中的空突变LEPRE1公司和CRTAP公司导致严重隐性成骨不全

摘要

介绍

成骨不全症（OI），或称“脆性骨疾病”，是一种众所周知的遗传性结缔组织疾病，其特征是骨脆性。大多数OI病例是由任一基因的常染色体显性缺陷引起的(COL1A1公司或COL1A2公司)I型胶原蛋白的编码，是骨骼和皮肤细胞外基质的主要结构蛋白。I型胶原基因的突变解释了Sillence分类所描述的OI临床表型的全部范围(Sillence等人，1979年)从围产期致命到几乎无法检测。基于800多个胶原突变的基因型表型相关性显示COL1A1公司和COL1A2公司，表示每个链的不同功能(Marini等人2007b).

大约75%-80%的胶原结构缺陷是甘氨酸密码子的点突变，并导致其他残基的取代。甘氨酸需要位于包含胶原蛋白螺旋区域的重复三联体（Gly-Xaa-Yaa）的第一个位置，并朝向胶原蛋白三螺旋的空间受限内部。大多数剩余的胶原结构突变涉及剪接供体或受体位点；其中许多结果导致从离散的胶原外显子剪接出来，尽管有令人惊讶的比例涉及使用隐秘的剪接位点和帧外转录物，导致过早终止密码子（PTC）。从机制上讲，结构正常的胶原蛋白不足会导致临床轻度OI，而结构异常的胶原蛋白会导致更严重的临床病例，包括细胞外基质结构异常和细胞-基质相互作用。

四种不同方法结合的OI新范式

一种新的OI范式引起了人们的极大兴趣，因为它在I型胶原蛋白相关的框架内结合了许多区分显性和隐性条件的典型特征。经典OI是由I型胶原基因的显性负结构突变引起的。隐性OI是由参与胶原蛋白翻译后修饰的酶或其辅助蛋白缺乏引起的。OI的这种扩展观点是如何产生的？

随着胶原蛋白编码区的完整测序，越来越清楚的是，一部分致死性和严重OI患者没有I型胶原蛋白的结构缺陷。在几年的时间里，四种不同且独立的方法结合在一起，形成了对OI的新理解。第一种方法涉及临床遗传学和组织形态计量学(Ward等人，2002年). 魁北克省北部一个广泛的第一民族家系中发现了常染色体隐性OI。这些个体的显著特征是根茎、coxa vera、浅蓝色巩膜和正常I型胶原序列背景下骨组织的高周转率。尽管他们在出生时就有骨折，但许多受影响的人都有中等程度的骨质脆弱性，在年轻的成年期导致数十处骨折，并且在没有辅助设备的情况下可以行走。该指数家系属于新的中度至重度OI类别，被指定为VII型OI。由于该家系OI的中度严重程度及其遗传隔离，直到几年后胶原蛋白生物化学和骨骼遗传学的新数据可用，才与其他无胶原蛋白缺陷的严重和致命OI病例联系起来。

导致新OI范式的第二种方法是胶原蛋白生物化学。尽管已经推断出脯氨酰3-羟基化胶原蛋白的存在，但对脯氨酰基3-羟化酶1（P3H1）的分离研究已经进行了20多年。巴辛格及其同事通过使用明胶亲和层析（变性胶原）和P3H1单克隆抗体亲和柱的方案，从鸡胚rER提取物中成功纯化了P3H1(Vranka等人，2004年). P3H1、软骨相关蛋白（CRTAP）和亲环蛋白B（CyPB）从P3H1亲和柱的共洗脱表明内质网（ER）中存在胶原相互作用复合物。

第三种方法涉及基因小鼠模型的生成。在与P3H1分离大致相同的时间段内，Morello及其同事对CRTAP的研究通过敲除将CRTAP与隐性骨表型联系起来Crtap公司鼠标。CRTAP公司在筛选培养的肥大鸡软骨细胞中唯一表达的基因时，首次在消减cDNA文库中鉴定出(Castagnola等人，1997年). 在骨骼系统中，CRTAP公司鸡的胫骨和股骨骺、关节软骨和下肥大区软骨中均有表达(Vranka等人，2004年)以及在小鼠软骨-骨交界处的生长板、骨领和钙化软骨中(Morello等人，2006年). 此外，通过聚合酶链反应（RT-PCR）反转录分析证实了Crtap公司在成骨细胞和破骨细胞中。这个Crtap公司敲除小鼠出现隐性骨软骨发育不良(Morello等人，2006年)包括生长缺陷、骨量减少、股骨缩短（根茎）和进行性后凸畸形，这些都揭示了CRTAP的骨功能。与本地化一致Crtap公司生长板中增殖的软骨细胞Crtap公司^−/−老鼠被打乱了。CRTAP的缺失导致α1（I）和α1（II）胶原链中P986残基的3-羟基化丢失，证实了CRTAP作为胶原3-羟基化复合物的关键成分在体内的作用。

