初级和次级甲状腺激素转运蛋白

摘要

介绍

近年来，甲状腺激素（TH）转运体的研究已成为甲状腺研究的新兴领域之一。在发现TH转运体MCT8（单羧酸转运体8）失活突变后，加强了对TH转运体的分子研究。这些突变导致Allan-Herndon-Dudley综合征（AHDS）[1]这是一种X染色体连锁的精神发育迟滞。受影响的患者TSH（促甲状腺激素，促甲状腺素）正常，但T升高_三（3,3'，5-三碘-L-甲状腺素）和T₄（3,3'，5,5`-四碘-L-甲状腺素）血清水平[2-6].

TH对人脑的发育、生长和细胞新陈代谢至关重要。胚胎早期发育期间TH可用性的功能障碍导致神经功能缺陷[7]. 在大脑中，TH对于神经元的及时迁移、突触接触的形成和髓鞘形成等非常重要[8]. 神经元是T细胞的主要靶细胞_三在大脑发育过程中。根据目前的概念，前激素T₄进入邻近的星形胶质细胞，脱碘酶2转化T₄激活形式T_三然后由MCT8转运到神经元[9].

T摄取受损_三表达MCT8的中枢神经元可以解释AHDS患者的神经功能缺陷[1,三]. 令人惊讶的是，相应的Mct8-缺陷小鼠仅表现出内分泌变化，而没有表现出受影响人类的神经表型。小鼠的外周组织出现甲状腺功能亢进症状，中枢神经系统出现甲状腺功能减退症状。大脑对外源性T的摄取_三也显著减少，而T的摄取₄与野生型小鼠相比，具有50%的运输活性[10-12].

根据这些数据，我们假设额外的TH转运体（“次级TH转运体”）或其表达模式和底物特异性的差异可以补偿小鼠Mct8的损失[13]. 最后，很明显，次级TH转运蛋白对不同类型细胞的TH摄取和流出也非常重要。而目前已知的主要TH转运蛋白MCT8仅对TH具有高度特异性[14]，次级TH转运蛋白也能够转运不同种类的氨基酸，并且包括芳香族氨基酸转运MCT10、有机阴离子转运多肽转运蛋白（例如OATP1C1、OATP1A2、OPTP1A4）和大的中性氨基酸转运蛋白（LAT1和LAT2）。

这里还考虑了另一种氨基酸转运蛋白，L-胱氨酸和L-谷氨酸的钠非依赖性交换物（xCT），它甚至可以转运带负电荷的氨基酸，因为xCT在分子特征和质膜转运机制方面与LAT转运蛋白极为相似。

因此，我们在这里回顾了关于一级和二级TH转运体在序列、向质膜的转运、分子特征、预测的膜拓扑结构、潜在结构和功能方面的相似性和差异的现有数据。因此，我们这里的重点是血脑屏障（BBB）中发生的TH转运体。

TH初级和次级转运体的表达模式

大脑中的研究表明，神经元中MCT8的表达对神经元摄取T至关重要_三[15]. 大脑对T的摄取减少_三和T₄在Mct8-缺陷小鼠中，表明Mct8通过BBB运输TH。Roberts等人。可以在脑微血管中显示MCT8的表达，并在人、小鼠和大鼠脑的BBB中显示MCT 8的表达[13]. 这些表达谱支持这样的观点，即MCT8不仅在人类和啮齿类动物大脑中的TH活动中起主要作用，而且在人类通过BBB在大脑中摄取TH中也起主要作用。MCT8也在甲状腺、肝脏、睾丸和骨骼肌中表达（表​（表1）。1). 转运TH的MCT家族的另一个成员MCT10与MCT8的表达模式重叠，只是在甲状腺、大脑和睾丸中未检测到MCT10（表​（表11).

