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再生医学。作者手稿；PMC 2012年1月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
Regen Med.2011年3月；6(2): 201–213.
数字对象标识：10.2217/rme.11.6
预防性维修识别码：项目经理3154698
尼姆斯：美国国家卫生研究院303395
PMID：21391854

干细胞技术在运动神经元疾病研究和治疗中的应用

J西蒙·伦恩,1 斯泰西·萨科夫斯基,1 泰斯·费德里奇,2 乔纳森·D·格拉斯,三 尼古拉斯·M·布利斯,2和伊娃·L·费尔德曼1,†
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

肌萎缩性侧索硬化和脊髓性肌萎缩是一种破坏性的神经退行性疾病，可导致运动神经元的特异性丢失。最近，干细胞技术已被开发用于这两种疾病的研究和治疗。在这里，我们讨论了目前正在研究的用于机制发现和治疗发展的不同干细胞，包括胚胎干细胞、成体干细胞和诱导的多能干细胞。我们还提供了利用干细胞技术治疗肌萎缩侧索硬化和脊髓性肌萎缩的支持性证据，并描述了将干细胞治疗运动神经元疾病的方法从卧床过渡到床边时必须考虑的关键问题。最后，我们讨论了目前正在进行的第一项人体I期试验，该试验旨在检查肌萎缩侧索硬化症患者脊髓内注射干细胞的安全性和可行性，以此作为将干细胞疗法转化为各种神经疾病的基础。

关键词：肌萎缩侧索硬化，诱导多能干细胞，运动神经元病，一期临床试验，脊髓肌萎缩，干细胞，转化医学

干细胞技术正在成为研究和治疗各种疾病的越来越流行的工具。在目前的综述中，我们描述了支持利用干细胞治疗运动神经元疾病的基础。我们首先概述干细胞生物学，然后讨论利用干细胞进行肌萎缩侧索硬化（ALS）和脊髓肌萎缩（SMA）的机制发现和治疗背后的原理。最后，我们描述了干细胞治疗从工作台到床边的转变，讨论了目前正在进行的对ALS患者椎管内神经干细胞注射安全性的第一项临床试验。

干细胞：正确工作的正确工具

“干细胞”是一个常用术语，用于描述几种具有特定细胞特征的不同细胞群体。干细胞的基本原理是自我更新和分化为多种细胞类型的能力，有多种细胞系，包括胚胎干细胞[1,2]，神经前体细胞（NPC）[三,4]，成人神经干细胞[5]和成人非神经间充质干细胞（MSCs）[6,7]它们的衍生来源和分化潜能不同(图1). 多能干细胞（如ES细胞）具有从所有三个胚层分化为细胞的无限制能力，而NPC和MSC的分化天生局限于各自的谱系。虽然ES细胞的多能性以及NPC和神经间充质干细胞的神经元分化潜能对于运动神经元疾病的治疗具有吸引力，但与其他任何成体干细胞相比，成体非神经MSC更丰富，更容易分离。这些细胞为自体细胞治疗的发展提供了一种选择，以避免组织移植的免疫反应问题，但神经疾病治疗的发展在一定程度上依赖于从间充质细胞到神经细胞的跨谱系分化能力。许多论文不同程度地描述了MSCs的神经元分化[8,9]; 然而，从患有退行性疾病的患者身上生成MSCs或任何其他干细胞，都有可能以某种方式危害最终的人群。

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神经疾病研究和治疗进展中干细胞的衍生

胚胎干细胞来源于胚泡内细胞团，具有不受限制地从所有三个胚层分化为细胞的能力。神经祖细胞和神经干细胞分别来源于胎儿或成人组织，并产生神经谱系。间充质干细胞来源于骨髓，但必须跨谱系分化，以产生用于自体治疗的神经细胞。成纤维细胞用于衍生诱导的多能干细胞，可用于生成新的神经疾病模型。

