C2C12成肌细胞生物能量剖面实验

1.细胞注射

细胞受到三种不同化合物（连续添加）的代谢干扰，这些化合物改变了细胞的生物能量分布。一组作为对照，添加运行介质作为对照“化合物”。

1. 第一次注射是寡霉素。寡霉素通过阻断F的质子通道抑制ATP合成_o（o）部分ATP合成酶（复合物V）。在线粒体研究中，它被用于阻止状态3（磷酸化）呼吸。对于细胞，它可以用于区分用于ATP合成的氧气消耗百分比和克服线粒体内膜天然质子泄漏所需的氧气消耗比例。
2. 第二次注入是FCCP。FCCP（羰基氰化物对三氟甲氧基苯腙）是一种离子载体，是一种可移动的离子载体。它是一种解偶联剂，因为它通过跨线粒体膜运输氢离子而非ATP合成酶（复合物V）的质子通道来中断ATP合成。线粒体膜电位的崩溃导致能量和氧气的快速消耗，而不产生ATP。在这种情况下，OCR和ECAR都会增加，OCR因解偶联而增加，ECAR因细胞试图通过糖酵解生成ATP来维持能量平衡而增加。FCCP治疗可用于计算细胞的“备用”呼吸能力，即最大非受控OCR和初始基础OCR之间的定量差异。有人提出，即使在最大生理或病理生理刺激的条件下，保持一些多余的呼吸能力也是决定细胞活力和/或存活的主要因素。细胞在能量需求增加的情况下对压力作出反应的能力在很大程度上受线粒体的生物能量容量的影响。这种生物能量容量由几个因素决定，包括细胞向线粒体传递底物的能力和参与电子传递的酶的功能能力
3. 在第三次注射中，将鱼藤酮（一种复合物I抑制剂）添加到细胞中。这将关闭线粒体呼吸，并能够计算线粒体和非线粒体部分对呼吸的贡献。我们可以观察到，由于线粒体功能受损，OCR降低，随着细胞向糖酵解状态转移以维持其能量平衡，ECAR随之增加鱼藤酮是一种线粒体抑制剂，可阻止电子从络合物I中的铁硫中心转移到泛醌（辅酶Q）。这种对复合物I的抑制阻止NADH中的势能以ATP的形式转换为可用能量。

2.试剂和材料

1. 寡霉素、FCCP和鱼藤酮溶液（Seahorse Mito压力测试试剂盒）
2. DMEM运行介质（海马号100965-000）
3. 二甲基亚砜（西格玛D8418）
4. 蒸馏水（Gibco 15230-170）
5. 校准缓冲液（Seahorse Bioscience）

3.生长培养基

1. 500 mL DMEM（Gibco 11965-092）
2. 10%FBS（Hyclone SH90070.03）
3. 5 mL Penn/Strep（Gibco 15140-122）
4. 5 mL丙酮酸钠（Sigma S8636）
5. 5 mL谷氨酰胺（Gibco 35050-061）

4.种子设定协议

1. 细胞接种在XF96细胞培养板中10000个细胞/孔在100μL生长培养基中，放置在37°C培养箱中10%一氧化碳₂.
2. 细胞将在1小时内粘附到XF96细胞培养板上。
3. 接种后24小时对XF96中的细胞进行检测。

5.分析模板的制备

1. 使用分析向导（附录I），生成具有以下组布局的模板：

   

   图1。井网布局识别列和组分配

6.化合物制备

1. 在XF DMEM分析介质中制备以下化合物，如下所示：10μM寡霉素、30.0μM FCCP、20.0μM鱼藤酮、，这些浓度代表了将化合物注入油井时将进行的10倍稀释。工作浓度为：1μM寡霉素、3.0μM FCCP、2.0μM鱼藤酮

7.介质更换和细胞制备

1. 将电池板放在XF准备站上
2. 将培养基的最终体积设置为160μL/孔。
3. 在无CO的37°C培养箱中培养₂持续60分钟，使细胞与分析介质预平衡。

8.加载传感器筒

1. 在装入传感器筒之前，将化合物加热至37°C，并按如下方式将化合物装入喷油器端口：

   1. 第1-4列：分别将16、18和20μL XF分析培养基（DMEM）装入端口A、B和C。
   2. 第5-12列：将16μL寡霉素装入端口A将18μL FCCP装入端口B将20μL鱼藤酮装入端口C