OATP1C1样MCT8在小鼠和大鼠的BBB中表达，但在人类BBB中的表达程度要低得多[13]. OATP1C1在啮齿动物中的强表达，但在人类BBB中的表达较少，这可以解释为什么Mct8-缺陷小鼠没有表现出AHDS患者的神经系统变化。OATP家族成员OATP1A2和OATP1A4也在大脑中表达，并显示TH的转运（表​（表1）1) [16].

TH转运体LAT1和LAT2在各种组织中表达，例如在脑毛细血管内皮细胞、胎盘和肠的管腔膜和胚泡膜中，而LAT1在肿瘤细胞中也表现出高表达水平（表​（表1）。1). 这两种转运体都在BBB表达，因此LAT1表达高于LAT2[17]（图​（图1）。1). LAT1和LAT2与护送蛋白4F2hc（4F2重链，CD98）形成异二聚体，该蛋白在肿瘤、脑、肾、肠和胎盘中广泛表达（表​（表1）1) [18,19].

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图1

血脑屏障（BBB）表达TH转运体的图示。TH转运体MCT8、OATP1C1、LAT1和LAT2在BBB表达，其中LAT2的表达水平低于LAT1。前激素T₄进入星形胶质细胞并转化为活性形式T_三通过外环脱碘。根据目前的概念，T_三通过TH转运体MCT8进入神经元。

氨基酸转运蛋白xCT也在大脑中表达（表​（表1）1) [20,21]有研究表明，氧化应激后xCT在胶质细胞中上调，对保护神经元免受氧化应激起着重要作用[22].

TH转运器的拓扑结构

这里考虑的TH转运体通过包含12个跨膜螺旋（TMH）显示出一个共同的拓扑结构，而N端和C端的尾部位于细胞内，就像主要促进超家族（MFS）的大量其他已知转运体一样（参见转运体数据库http://www.tcdb.org/superfamily.php). MFS是一个进化多样的超家族，包括10000多个序列成员，可催化单端口、同端口和反端口运输机制。

MCT8和MCT10属于单羧酸盐转运蛋白家族的MFS亚群。由于MCT1-4成员的单羧酸盐转运是质子连接的，因此这里不再进一步考虑这些MCT转运蛋白。

OATP家族成员Oatp1a4和Oatp1 a5是第一个克隆的TH转运蛋白[23]. 尽管OATP家族在序列相似性方面也属于MFS，但它与MCT8和MCT10的距离更大。

LAT1和LAT2距离MCT8更远。它们是氨基酸-多胺-有机化（APC）超家族的成员，当与SLC3A2/4F2hc结合时，将钠诱导的大中性氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、精氨酸和色氨酸从细胞外液运输到细胞内。谷氨酸转运xCT也属于APC家族，在分子水平上与LAT具有高度相似性。

目前缺乏所有TH跨膜转运蛋白的详细实验结构信息。因此，3-磷酸甘油转运体（GlpT，PDB代码1PW4）的晶体结构[24])MSF超家族的另一个成员，已被用作MCT1同源模型的结构模板[25]，百万立方英尺8英寸[26]，和OATP1C1[27]. 尽管有人认为GlpT处的底物易位与N端和C端结构域的交替存取机制的构象变化有关[23,25]，具体TH运输工具的详细信息尚不清楚。

在细菌转运体的众多X射线结构中，另一种MFS类型乳糖H的高分辨率三维结构⁺同向转运体（蕾丝）[28,29]，也显示了与GlpT最接近的结构同源性。APC家族转运蛋白的晶体结构，即质子偶联的广谱氨基酸转运蛋白apo-ApcT[30]，显示12个TMH处于向内apo状态。它显示了在神经递质转运体的细菌同源物晶体结构中与12个TMH的结构相似，神经递质转运体是钠依赖性亮氨酸转运体（LeuT）超嗜热菌[31].非离子依赖型GlpT结构具有单一的基底结合位点。MSF和APC家族中的其他可用结构来自质子或离子偶联转运蛋白，并含有与同向质子或离子结合的额外位点。

TH转运蛋白的底物光谱范围很广

到目前为止，细胞对TH的摄取已显示为单羧酸转运体MCT8和MCT10，有机阴离子转运多肽，例如OATP1C1、OATP1A2和OATP1A4，以及异二聚氨基酸转运体LAT1和LAT2[16].