骨骼和生物化学研究的结果Crtap公司将敲除小鼠与鸡胶原蛋白脯氨酰3-羟基化复合物生化研究结果相结合，描绘出一种与I型和II型胶原蛋白相互作用的、对骨结构和功能很重要的雌激素受体-胶原蛋白修饰复合物。

最后，临床分子遗传学方法确定了完成范式的合适患者。P3H1和CRTAP与胶原蛋白的相互作用，以及CRTAP在骨结构中的作用，正是我们在I型胶原蛋白基因没有缺陷的OI病例的候选基因中寻找的特征。约10%-15%的临床OI儿童（转诊NIH）没有明显的胶原突变。在这些病例的一个亚组中，胶原蛋白突变的缺失尤其令人困惑，包括有一个以上受累儿童的家庭，其中皮肤成纤维细胞合成的I型胶原蛋白生化异常，胶原蛋白链的螺旋区域明显过度修饰。鉴于他们对异常胶原蛋白的生化检测呈阳性，我们推测这组患者的基因缺陷在于与胶原蛋白相互作用的蛋白质。P3H1和CRTAP数据结合起来，将这些蛋白质从遥远的可能性提升为主要候选蛋白。P3H1或CRTAP的隐性缺乏基本上导致所有胶原生物化学阳性和胶原序列阴性的OI病例。此外，与原始VII型OI家系的联系，根茎型OI和中度OI，染色体定位在3p22–24.1(Labuda等人，2002年)，在CRTAP公司在这些个体中发现了染色体3p22的定位(Morello等人，2006年;Tonachini等人，1999年).

I型胶原结构与翻译后修饰

在胶原蛋白相关骨疾病的新范式中，胶原蛋白的翻译后修饰发挥着重要作用。异三聚体I型胶原的每条α链[α1（I）₂α2（I）]包含338个重复的Gly-Xaa-Yaa氨基酸三联体。胶原蛋白Gly-X-Y三联体的X和Y残基通常是脯氨酸和4-羟脯氨酸，它们约占胶原蛋白氨基酸含量的25%。在链合成和折叠成异源三聚体螺旋的过程中，每个胶原蛋白α链都会受到一些翻译后修饰(Myllyharju和Kivirikko 2004). 这些修改包括顺式到反式通过CyPB进行脯氨酰异构化，约四分之一赖氨酰残基（Xaa）的5-羟基化-赖氨酸-Gly）通过赖氨酰羟化酶（LH1）和约一半脯氨酰残基（Xaa）的4-羟基化-赞成-脯氨酰4-羟化酶（P4H；Lehmann等人，1995年). 翻译后修饰对螺旋的形成和分子和组织水平的稳定性至关重要；4-羟脯氨酸残基为三聚体提供稳定性，而羟基赖氨酸是形成分子间交联和糖基化附着位点所必需的(Kivirikko和Myllyla 1979年).

未知函数发生了额外的翻译后修饰，并通过使用识别序列使每个α1（I）链中的单个X位置残基（Pro986）发生3-羟基化赞成-4Hyp-Gly公司(Fietzek等人，1972年). Trygvason及其同事首次证明3-羟脯氨酸和4-羟脯氨酸是由独特的酶合成的(Risteli等人，1977年). 随后从鸡胚提取物中分离出具有脯氨酰3-羟化酶活性的部分纯化蛋白质组分(Tryggvason等人，1979年). 隐性OI患者缺乏这种酶活性，胶原蛋白脯氨酸3-羟基化复合物成分存在遗传缺陷。这种修饰的作用可能涉及原纤维胶原蛋白的一个重要的一般功能，因为这种复合物使α1（I）、α1（II）、V型胶原蛋白中的几个位点，以及可能的III型和IV型胶原蛋白的相同位点羟基化。

CRTAP和P3H1是多功能蛋白质

证明CRTAP公司它在鸡、鼠和人的几种组织中的表达特征表明，它对结缔组织的发育很重要(Castagnola等人，1997年;Morello等人，1999年;Tonachini等人，1999年). 尽管CRTAP最初在培养的鸡肥大软骨细胞中被鉴定(Castagnola等人，1997年),Crtap公司Northern分析也在鸡胚的皮肤、心脏和肺中检测到了转录物。在人体组织中CRTAP公司除骨骼组织外，在心脏、肺和小肠中也发现了(Tonachini等人，1999年). 在小鼠中，大多数CRTAP是细胞内的，与ER标记物共定位，但CRTAP的光染色通过免疫组织化学和指示基质和细胞功能在软骨基质中识别。