当面临哪种干细胞适合治疗疾病的问题时，很可能没有正确的答案。更好的问题是，这些特定的干细胞为特定的疾病提供了什么，以及干细胞预期会做什么？在运动神经元疾病的背景下，干细胞可以通过多种方式与其环境相互作用。干细胞可以提供细胞替换、增加细胞数量或提供丰富的细胞外微环境[10]. 在运动神经元疾病中，直接替换运动神经元群不太可能是可行的选择。虽然已有纯化和富集干细胞用于运动神经元分化的既定方案，但没有证据表明细胞替换会导致靶肌肉神经支配[11–15]. 在像ALS这样的疾病中，疾病的非神经元成分因胶质细胞功能障碍而永久存在，添加“新鲜”胶质细胞以增加常驻胶质细胞数量可能会减轻内源性胶质细胞的压力[16]. 移植细胞通过产生生长因子提供营养支持也可为患病运动神经元提供急救[10,17]. 许多生长因子具有非常强大的神经保护特性，并可能丰富脊髓的微环境[10]. 每一个干细胞株在其分泌特征和终末分化能力方面都具有独特的特征。干细胞治疗的优势在于，潜在的有益效果并不相互排斥，细胞和营养干预都是由单一治疗提供的。

运动神经元疾病机制的探讨

肌萎缩侧索硬化

肌萎缩侧索硬化症是一种成年发病、进展迅速的神经退行性疾病，其特征是上下运动神经元选择性丧失。据估计，美国ALS的发病率为每10万人3-5例[18]大约10%的患者受到家族性ALS（fALS）的影响。常染色体显性fALS在临床和病理上与散发性ALS无明显区别，这两种类型在发病3-5年内都是致命的。通常，ALS的诊断发生在出现症状后的疾病过程中很晚，此时大量运动神经元已经丧失。1993年，细胞溶质铜发生突变2+/锌2+几个fALS家族中的超氧化物歧化酶（SOD1）[19]目前已鉴定出150多个SOD1错义突变[20,21]. 然而，尽管经过十多年的研究，与突变SOD1相关的毒性获得功能的病因仍不清楚。研究已经描述了许多机制，包括线粒体功能障碍、蛋白质运输缺陷、聚集、活性氧物种、兴奋性毒性应激、胶质细胞和星形胶质细胞功能障碍等[22]. 最近，在DNA/RNA结合蛋白TDP-43和FUS/TLS中发现的突变也为ALS的遗传成分增加了新的维度，并提出了潜在的机制[23–26]. 然而，越来越多的共识是，复杂的ALS疾病表型可能是由于多种机制的作用。

传统上，与fALS相关的突变已在大鼠和小鼠中用于建立ALS模型。这些啮齿类动物模型显示，在人类形式的ALS中观察到相同的运动神经元丢失[27,28]. SOD1-G93A小鼠在180天时出现疾病发作，进行性运动缺陷和肌肉无力，大约240天时出现终末期[28]. SOD1-G93A大鼠表现出一种非常严重的病程，发病约115天，随后在11天内迅速发展到终末期，在整个病程中伴随着肌肉力量的相关症状缺陷和运动神经元的丧失[27]. 最后，TDP-43突变小鼠发展为进行性运动神经元、体重和肌肉损失，并为研究ALS发病机制提供了额外的模型[29].

过去十年的研究已经生产出一种美国FDA批准的治疗ALS的药物，利鲁唑[30]. 自那时以来，还研究了几种具有强大潜力的治疗ALS的新型治疗方法。在SOD1-G93A小鼠中，当在症状出现之前给予突变SOD1时，使用慢病毒递送的短发夹对SOD1进行沉默可延迟疾病发作和疾病进展[31]. β-内酰胺类抗生素头孢曲松通过增加谷氨酸转运体的表达，延缓SOD1-G93A小鼠运动神经元的丢失，提高肌肉力量并增加存活率[32]或作为金属离子螯合剂[33]. 吡格列酮是一种抗炎/抗糖尿病药物，也能提高SOD1-G93A小鼠的肌肉力量和运动神经元存活率[34]. 锰卟啉和丙酮酸治疗对SOD1-G93A小鼠的疾病进展都显示出有益的作用[35,36]. 最后，生长因子因其作为治疗剂的潜力而越来越多地被描述。脑脊液中IGF-I、VEGF等生长因子水平的变化导致了一种假说，即上调和维持生长因子水平可能为运动神经元提供神经保护[37,38]. 事实上，生长因子治疗证明了运动神经元存活的神经保护特性在体外和体内[39–43]; 然而，向大型动物和人类转化的速度很慢，没有产生预期的结果[44–48]. 这些结果可能与脊髓内运动神经元对此类治疗的可及性有限有关[43].