MCT8被确定为T的第一个特异性转运体₄和T_三并被发现运输其非活性TH代谢物，如rT_三（3,3'，5`-三碘-L-甲状腺素）和3,3`-T₂（3,3`-二碘-L-卟啉）[14]. 因此，T的运输<sub>三</sub>高于T<sub>4</sub>或rT<sub>三</sub>分别为（T<sub>三</sub>>T型<sub>4</sub>>rT公司<sub>三</sub>约3,3`-T₂)（表​（表2）2) [14]. 为了通过人类MCT8运输，底物需要每个芳香环至少一个碘原子，最好分别位于其3和3`位置[26]. 两种甲状腺素均不存在（除3-碘甲状腺胺外[32])，碘甲状腺原氨酸的脱羧代谢物，或缺乏手性中心和氨基的TH衍生物是MCT8的底物[26,32]. MCT10首次被鉴定为芳香族氨基酸的T型转运蛋白[33]及以后Friesema等人。表明MCT10对TH转运的活性至少与MCT8相同[34].

转运TH的OATP家族成员显示出更广泛的底物光谱，例如除了转运TH外，他们还转运胆汁酸、类固醇激素[35]和毒品[36]. OATP1C1的功能转运分析表明，T₄和rT_三是OATP1C1的高亲和力底物，而T的特异性摄取_三比T低约5倍₄和rT_三（T₄~r吨_三>T型_三) [37-39]（表​（表2）。2). 有人建议OATP1C1主要负责T₄血液通过血脑屏障进入大脑，血脑屏障局部转化为活性T_三MCT8将其转运至神经元[40].

LAT1和LAT2运输大的中性氨基酸和氨基酸相关化合物，而LAT2也运输小的氨基酸[41,42]. LAT1的功能分析可以证明碘甲状腺原氨酸的摄取量，其下降顺序为3,3`-T₂>rT公司_三~吨_三>T型₄在LAT2介导的转运中，碘甲状腺原氨酸摄取量增加较小（表​（表2）2) [43].

氨基酸转运蛋白xCT负责胱氨酸通过质膜的转运[44,45]. 它介导氨基酸交换，并偏好胱氨酸和谷氨酸作为底物[46].

TH转运体在分子水平上的异同

序列

图中显示了所讨论的TH转运蛋白的不同序列比例和特征的比较​图2。2三个TH转运蛋白家族（MCT、OATP和LAT）之间的序列长度、比例和已知的转运敏感性特征不同。由于与LAT序列的高度相似性，我们在这里也考虑了xCT序列。