脯氨酸3-羟化酶1是一种多功能蛋白，现已独立鉴定三次，表明胶原蛋白的羟基化并不是P3H1蛋白的唯一作用。它是首次从大鼠卵黄囊肿瘤细胞系中分离出来的一种新型基质硫酸软骨素蛋白聚糖，通过Wassenhove-McCarthy和McCarthy（1999）; 作者从大鼠cDNA文库中分离出一个克隆，该克隆包含一个新cDNA COOH末端区域的编码片段。该序列用于通过cDNA捕获分析分离全长转录物，产生3.1kb的转录物，预计编码728-氨基酸我亮氨酸-第页罗琳e（电子）蛋白质丰富可以称为“leprecan”，在转染全长cDNA的CHO细胞的ER和高尔基体中检测到蛋白多糖。此外，尽管含有羧基末端KDEL ER检索信号，但免疫染色显示leprecan由大鼠L2细胞分泌，并定位于几个大鼠组织的基底膜。识别leprecan C-末端的多克隆抗体在几个器官的血管系统和平滑肌的基底膜上呈现强烈染色，包括肾小球、系膜基质、肾小管、肝脏和骨骼肌，以及软骨中软骨细胞周围的细胞周基质。

人类leprecan同源物Gros1被分离出来作为一种潜在的格罗夫wth（重量）秒位于染色体上的抑制剂1第31页(Kaul等人，2000年). 在这项研究中，鉴定了编码41和84 kDa蛋白的两个交替剪接转录物，分别表示为Gros1-S和Gros1-L。736-氨基酸84-kDa亚型的前360个残基与Gros1-S变异体的预测翻译序列相同。然而，Gros1-S在内含子5中利用了一个隐秘的外显子（外显子5b），同时还保留了整个内含子7序列，导致提前终止密码子。替代转录物将生成一个截断的363-氨基酸肽，该肽缺乏羧基亮氨酸重复序列和P4H结构域；这种蛋白质产品尚未得到证实。半定量PCR分析表明，Gros1-L是成人组织中的主要表达形式，如心脏、肺和肾脏(Tiainen等人，2008年). 在人类胎儿组织中，Gros1-S主要存在于大脑和胸腺中，而这两种形式的转录物在肝脏、骨骼肌、脾脏和胰腺中的摩尔比率相等。

第三次独立隔离LEPRE1公司基因产物为P3H1，胶原蛋白脯氨酸3-羟基化复合物的酶成分（参见四种不同方法结合处的OI新范式）。

胶原蛋白脯氨酸3-羟基化复合物

最近少数实验室的研究表明，主要原纤维胶原蛋白的3-羟基化修饰是由P3H1、CRTAP和CyPB组成的蛋白质复合物以1:1:1的比例进行的(Morello等人，2006年;Vranka等人，2004年). 因为P3H1在体外能够独立地3-羟基化胶原蛋白底物(Vranka等人，2004年)P3H1现在被认为是体内的酶成分，而CRTAP是复合物的“辅助”蛋白。

3-羟基化复合物组分的人类蛋白质序列比较显示出几个显著特征(Marini等人2007a). CRTAP与较大P3H1蛋白的氨基半部分具有高度同源性（55%）。推测的跨膜序列在两种CRTAP（Gly₄–序列号₃₂)和P3H1（丙氨酸₅–价值₃₃和Glu₃₇₂–苯丙氨酸₃₈₇)，尽管这些蛋白质尚未被证明与内质网膜结合或在内质网膜上形成复合物。有趣的是，P3H1和CRTAP中假定跨膜序列的氨基末端位置与II型膜蛋白的拓扑结构一致，允许一些功能基序位于内质网腔内，它们可以与胶原蛋白相互作用。P3H1包含四个四肽重复序列（TPR），对蛋白质相互作用很重要。这些基序也存在于P3H1的小鼠、大鼠、奶牛和鸡同源物中。然而，CRTAP仅包含一个TPR结构域，它对应于人类P3H1的第二个TPR，并且可以在人类、小鼠、大鼠、鸡和斑马鱼蛋白质中识别。