脊髓性肌萎缩

脊髓性肌萎缩是一种遗传性常染色体疾病，临床表现为广泛的发病和严重程度，与脊髓内运动神经元的选择性丢失和肌肉无力有关。目前还没有有效的SMA治疗方法，治疗方案要么基于姑息治疗，要么基于使用Bipap机器的呼吸协议，要么基于气管切开术为患者通气以帮助呼吸。临床上，SMA有四种不同的形式[49]. I型SMA是婴儿死亡的主要遗传原因，是SMA最严重和最常见的形式，发病率为1/6000。SMA I型通常在出生后6个月内被诊断，预后不良，通常与呼吸衰竭和2年内死亡有关。婴儿表现为近端无力、肌肉张力差、无法支撑自己或抬起头。II型SMA的严重程度低于I型，发病稍晚，预期寿命更长，而III型和IV型SMA均表现为缓慢、轻度的肌肉无力，患者的寿命正常。由于SMA I型的严重性及其在这些婴儿中的表现，它是发展干细胞治疗的一个关键疾病。

超过90%的SMA病例是由存活运动神经元的纯合子缺失引起的(SMN公司)1基因。尽管大多数SMA病例都与缺乏功能性SMN1型基因，SMN1的功能丧失导致疾病仍存在争议。在人类中SMN公司存在，SMN2型[50].SMN2型与相同SMN1型除了一个单核苷酸突变导致转录物选择性剪接外，导致第7外显子缺失的非功能性截短蛋白。一小部分SMN2型-然而，衍生的转录物没有选择性剪接，导致少量功能性全长蛋白，可以部分补偿SMN1的缺失[51,52]. 因此，作为治疗SMA的一种手段，调节产生全长蛋白的SMN2比例是多项研究的主题[51].

最初创建SMA动物模型的尝试依赖于淘汰法；然而，其他动物却不一样SMN公司作为人类的复制和淘汰表面活性剂导致胚胎死亡[53]. 另一方面，Smn公司+/负极脊髓中SMN蛋白水平下降约50%的小鼠类似于不太严重的SMA III型，疾病进展缓慢，迟发性运动神经元丧失[54]. 基于人类引入的模型SMN2型在上SMN公司淘汰赛背景(SMN2型热重（tg）/Smn公司−/−)然而，已经开发出模仿人类SMA I型的遗传基础并规避传统SMA的胚胎致死性SMN公司淘汰模型[55]. 这些模型的严重性取决于SMN2的剂量；表达1-2拷贝的小鼠存活到出生后第5天，而超过6拷贝的小鼠会消除SMA表型[56,57]. 这些模型进一步验证了靶向SMN2表达水平用于SMA治疗发展的可行性。

诱导多能干细胞：疾病建模和治疗发展的未来

患者特异性诱导多能干细胞（iPS）为研究SMA和ALS等疾病提供了理想的新模型，因为它们本质上将细胞行为与供体疾病表型联系在一起。iPS细胞是通过将体细胞重新编程回到多能状态而开发出来的，为研究疾病机制和发现和开发新的治疗方法提供了许多优势[58–61]. 对于像ALS这样的疾病，大多数病例没有已知的遗传病因，iPS细胞提供了一种方法来建立家族性和散发性疾病的模型。然后，患者特异性iPS细胞系可用于检测疾病机制、药物研发或作为提供细胞用于细胞替代治疗的手段。为了生成iPS细胞，在皮肤穿刺活检后分离成纤维细胞(图1). 在成纤维细胞扩张后，存在多种方法来生成iPS系。最初报道的方法学包括逆转录病毒传递一种由四种转录因子组成的混合物，称为Yamanaka因子，包括oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，这些转录因子足以改变成纤维细胞的表型，并将其重新编程回到干细胞状态[62]. iPS细胞随后可以分化为神经元，从而产生一种新的人类疾病模型。自从首次报道iPS细胞以来，许多研究小组一直致力于利用多达六个因素的不同组合来改进这项技术[60,62–69]. 还研究了各种病毒传递机制，或直接蛋白治疗，以规避对基因组整合和因子沉默的担忧，目前存在使用非整合方案的方法[60,62–70]. 对于重新编程因子组合的适当方案和基因转移方法，仍存在一些担忧；然而，iPS技术在人类疾病建模和药物发现方面进展迅速。