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图2

初级和次级TH转运体的序列比例和功能敏感性特征的比较。血脑屏障（BBB）上表达的TH转运体的序列图根据常见的12个跨膜扳手（浅灰色方框）的序列进行排列。三个TH转运蛋白家族（MCT、OATP和LAT）之间的序列长度、比例和已知的转运敏感性特征不同。xCT序列与LAT非常同源，因此被添加。人MCT8在细胞内部分具有非常大的N-末端尾部。细胞内和细胞外保守的半胱氨酸用黄色条标记。OATP家族的N-糖基化位点在大的细胞外环EL2和EL5（品红色条）中保守。LAT和xCT家族与护送蛋白4F2hc形成的已证实的二硫键桥在EL2（C165-LAT1_人类[49]或C158-xCT_human[50]黄色条上用红点*标记）。突显突变识别的TH转运的敏感部位：MCT8_人类：R445A（#蓝条，TMH8[26])和D498A（&红色条，TMH10[26])敏感的精氨酸和天冬氨酸在MCT8和MCT10组保守；燕麦1c1_rat:W277A和W278A（§绿色条，TMH6[27])、G400A和G410A（■和▼绿色条，TMH8[30])，R601A（//蓝色条，TMH11[27]); OATP1A2_人：I13T（ŞN端尾部[63])，R168C（▲蓝条，TMH4[58])，E172D（红色条，TMH4[63]). 位置13处的异亮氨酸（绿色条，N末端尾部）仅在OATP1A2组中保守，而敏感色氨酸（绿色条）、精氨酸（蓝色条）和谷氨酸（红色条）在OATP家族中保守。在人体xCT处，可靠近底物结合位点H110（+蓝条[21])和T112（○绿色条[21])在IL1和C327中（~黄色条[62])TMH8处。这些蛋白质的登录号为NM_006517.3（MCT8_human）、NM_009197.2（MCT9_mouse）、NM_147216.1（MCT8 _rat）、NM_018593.4（MCT10_human，AF205071.1（OATP1A4_人类）、NM_030687.1（OATP1A人类）、NM_131906.1（OATP1人类）、BC039692.2（LAT1_人类），BC026131.1（LAT1人类）、CH473972.1（LAT1_rat），NM_001082120.1（LAT2_rabbit）、BC052250.1（LAT2_人类，NM_011990.2（xCT_住宅），NM_001107673.2（xCT_rat）。

序列比对显示，MCT8，尤其是人类MCT8包含一个非常大的N末端尾部，其功能尚不清楚[47]. TH转运MCT家族成员MCT8及其近同源物MCT10均不包含细胞外糖基化位点[34].

其他次级TH转运体，如OATP家族的转运体则不太相似。它们显示EL2、EL5和EL6中含有大量保守半胱氨酸的较大细胞外环（EL）（图中的黄色条​图2）2)可能是二硫键桥联的。此外，EL2和EL5中的几个保守糖基化位点可能负责向细胞膜（图中的品红色条）适当输送这种转运蛋白类型​图22).

属于APC超家族的转运蛋白，如LAT1/2和xCT，与MCT8的进化距离更大。与其他TH转运体一样，它们拥有12个跨膜α-螺旋扳手，但要获得合适的膜表达，它们需要单螺旋跨膜扳手护卫蛋白4F2hc[48-50]. 这种转运体类型缺乏任何糖基化位点，因为糖基化部位仅包含在4F2hc的大细胞外部分。因此，两种转运体类型（LAT和xCT）实际上都与由护送蛋白4F2hc提供的第13 TMH紧密相关。这种奇数目的跨膜片段可能是TMH2和TMH3之间的潜在细胞内环路1（IL1）在xCT中组织为重入环路的原因之一。在一项详细的实验研究中，阐明了xCT的拓扑结构[21]结果表明，IL1中的组氨酸110（图中标记为+​图2）2)和苏氨酸112（图中标记为°​图2）2)在人类xCT中的空间位置，可以从细胞外侧进入。在xCT中，IL1的一部分以这样的方式插入跨膜节段之间，使得两个残基可以从细胞外侧进入。

IL1的残基数量和性质在xCT和LAT1/2中高度保守。此外，在相应的氨基酸位置，xCT（H110和T112）显示了细胞外可及性，亲水残基天冬氨酸和丝氨酸分别出现在LAT1和LAT2中（图中IL1处的红色和灰色条​图2）。2). 因此，IL1也可以在LAT1和LAT2中用作再入环路。

潜在参与底物相互作用和功能运输的氨基酸的功能数据

对TH转运体的不同功能研究可以确定可能参与底物相互作用的氨基酸残基。为了深入了解TH转运中的结构-功能关系，我们为人类MCT8设计了第一个结构模型。因此，TMH8处的保守和带电荷的氨基酸R445（图中标记为#​图2）2)和D498位于TMH10（图中标记​图2）2)已确定参与底物相互作用。废除的T_三丙氨酸突变体R445A和D498A的转运支持了它们在底物识别中的预测作用，尽管这两个突变体都暴露在细胞表面[26].