这两种蛋白质都有四个CX_三C基序，也出现在线粒体内膜转位酶复合物TIM的小蛋白和趋化因子fractalkine中(科勒2004;Stievano等人，2004年). 有趣的是，类似的CX₂C基序在硫醇/二硫键氧化还原酶中保守，并参与氧化还原反应和错误形成的二硫键的异构化(Chivers等人，1998年;Horibe等人，2004年;Quan等人，2007年)以及金属结合位点的形成(布鲁西和格尔斯金1988;Coruzzi和Tzagoloff 1979年;Glerum等人，1996年). 此外，CX的出现_三P3H1和CRTAP中的C序列可以跨物种识别，包括人类、小鼠和奶牛蛋白质，每个蛋白质都包含四个这样的基序。鸡肉CRTAP有三个CX_三C基序，而老鼠和斑马鱼CRTAP仅包含两个基序。

P3H1还包含脯氨酰4-羟化酶（P4H）结构域，以及在2-氧戊二酸双加氧酶家族（His）中高度保守的四个催化残基₅₈₇，天冬氨酸₅₈₉，他的₆₅₉和Arg₆₆₉). 这类蛋白质包括P4H、P3H同工酶（P3H1-3）和赖氨酰羟化酶（LH1-3），所有这些都需要铁²⁺，2-酮戊二酸，O₂和抗坏血酸的活性。P3H1的其他特征包括假定的整合素结合位点（RGD_48–50)，三个潜在的糖胺聚糖附着位点（Ser_{190, 496, 653})和三个假定的N-糖基化位点（Asn_{316, 467, 540}). P3H1包含亮氨酸拉链（L₄₄₅TREGGPLLYE-GISLTMNSKLL公司₄₆₆)已知参与蛋白质二聚化，以及两个潜在的肉豆蔻酰化序列（G₅₃VVLSM公司₅₈和G₆₆₇QRCAI公司₆₇₂). 还有20个潜在的磷酸化识别位点，尽管还没有证据表明这些位点被使用。皮尔蒂和同事（2008）然而，有研究表明，人类HCS 2/8软骨肉瘤细胞在机械刺激下P3H1/leprecan的磷酸化增加，可能与细胞内胶原合成和组装的改变有关。

3-羟基化复合物的第三个成员CyPB是一种肽基-丙基异构酶，已知在内质网内前胶原的体内折叠中起核心作用。前胶原α链结合发生在羧基末端前肽上，这是多肽被翻译的最后部分。尽管胶原三螺旋只能容纳反式构象，有足够的时间形成未折叠α链的平衡状态，其中I型前胶原中多达12%的X-Pro键位于顺式核磁共振测定的构象(Fischer等人，1984年). 因此，肽基丙基顺-反式CyPB的异构酶功能催化前胶原α链高效折叠为三螺旋结构。Bachinger及其同事提出了支持这种作用的证据，他们使用部分纯化的酶来研究III型前胶原的体外折叠速率(巴辛格1987); 他们得出结论，CyPB将折叠速度提高了三倍，并且顺-反式胶原α链中X-Pro键的异构化是螺旋折叠的速率限制步骤(Bachinger等人，1980年). 补充调查结果斯坦曼及其同事（1991年）支持CyPB在胶原折叠中的体内作用。用环孢菌素A（CsA）治疗成纤维细胞会导致I型胶原沿α链全长过度修饰。由于CsA通过不完全表征的机制结合并抑制CyPB的异构酶活性(Fischer等人，1989年)，损失顺反式脯氨酰异构化和随后的延迟折叠被认为是导致胶原蛋白过度修饰的原因。氨基酸分析证实了这一点，该分析表明羟赖氨酸残基的比例从正常对照胶原蛋白中21%的赖氨酸残留物增加到CsA处理细胞中28%的赖胺酸残基。

最近对胶原蛋白3-羟基化复合物功能的研究表明，P3H1/CRTAP/CyPB复合物在涉及柠檬酸合成酶聚集和铑蛋白重折叠的经典伴侣分析中作为伴侣发挥作用(石川等人，2009年). 此外，尽管作为复合物的一部分，CyPB在肽底物上的PPIlase活性高于游离CyPB，但游离CyPB是pN-collagen III折叠的更好催化剂，而不是完整复合物。此外，胶原蛋白3-羟基化复合物已被证明在体外抑制I型胶原蛋白的原纤维形成，这表明它可以防止胶原蛋白分子在细胞分泌途径中过早聚集(石川等人，2009年).

