞中的mRNA水平，而普萘洛尔预处理可以防止社交失败小鼠中这些基因的下调(表1). 因此，这些mRNA数据表明，社交失败可能导致小胶质细胞对糖皮质激素的抗炎作用不太敏感。

总之，这项研究表明，反复的社交失败会导致焦虑样行为，并以β肾上腺素能和IL-1受体依赖的方式增强中枢神经系统的炎症状态。此外，反复的社交失败会激发小胶质细胞和中枢神经系统巨噬细胞，并增加它们对随后炎症刺激的反应性。这些发现具有相关性，因为它们开始建立一种机制，通过这种机制，社会压力会增加中枢神经系统的促炎状态，并促进行为相关并发症的发生。

脚注

这项工作得到了美国国立精神卫生研究院（National Institutes of Mental Health Grant）向J.F.S.提供的R01-MH046801-18资助，以及美国国立老龄研究院（National Institution on Aging）向J.P.G.M.L.H.和E.S.W.提供的R01-AG-033028资助，得到了美国国家牙科和颅面研究所（National Institute of Dental and Cranfacial Research Training Grant）对J.F.S提供的T32-DE-01-4320。波波维奇感谢他们在数字图像分析方面的帮助。

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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会