敏感精氨酸（蓝条）和天冬氨酸（红条）分别在TMH8和TMH10的MCT8和MCT10组中保守（图​（图2）。2). MCT8模型可以确定TH的转运特征，并合理化氨基酸的潜在相互作用，包括AHDS患者中突变的氨基酸。

在高亲和力T中₄转运蛋白Oatp1c1Westholm等人。已确定的氨基酸残基对T至关重要₄并证明存在高亲和力和低亲和力结合位点[27]. 在他们的研究中，他们绘制了大鼠Oatp1c1底物相互作用位点。W277和W278（图中§​图2）2)被证明在T₄在一个结合位点上具有直接结合作用的运输。

到达细胞膜但影响转运功能的Oatp1c1突变，如TMH8处的G400A/V和G410A/V（图中标记为■和▼​图2）2)被提议参与运输动力学。它们的丙氨酸突变体和缬氨酸突变体表现出野生型摄取活性，但T降低₄在高底物浓度下运输。作者认为，底物结合位点可能会坍塌或无法在输入和输出状态之间转换。基于保守精氨酸R601的突变体（图中标记//​图2）2)在大鼠Oatp1c1的TMH11中，作者认为这种精氨酸可能在OATP成员中作为与Oatp1c1阴离子结合的反电荷[27]. 已检测到单核苷酸多态性（SNPs）的遗传变异与人类OATP1A2甲氨蝶呤转运等底物转运障碍有关[58]例如TMH4处的R168C[58]（图中标注▲​图2）。2). 最近已经证明，其中一些SNP，如细胞内N末端尾部的I13T（图中标记为●​图2），2)，和TMH4处的E172D（图中标记了​图2），2)，也影响T_三和T₄运输[59].

我们的序列比较方案表明，异亮氨酸（图中标记为●​图2）2)N末端尾部的氨基酸位置13仅在OATP1A2组中保守（图中绿色条​图2），2)而其他识别出的对TH敏感的残留物，如精氨酸（图中的蓝条​图2）2)和谷氨酸（图中红色条​图2）2)位于TMH4的两个色氨酸（图中的绿色条​图2）2)在TMH6中，TMH8中的两个甘氨酸（绿色条）和TMH11中的精氨酸（蓝色条）在OATP家族中是保守的。

因此，值得注意的是，TH转运敏感位置甘氨酸410（图中标记为&#9679​图2）2)TMH8中大鼠Oatp1c1的位置对应于转运敏感精氨酸445的位置（图中标记#​图2）2)在人类MCT8的TMH8中。

Boado等人。确定了兔L型氨基酸转运蛋白LAT1中的氨基酸，这些氨基酸可能参与向质膜的转运机制。他们表明，半胱氨酸残基439（对应于人类LAT1中的C443）在TMH11处对质膜中转运蛋白的折叠或插入起着重要作用[56]. 对兔LAT1中氨基酸G219和W234的突变分析表明，LAT1的亲和力和容量发生了显著变化，这两种氨基酸与人或大鼠LAT1存在差异[60]. 为了确定与轻链识别相关的结构域，通过以下方法研究4F2hc对LAT1、LAT2和y+LAT2的识别Bröer等人。。他们认为4F2hc的胞外结构域主要负责识别LAT1以外的轻链，并且胞外结构区确保了适当的质膜移位[61]. xCT的功能数据表明H110位于IL1中，此处也表示再入回路（图中标记为+​图2）2)可能靠近xCT的底物结合/渗透途径[21]. xCT TMH8半胱氨酸残基327的研究（图中标记~​图2）2)表明它也位于xCT的底物结合位点附近[62]. TMH8的这种转运敏感半胱氨酸在xCT和LAT1转运蛋白中保守，但在LAT2中不保守。此外，它偶尔发生在OATP组。