中的突变CRTAP公司和LEPRE1公司引起隐性VII型和VIII型OI

骨生物学的最新发展表明，胶原蛋白3-羟基化复合物成分的缺乏是隐性OI的难以捉摸的原因，最早在1979年的Sillence分类中假设存在隐性OI(Sillence等人，1979年). 在我们最初的筛查队列中，有10名儿童患有致命到严重的OI、过度修饰的胶原蛋白和正常的COL1A1公司和COL1A2公司序列显示，10例患者均有CRTAP缺陷（3例；Barnes等人，2006年)或P3H1（7例，其中2例未发表；Cabral等人，2007年). 到目前为止COL1A1公司,COL1A2公司,CRTAP公司，或LEPRE1公司说明了所有伴有胶原生物化学异常的严重OI病例。

首批人类感染病例的鉴定CRTAP公司不足(Barnes等人，2006年)与Crtap公司敲除鼠标(Morello等人，2006年)并实现了我们的假设，即隐性OI将由与I型胶原相互作用的分子引起。迄今为止，有13名独立先证者，其中15名CRTAP公司突变等位基因已经发表(表1). 当亲本分析成为可能时，每个亲本都被证明是突变等位基因的杂合携带者。在六名先证者中，父母血缘关系得到证实的发生也与隐性遗传相一致。

大多数突变类型预计会导致CRTAP公司非感觉介导衰变（NMD）的转录物，与八例报告的缺失或严重降低的转录物水平一致。两个突变等位基因直接产生一个终止密码子；其中一个改变了起始Met残基，而10个突变等位基因包含小的缺失、重复或剪接位点缺陷，这些缺陷直接或通过选择性剪接改变转录物的框架，导致PTC和NMD。相比之下，两个突变等位基因包含错义突变：（1）一个机制未知的纯合Leu67Pro替代，和（2）一个突变等位点包含两个非保守变化，一个在信号肽中，另一个在改变残基电荷的中链中；该等位基因与无效突变复合出现。值得注意的是，几乎所有确定的CRTAP公司突变发生在外显子1和4及其相邻的内含子序列中。

在人类中，CRTAP蛋白的缺失或其在3-羟基化复合物中功能作用的丧失会导致严重到致命的骨软骨发育不良，现在被指定为VII型OI（OMIM 610682）。有趣的是，CRTAP公司人类的缺陷导致了比基因敲除小鼠更严重的表型。人类表型与Sillence II型和III型重叠(Barnes等人，2006年;Van Dijk等人，2009年). 患者患有严重的骨质疏松症，伴有根状茎裂、新生儿骨折、广泛的管下长骨、纤细的肋骨（一些出生时没有肋骨骨折）和相对正常的头围。在几乎所有的病例中，他们的巩膜被描述为白色或浅灰色。存活到儿童期的患者表现出软骨营养不良的极端症状，有紊乱的“pop-corn”骨骺，与大约一半的III型OI儿童的骨骺相似，并且极度缺乏生长发育(Baldridge等人，2008年;Obafemi等人，2008年).

关于这些先证者中Pro986羟基化水平的现有数据并不表明胶原修饰与临床结果简单相关(表2). 三名Pro986羟基化率为0-5%的婴儿在1岁之前死亡。然而，一名Pro986羟基化率为24%的儿童也在多发性肺炎后10个月死亡。对于内含子1中剪接位点缺陷的4岁儿童纯合子或外显子1中小的移码重复的2岁纯合子，Pro986羟基化水平均未测定，因此在这些病例中，长寿与剩余CRTAP功能的关系尚不清楚。VII型OI索引家系中的个体，这是魁北克北部的一种基因分离物，具有低形态CRTAP公司突变，具有可变水平的转录物和Pro986羟基化，具有约10%的残留转录物和蛋白质。这些个体具有中度严重表型，至少生活到中年，青春期后骨折减少，中等身材矮小，DEXA L1-L4 z评分介于-1.3到-4.8之间。考虑到CRTAP的组织和细胞功能，这些基因型-表型变化可能反映的不仅仅是I型胶原修饰的水平。

此外，在一个经过充分研究的案例中CRTAP公司错义突变、胶原3-羟基化接近正常水平并不能阻止严重表型的发生。Leu67Pro替代物纯合子的先证者9岁，患有骨折、极度严重的生长缺陷（10.5个月大）和轮椅活动能力(Baldridge等人2008). 该儿童的成纤维细胞转录水平正常，Pro986羟基化率为79%，而正常对照组为94%-98%，临床正常携带者父母为88%-91%(Barnes等人，2006年). 与携带者相比，除I型胶原3-羟基化减少10%外，其他因素也一定会导致这种情况下的表型严重性。