最近从包括亨廷顿病在内的多种神经退行性疾病患者中建立了诱导多能干细胞系[71]、帕金森氏病[72]和Freidreich共济失调[73]以及ALS[74]和SMA[75]患者。迪莫斯等。描述了2008年一名82岁ALS患者产生的第一批iPS细胞[74]. 患者表现出一种罕见的缓慢进展的疾病，临床症状明显。这项研究表明，年龄和疾病状态都不会影响iPS细胞的生成能力。他们进一步表明，iPS细胞可以产生运动神经元，但并没有对运动神经元的ALS疾病特征进行额外评估。一年后，来自SMA患者的第一批iPS细胞被描述为来自I型SMA患者的iPS细胞，这是一种快速发展的婴儿型SMA[75]. 这项研究揭示了SMA iPS细胞作为一种新型疾病模型的威力，展示了SMA的多种特征，包括SMN1转录水平降低和运动神经元蛋白选择性减少。此外，这些SMA iPS细胞对增加SMN水平的药物治疗产生反应，从而验证了运动神经元疾病药物发现的iPS平台。基于使用SMA iPS细胞系的这些发现，该领域正准备进行新的药物研发工作，以确定ALS和SMA急需的治疗方法。

虽然iPS细胞对于疾病建模和潜在的自体治疗来说是一个令人兴奋的发展，但对于这种新技术，需要考虑一些警告。iPS与ES细胞的真正等效性仍在研究中，而基因组分析已证明某些细胞系具有高度相似的特征[76]，某些线路似乎只进行了部分重新编程。这一点非常重要，因为许多品系仅针对其形态外观进行了描述，而对其分化为胚层的能力进行了最低限度的描述。不同品系之间神经元分化的效率和可变性也存在差异，这使得品系选择成为建模和治疗研究的重要考虑因素[77]. 其他潜在问题，如遗传稳定性、点突变、Yamanaka因子插入位点、不完全转基因沉默和全球表观遗传修饰，突出表明需要对单个细胞系进行全面表征，以进一步推动该领域的发展[67,78–82].

干细胞对运动神经元疾病的疗效

干细胞对ALS的疗效

最近，一些研究探讨了干细胞调节ALS疾病进展的潜力(表1). 已对内源性NPC以及MSC和NPC的直接脊髓注射进行了检测，以了解其提供细胞保护、生长因子传递和细胞增强的潜力。MSC为ALS的自体细胞替代治疗提供了一个容易获得的来源。在ALS啮齿类动物模型中系统输送和鞘内注射MSCs表明，少量细胞整合到脊髓中[83–86]. 这些MSC的特征表明它们能够分化为神经元和星形胶质细胞[83,84,87]. 此外，在SOD1-G93A小鼠中移植MSC可延缓疾病进展和运动神经元丢失，并延长寿命[16,83,84,86–88]. NPC对ALS的疗效也进行了广泛研究。在ALS进展过程中，位于中央管出口旁的内源性NPC数量停止、增殖并迁移至脊髓腹角[89]. 虽然这一事件为患病的脊髓提供了支持和细胞，但很可能没有足够的细胞来为疾病的发展提供有效的防御。然而，将外源性干细胞直接植入病脊髓可能对疾病产生最大影响。研究表明，来源于人类NPC的星形胶质细胞有能力保护SOD1-G93A大鼠的运动神经元免受退化[90]和来自人类NPC的神经元，以防止运动神经元退化并延长生存期[4,10]. 直接移植到SOD1-G93A大鼠脊髓腹角的NPC可延迟疾病发作7天，延长寿命11天[4]. NPC在脑脊液和脊髓中产生可检测到的生长因子-胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和脑源性神经生长因子（BDNF）。此外，进一步的表征表明，NPC移植到脊髓并与α运动神经元形成对称的突触，并观察到宿主和移植神经元之间的跨神经元传递，显示了功能性神经回路[91].