已在TMH8和TMH10上发现对TH转运敏感的MCT8残留物，并优先在燕麦lcl的TMH4、TMH6、TMH8及TMH11上发现。到目前为止，还没有关于LAT1和LAT2的TH转运敏感残基的报告。然而，对于高度同源的xCT，已在重入环IL1和TMH8上识别出与底物运输相关的残基。通过将运输敏感特征映射到序列对齐方案上进行比较时（图​（图2），2)，很明显，所鉴定的残基几乎只在一个特定的TH转运蛋白家族中保守。在所有三个被考虑的家族中，没有一个敏感的残基是高度保守的。然而，Oatp1c1的TMH8处的TH敏感甘氨酸和xCT的TMH8处的底物敏感半胱氨酸的位置与类似区域相对应，在MCT8的TMH8-中发现了TH转运敏感精氨酸（图​（图22).

结论

TH转运体序列的比较表明，除MCT10外，属于不同转运体类型家族的次级TH转运体与初级TH转导体MCT8的差异更大。由这些不同的转运体运输的所有不同内源性底物都包含至少一个共同的分子特征，即氨基酸的氨基和羧酸官能团。对已识别的敏感TH转运残基的位置和类型的比较表明，已知的正电荷或负电荷残基作为保守氨基酸出现在每种转运蛋白类型中，但不是在所有TH转运蛋白中。由于高度不同的氨基酸性质（分别为精氨酸和甘氨酸）已被鉴定为对MCT8和Oatp1c1的TMH8相应位置的TH转运敏感，我们推测MCT8与Oatp1之间的转运机制的分子细节不同。从三种次级TH转运体类型之间的差异序列特征和缺乏任何高度保守的敏感正负电荷残基作为底物氨基酸部分的共同对应物来看，我们的结论是，分子转运机制可能是由a）不同的分子决定簇在不同的转运蛋白类型中组织的，或者b）转运蛋白底物氨基酸部分的对应物不是带电荷的侧链，而是其他质子受体或供体。此外，尽管TH转运体共用常见的12个跨膜扳手，但所有TH转运体的构象不太可能完全相同，尤其是至少对于显示由护送蛋白提供的相关第13个跨膜螺旋的LAT家族而言。同源xCT的发现也支持两个LAT的独特构象，表明IL1具有重入功能。另一方面，在不同的TH转运蛋白MCT8、OATP1C1甚至在xCT中，TMH8处底物转运的敏感位置（尽管通过不同的残基）的一致性至少可以暗示在本文所考虑的转运蛋白的TMH8上的可比内部位点执行的共有分子转运事件。

因此，通过研究不同底物及其靶标之间的结构-功能关系，详细了解TH通过膜转运蛋白转位的分子机制，对于理解TH转运缺陷的分子原因至关重要。在这方面，未来对发散型TH转运蛋白中不同底物转运的分子机制的研究对于阐明TH转运的结构-功能特性具有重要意义。

相互竞争的利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

AK撰写草案，分析数据，准备数据，进行数据评估和讨论；RS起草、数据讨论、项目协调；GK撰写草案，分析数据，数据评估和讨论，项目协调。

缩写

AHDS：Allan-Herndon-Dudley综合征；APC超家族：氨基酸-多胺-有机化超家族；asc1:asc型氨基酸转运蛋白1；BBB：血脑屏障；LAT：L型氨基酸转运蛋白；MCT：单羧酸转运体；MFS：主要促进者超家族；OATP：有机阴离子转运多肽；单核苷酸多态性；TMH：跨膜螺旋；rT公司_三：3,3'，5`-三碘-L-甲状腺素；3,3`-T型₂：3,3`-二碘-L-卟啉；T型_三：3,3'，5-三碘-L-甲状腺素；T型₄：3,3'，5,5'-四碘-L-甲状腺素；TH：甲状腺激素；TSH：促甲状腺激素、促甲状腺素；4F2hc:4F2重链，CD98；xCT：胱氨酸/谷氨酸交换器；y+LAT1:y（+）L型氨基酸转运蛋白1。

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