同样，在15个外显子和周围内含子区域中发现的突变LEPRE1公司gDNA导致P3H1功能缺失或丧失，并导致致命至严重的VIII型OI（OMIM 610915）。目前已知有17个突变株LEPRE1公司大约24个独立家系的等位基因(表1). 突变发生在整个LEPRE1公司基因。大多数可以通过筛选LEPRE1公司用从患者成纤维细胞分离的RNA进行实时RT-PCR(Cabral等人，2007年). 几乎所有的突变都与LEPRE1公司转录本，因为由此产生的终止密码子或帧移位导致了PTC的引入。我们发现麻风1用依米汀处理成纤维细胞可以部分挽救mRNA，支持PTC触发转录物NMD的机制。LEPRE1公司在12例具有独特突变的患者中，有8例的转录物低于对照组成纤维细胞的15%，2例转录物低于40%～60%，另外2例转录产物低于70%～87%。最低水平的转录物与单核苷酸缺失、终止密码子和剪接位点缺陷有关，所有这些都导致Pro986羟基化水平低于正常水平的15%。中等和接近正常水平的转录物与最终外显子的突变或外显子6的框内剪接有关。这些转录本显然没有触发NMD；在这些病例中，I型胶原Pro986羟基化水平也低于10%或“严重降低”。

三个LEPRE1公司突变值得特别提及。第一个突变是最常见的剪接位点缺陷LEPRE1公司突变；现已在22个突变等位基因中鉴定出(Baldridge等人，2008年;Bodian等人，2009年;Cabral等人，2007年)，几乎和所有其他人一样频繁LEPRE1公司突变结合在一起。我们在6名NIH OI严重减少或缺失的患者中发现了这种复发突变，IVS5+1G>T（c.1080+1G>T）LEPRE1公司mRNA，每个人都是非洲裔美国人或当代西非后裔(Cabral等人，2007年). 这种剪接供体位点突变导致转录物的五种选择性剪接形式，每种形式都包含一个PTC。为了确定携带者的发病率，我们筛选了三个当代非洲裔美国人队列。该数据得出了200-300名中大西洋非洲裔美国人中有1名（0.32%–0.50%）重复突变的携带者频率，并预测了由于这种突变的纯合子导致的VIII型OI的估计发病率，即每160–380000名非洲裔美国人有1名发生突变(Cabral等人，2008年). 这种突变的纯合子在出生后的最初几个月内都是致命的，而复合杂合子则活到十几岁，尽管他们在胶原蛋白3-羟基化方面没有显著差异。这种突变在当代非洲裔美国人和西非人中都有发生，这意味着这种突变是起源于非洲的创始突变，是随着大西洋奴隶贸易（公元1450年至1860年）传入美洲的。

第二个显著的突变发生在被称为爱尔兰旅行者的基因分离物中。外显子1的这种移码突变具有不同的表型，从围产期致死到存活，再到学龄期严重OI，尽管存在最低水平的OILEPRE1公司转录物与胶原3-羟基化(Baldridge等人，2008年;Williams等人，1989年).

第三个与众不同的麻风1突变通过最后一个外显子的帧移位影响P3H1的KDEL序列。P3H1是胶原蛋白脯氨酸3-羟基化复合物的唯一成分，其中包含一个ER-retrieval KDEL序列。Pro986羟基化严重降低的先证者中不存在含有KDEL基序的P3H1亚型，这表明P3H1的催化功能仅限于此形式(Willaert等人，2008年). 在先证者培养的成纤维细胞培养基中未发现分泌的P3H1，尽管转录物已被证明能够逃过NMD，正如PTC的位置所预测的那样。因为leprecan最初是在小鼠组织的细胞外基质中发现的(Wassenhove-McCarthy和McCarthy 1999年)由于从小鼠股骨中提取了一种与P3H1抗体反应的蛋白质(Cabral等人，2007年)分泌到细胞外基质中的P3H1亚型尚未确定。

临床上，VIII型OI与VII型一样，与Sillence II型和III型OI的表现重叠，尽管有明显的特征。婴儿时，VIII型OI表现为根茎和长骨，尤其是股骨的严重微管不足；长骨从子宫内断裂。胸腔没有严重/致命OI婴儿常见的串珠状外观，但肋骨纤细，无骨折或很少骨折。头围正常，尽管颅骨矿化不良，有虫骨和扩大的囟门，巩膜呈白色或浅灰色，与正常婴儿一样。

VIII型OI突变并不代表创始人突变或基因分离，最常发生在近亲婚姻中。其中许多案件已经终止。在活体出生的受影响个体中，存活时间从数小时到数周不等，直至学龄。据报道，有几名青少年患有VIII型OI，其中年龄最大的为17岁（P3H1 p.Tyr552X）或17-23岁（p.Arg685fsX）。非致死性VIII型OI的骨骼特征包括头围增大、脊柱侧凸、极度骨质脆弱和OI谱最严重端的矿化不足(Baldridge等人，2008年;Cabral等人，2007年). 他们的下肢长骨变得纤细，干骺端呈喇叭状，包含丰富的“爆米花”结构，这种结构也经常出现在上肢长骨中(Baldridge等人，2008年). 他们的手和手指长而纤细。