表1

干细胞技术在运动神经元疾病中的应用。

单元格类型模型结果裁判。
物种类型修改物种遗传的
修改		交付；治疗年龄疾病
攻击		生存
增加		其他注释
肌萎缩性脊髓侧索硬化症
鼠标锿MN差异化老鼠SOD1-G93A标准直接脊柱植入；10周无无移植细胞在末期丢失[115]
鼠标BM公司不适用鼠标钠1-G93A腹腔注射；4周延迟13天MN保护；神经元分化及其对非神经元组织的贡献[83]
鼠标BM公司绿色荧光蛋白标签鼠标SOD1-G93A标准骨髓移植；12周无约10天无MN保护；脊髓内GFP阳性细胞；向胶质细胞分化；无神经元分化[86]
鼠标BM公司Lin-c-kit+特定细胞鼠标SOD1-G93A标准静脉注射；70天延迟4天17天MN保护，进展缓慢；神经分化[84]
鼠标NPC公司Le+CX+特定细胞鼠标SOD1-G93A标准直接脊柱植入；70天延迟23天MN保护；神经分化[116]
老鼠主要NPCGFP公司老鼠SOD1-G93A标准静脉注射；14、26周不适用不适用鼻咽癌向中枢神经系统的迁移和分化[85]
老鼠玻璃钢不适用老鼠SOD1-G93A标准直接脊柱植入；90天无17天MN保护；星形胶质细胞分化；小胶质细胞减少[16]
人类UBC公司不适用鼠标SOD1-G93A标准静脉注射；7-8周延迟各种存活率的剂量依赖性变化；细胞因子调节[88]
人类UBC公司不适用鼠标SOD1-G93A标准静脉注射；66天延迟2-3周迁移到中枢神经系统；神经分化[87]
人类UBC公司VEGF、FGF2鼠标SOD1-G93A标准逆转录注射；24-28周不适用不适用迁移到CNS；向混合细胞和星形胶质细胞分化[117]
人类移动交换中心GDNF生产老鼠SOD1-G93A标准肌内移植；80天无28天MN对脊髓的保护和NMJ的完整性[93]
人类移动交换中心源自ALS患者鼠标SOD1-G93A标准枕大池注射；60天无7天存活率的剂量依赖性影响；进展缓慢[118]
人类NPC公司VEGF生成鼠标SOD1-G93A标准鞘内注射；70天延迟12天凋亡途径的调控[119]
人类NPC公司BDNF、IGF-I、VEGF、NT-3、GDNF鼠标SOD1-G93A标准枕大池注射；75天无无星形胶质细胞分化和产生GDNF或IGF-I对MN的保护作用[92]
人类NPC公司不适用老鼠SOD1-G93A标准直接脊柱植入；62天延迟10天神经分化，MN保护、延缓进展、生长因子产生[4]
人类NPC公司不适用老鼠SOD1-G93A标准直接脊柱植入；56天不适用不适用移植物与宿主之间突触联系的整合与形成[91]
人类NPC公司GDNF生产老鼠SOD1-G93A标准直接脊柱植入术；90/100天无无[120]
人类NPC公司GDNF生产老鼠SOD1-G93A标准直接脊柱植入；70天无无MN保护[90]
斯马
鼠标锿GFP、NPC分化鼠标Smn公司−/− SMN2型+/+SMN公司Δ7+/+鞘内注射；1天不适用6.75–8.17天神经（包括MN）和星形胶质细胞分化、MN和NMJ保护、生长因子生成、轴突向腹根的投射[95]
鼠标锿HB9-GFP、ALDH你好子系统控制器洛特定的神经“启动”鼠标Smn公司−/− SMN2型+/+SMN公司Δ7+/+鞘内注射；1天不适用5.12天神经（包括MN）和星形胶质细胞分化，MN和NMJ保护。生长因子生产[94]

肌萎缩侧索硬化症；BDNF：骨源性神经营养因子；BM：骨髓；GDNF：胶质源性神经营养因子；GFP：绿色荧光蛋白；GRP：胶质限制前体；ES：胚胎干；MN：运动神经元；MSC：间充质干细胞；不适用：不适用；NMJ：神经肌肉接头；NPC：神经祖细胞；NT：神经营养素；UBC：脐带细胞。

鉴于细胞和营养干预的结合在ALS模型系统中提供了额外的益处，也对旨在产生增加水平的生长因子的细胞治疗的功效进行了研究。来自人类皮质组织的NPC的保护作用已被检测，这些NPC被设计成产生更多的GDNF，主要在分化时产生星形胶质细胞，以保护ALS大鼠的运动神经元[90]. 虽然非工程化细胞不能提供保护，但GDNF的产生丰富了脊髓环境，并保护运动神经元免受细胞死亡。然而，神经肌肉接触仍在消失，疾病的发病率和生存率没有改善。另一项研究也支持将产生GDNF或IGF-I的人类NPC移植到SOD1-G93A小鼠中，并证明运动神经元丢失减弱，但不影响总体存活率[92]. 然而，为了解决远端介入的可能性，铃木等。利用人MSCs作为穿梭器向SOD1-G93A大鼠的神经肌肉接触传递GDNF[93]. 他们证明，GDNF传递到肌肉可以维持神经肌肉接触，这不仅可以提高运动神经元的存活率，还可以延长长达28天的寿命。总的来说，这些结果支持了对ALS进行细胞和轴突运动神经元治疗的必要性，并为干细胞治疗ALS的潜在疗效提供了证据。