VII型和VIII型OI即使不是不可能，也很难在临床上相互区分。非洲裔美国婴儿对VIII型OI的怀疑程度应该很高，尽管CRTAP公司也已在该组中确定。然而，在非洲裔美国人中，新发的经典显性OI在北美的发病率将高于隐性OI。

无突变的预期后果CRTAP公司和LEPRE1公司

大多数已知的CRTAP公司和麻风1突变等位基因有望通过NMD降低转录水平。这种预期在所有通过实时RT-PCR分析转录水平的情况下都得到了证实，并且通过正常水平的CRTAP公司与p.Leu67Pro错义突变相关的转录本(Baldridge等人，2008年). 与突变和由此导致的转录物降解一致，CRTAP和P3H1分别在四个先证者的成纤维细胞中缺失CRTAP公司-无效突变和7例先证者LEPRE1公司-蛋白水平经Western blots检测的无效突变。美国国立卫生研究院之一LEPRE1公司-无效先证者残留有来自父系alelle的蛋白质，可能是从检测到的少量帧内转录物翻译而来(Cabral等人，2007年)在魁北克VII型OI指数家系中检测到CRTAP的残留量，与他们的轻度表型一致(Morello等人，2006年). 因此，如果没有胶原蛋白修饰复合物的任何一种成分，α1（I）胶原蛋白Pro986残基的3-羟基化就被取消或减少。尽管尚未证实，但在这些情况下，II、III和V型胶原的3-羟基化预计也会减少或消除。如胰蛋白酶消化胶原蛋白肽的串联质谱所示，只有0%–21%（在6个VII型OI先证者中）或0%–15%（在11个VIII型OI前证者）的α1（I）Pro986残基在成纤维细胞胶原蛋白中发生3-羟基化(表2). 这与正常对照组中94%–98%的Pro986羟基化、载体亲本中85%–91%的羟基化以及由具有CRTAP公司错义突变(Baldridge等人，2008年;Barnes等人，2006年;Cabral等人，2007年).

意外后果

在缺乏CRTAP或P3H1的细胞合成的胶原蛋白中，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，胶原蛋白α链表现出延迟电泳迁移。中I型胶原蛋白的氨基酸分析CRTAP公司-null和LEPRE1公司-与正常对照胶原相比，null成纤维细胞显示赖氨酰羟基化增加（分别为31%-35%和24%；Barnes等人，2006年;Cabral等人，2007年). 这与在螺旋羧基端附近有结构缺陷的胶原蛋白中发现的脯氨酰4-羟化酶和赖氨酰羟化酶修饰系统的过度修饰水平相当(Barnes等人，2006年). 先证者I型胶原的差示扫描量热法与修饰数据一致。在经典OI中，甘氨酸取代的存在导致胶原结构不太稳定，热稳定性降低。然而，我们先证者胶原蛋白的扫描显示，与正常对照组相比，其熔化温度增加了1°C，这是在没有原发性结构缺陷的情况下胶原蛋白过度修饰的预期结果(Torre-Blanco等人，1992年). 由于这些数据与胶原蛋白链长期暴露于赖氨酰羟化酶的情况一致，我们得出结论，P3H1蛋白的丢失或其在3-羟基化复合物中的作用导致胶原蛋白螺旋折叠延迟，导致过度修饰。值得注意的是，在作为杂合子携带者的父母中没有检测到明显的胶原蛋白修饰异常LEPRE1公司突变；亲本胶原蛋白的凝胶迁移是正常的LEPRE1公司实时RT-PCR上的mRNA，与Pro986残基的接近正常（85%–90%）羟基化一致(Cabral等人，2007年).

P3H1缺乏的第二个意想不到的后果是先证者成纤维细胞分泌I型胶原增加。我们进行了脉冲期实验，比较P3H1缺陷患者和两个独立正常对照组的成纤维细胞胶原合成，以观察胶原分泌动力学(Cabral等人，2007年). 与经典OI类似(拜尔和科尔2002)，我们发现I型胶原蛋白分泌速度延迟15至20分钟LEPRE1公司-空成纤维细胞，可能归因于胶原螺旋的过度修饰。令人惊讶的是，当我们将分泌的胶原蛋白量标准化为细胞数量时，我们发现总胶原蛋白分泌量比对照组增加了20%-50%。

这一结果尤其令人惊讶，因为过度修饰胶原蛋白的缓慢分泌预计会导致内质网应激，随后未折叠蛋白反应（UPR）通路上调(Kojima等人，1998年;Lisse等人，2008年;Wilson等人，2005年). 在经典OI中，异常前胶原的保留与几种ER受体蛋白的增加有关，包括胶原蛋白特异性伴侣HSP47、蛋白质二硫异构酶（PDI/P4Hβ）、BiP和脯氨酸4-羟化酶(Chessler and Byers 1993年;Ko和Kay 2004;Kojima等人，1998年;Walmsley等人，1999年). 相反，如HSP47、P4Hα和LH3基因敲除小鼠所示，胶原蛋白伴侣或翻译后修饰酶的缺失将增加细胞内滞留和降解，同时胶原蛋白总分泌也相应减少(Holster等人，2007年;Marutani等人，2004年;Rautavouma等人，2004年). 由于UPR反应导致翻译下调，因此P3H1缺陷成纤维细胞中胶原合成增加是违反直觉的，但可能暗示P3H1在调节胶原合成和分泌方面有直接或间接的作用。

对机制的思考

VII型和VIII型OI是隐性骨软骨营养不良症，我们对其机制的疑问多于答案。鉴于CRTAP和P3H1的多功能性质，ER抗原修饰功能的丧失与分泌蛋白基质功能的丧失的各自作用尚待确定。此外，胶原蛋白修饰功能不仅涉及I型胶原蛋白，而且还涉及II型、V型和可能的IV型胶原蛋白。隐性OI儿童的一些最严重的发现，包括极端生长缺陷，可能与软骨和II型胶原的关系与I型胶原的关系一样多或更多。许多这些问题都需要有条件的动物模型来回答；然而，自从击倒老鼠Crtap公司和勒普雷1与人类相比，它们的表型要温和得多，这些答案可能很难找到(Bachinger等人，2009年;Morello等人，2006年).

P3H1修饰IV型胶原蛋白的可能性尚未得到证实。Tiainen和同事（2008）表明P3H2优先羟基化肽，其序列与IV型胶原相对应，而不是I型胶原；这些发现得到了证实P3H2是肾脏中表达的主要P3H亚型的数据的支持(Vranka等人，2009年). 然而，成年大鼠肾小球足细胞和系膜细胞中P3H1/leprecan的低水平表达表明该组织可能具有功能(Lauer等人，2007年). 由于肾脏通常很少有I型或III型胶原蛋白，因此P3H1在肾脏发育中的作用需要验证IV型胶原蛋白作为这种酶的底物，或者确定蛋白质分泌形式的基质功能。P3H1的几种亚型在肾脏中的表达也使其作用的确定变得复杂；这些亚型是否包括羧基末端KDEL序列，或是否代表具有交替剪接羧基末端的转录物，该末端编码分泌的细胞外基质蛋白聚糖，尚不清楚(Lauer等人，2007年;Wassenhove-McCarthy和McCarthy 1999年). 尽管有报道称尿钙水平升高和肾结石发生率增加，但在显性或隐性OI患者中没有发现肾功能受损的证据(Chines等人，1995年;Vetter等人，1989年). 事实上，唯一发表的肾小球疾病报告发生在oim公司小鼠，这是一种极为罕见的隐性OI的模型，其特征是由于空第1a2列等位基因(Brodeur等人，2007年;菲利普斯等人，2002年). 对少数存活的P3H1缺乏症患者的肾功能调查应有助于确定其在肾脏发育中的作用。

另一个主要问题涉及脯氨酰3-羟基化本身的作用。在I型和II型胶原蛋白中，它发生在许多潜在的X位置脯氨酸的单个残基上。从胶原蛋白结构的角度来看，Pro986的羟基化似乎对胶原蛋白螺旋的正确折叠没有必要。如果Pro986的3-羟基化对胶原蛋白底物的结构或稳定性不是至关重要的就其本身而言也可能对复合体的功能很重要。修饰反应的完成可能会改变一个或多个络合物组分的二级结构或络合物的三级结构。它还可能作为CyPB或其他对脯氨酰异构化很重要的PPI酶的结合位点和起始点，脯氨酰基异构化是胶原折叠的速率限制步骤。Pro986的羟基化可能是必要的，如果不够的话，可以作为胶原蛋白螺旋正确折叠的触发因素。尽管存在功能性胶原蛋白修饰复合物，但这些问题仍有待实验结果的解决，这些实验涉及替换Pro986残基或重新定位修饰残基周围的三联体，以消除或重新定位3-羟基化位点。

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