SMA的干细胞功效

最近研究了干细胞治疗SMA的潜力(表1). 检测小鼠ES细胞衍生NPC对SMA疾病进展的疗效[94,95]. ES细胞被预分化为NPC和运动神经元祖细胞，并整合到SMN2型热重（tg）/Smn公司−/−/SMN公司Δ7+/+鞘内注射后的SMA小鼠。整合的NPC产生一系列生长因子，包括GDNF、BDNF、TGF-α和神经营养素-3。雕刻动物的寿命增加了39%，这与体重和握力的提高、运动神经元和肌肉的减少以及神经肌肉接触的保持相一致。考虑到干细胞在脊髓中整合和成熟的时间很短，它们产生如此巨大的效果有点令人惊讶。这些有希望的结果预示着干细胞疗法可以推广到大型动物，最终推广到人类。

当细胞治疗可以在疾病过程的早期实施时，干细胞干预运动神经元疾病最有可能提供支持。支持现有的运动神经元可能是阻止或减少疾病进展的最关键组成部分。2009年，加利福尼亚干细胞公司（美国加利福尼亚州）宣布完成与FDA的IND前会议，以进行第一/二期试验，注射人类ES细胞衍生的人类级运动神经元，作为SMA的治疗。ES-derived运动神经元被提议通过细胞替换和肌肉神经支配来缓解疾病，这种效果在年轻患者中可能更可行，并通过细胞支持。SMA的任何潜在干细胞治疗在运动神经元替代方面都面临与ALS类似的问题；然而，神经元支持结合SMN2上调可能为治疗发展提供有效途径。鉴于疾病的遗传背景，干细胞和基因治疗相结合的治疗可能会增强干细胞功能，提高治疗效果。

将干细胞疗法从工作台转化为床边

鉴于在体外和体内数据支持NPC保护ALS和SMA运动神经元的有益性质，我们正处于这两种疾病新细胞疗法开发的尖端。但从工作台到床边获取神经保护干细胞需要什么呢？在这里，我们描述了实现这一飞跃所需的步骤。

细胞移植治疗的障碍

虽然有大量数据支持细胞替代疗法在运动神经元疾病中的潜在疗效，但在设计试验并将治疗方法应用于患者之前，必须考虑某些问题[96–98]. 选择适当的细胞类型对于实现预期的神经保护效果至关重要；适当数量的细胞必须是可获得和可用的，并且它们必须表现出预期的特征，以提供神经保护，同时避免潜在的肿瘤形成。此外，必须在移植的微环境中检查与细胞移植存活有关的问题，以及免疫排斥的可能性。尽管MSCs和iPS细胞等一些移植选择涉及自体细胞的使用，并可能规避排斥的可能性，但免疫抑制必须用于大多数细胞移植治疗选择，以防止细胞排斥。最后，必须仔细注意神经系统内细胞递送的技术方面，以避免不良反应和手术并发症。

支持数据和理由

人类NPC目前正在ALS患者的一期安全试验中使用。NPC来源于选择性流产后捐赠的单个胎儿。解剖出脊髓的上胸椎区域，并扩大细胞以提供人类脊髓干细胞（HSSC）。这些HSSC已被证明能有效促进脊髓缺血损伤后大鼠运动功能的恢复[99]并提高SOD1-G93A大鼠20天的存活率[4]. 大约70%注射到脊髓腹角的HSSC属于神经谱系，并表达谷氨酸能和GABA能神经递质标记物[100]. 此外，还对一种大型动物哥廷根-明尼苏达小型猪的程序和HSSC安全性进行了评估[98,101]. 使用小型猪，将30000个细胞/2-6µl的剂量注射到脊髓中，经测定，其耐受性良好。利用一种创新的设备将细胞输送到脊髓中，该设备旨在输送HSSC，降低手术复杂性，同时提供先进的安全性和准确性[98,102].

这些和其他支持的令人鼓舞的结果在体外和体内研究为首次在ALS患者中进行HSSC转化试验提供了理论基础。目前的试验是一项I期试验，其总体目标是验证直接脊髓内移植干细胞治疗ALS的可行性和安全性。虽然脊髓内注射的安全性和HSSC移植的毒性检查是当前试验的主要目标，但该方法的验证将为进一步研究ALS干细胞移植治疗的转化效率铺平道路，以及潜在的其他运动神经元和神经疾病。基于支持性研究，我们假设植入细胞将通过直接细胞支持，作为神经营养支持的来源，并通过为剩余运动神经元维持合适的脊髓微环境，为ALS患者的病变运动神经元提供神经保护(图2B).

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肌萎缩侧索硬化症患者脊髓内移植人脊髓干细胞的临床试验设计

（A）肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者将接受单侧或双侧人脊髓干细胞注射，用于脊髓的腰椎或颈椎扩大（箭头所示）。（B）ALS患者移植细胞的神经保护机制。当ALS患者脊髓中正常存在的运动神经元开始退化时，注射的人类脊髓干细胞被假设整合到脊髓中，以提供细胞支持源，维持脊髓内健康的微环境，并为其余运动神经元提供神经营养支持。（C）该试验将遵循“风险升级”范式，这反映了不同队列之间风险的逐渐增加。ALS患者根据行走能力、注射次数（单侧与双侧）和注射位置（腰椎[L]与颈椎[C]）分为A–E组。

试验设计和手术程序

总共有18名患有不同程度疾病的ALS患者将接受单侧或双侧HSSC注射到腰椎腹角或脊髓颈膨大处(图2A). 根据我们称之为“风险升级”的范式，患者被分为五组（A-E组），随着试验的进展，该范式在患者风险方面保持最保守的路径(图2C). 受试者接受手术接受HSSC的直接椎管内移植，遵循基于大型动物和人类数据的集体结果的仔细优化方案[98,101,103–107]. 简单地说，手术过程包括椎板切除、安装我们小组设计的创新器械以稳定注射装置、控制HSSC注射，然后进行有计划的术后恢复和评估。目前，前12名患者已获得FDA批准，随着后续受试者继续出现无严重不良反应，试验组的进展将继续。

结果和期望

迄今为止，前八名患者已成功接受了椎管内HSSC移植。A组的前六名患者在非燃烧状态下，没有出现与移植相关的感觉或剩余运动功能丧失。同样，B组的两名患者没有出现手术的任何主要不良反应，并保持了行走能力。这些结果是有希望的，并支持程序技术和脊髓内细胞移植的安全性。虽然随着该领域的发展，仍有许多问题有待解决，但我们乐观地认为，通过试验组的进展和试验的成功完成，将有助于利用细胞移植提高ALS的疗效。

未来展望

随着干细胞生物学的最新进展，我们准备安全而迅速地转向神经退行性疾病的细胞疗法。通过产生患者特异性iPS细胞来开发新的人类疾病模型，将使我们能够更紧密地将细胞功能障碍与疾病机制联系起来。鉴于多种复杂机制可能导致ALS的疾病进展，对单个患者iPS细胞进行比较可能会揭示疾病的分级目标或细分，这些目标或细分可用于药物开发。此外，ALS中MSC的安全性试验已经完成[108]随着使用不同细胞系的进一步安全性试验的完成，我们将开始提取干细胞疗法的哪些成分对针对疾病的不同方面最有利。鉴于我们对肌萎缩侧索硬化运动神经元丢失的复杂机制和后果的了解，结合其他因子或试剂和细胞鸡尾酒，包括容易产生神经胶质细胞和神经元的神经胶质细胞，可能会产生最大疗效。我们还必须考虑在脊柱治疗的同时进行系统治疗，以维持神经肌肉接触，因为这两者对更全面有效的治疗至关重要。最后，我们必须开发更好的干细胞监测和可视化方法就地充分了解人体内部的长期影响。随着对运动神经元疾病细胞移植过程的深入了解，我们将开发简化的转化干细胞治疗方法。

目前正在进行的人类干细胞治疗的动物模型和安全性试验取得了令人信服的结果，推动了将干细胞疗法从试验台转移到床边治疗多种神经退行性疾病的努力。虽然目前的综述讨论了专门用于运动神经元疾病的干细胞疗法的发展，但应注意的是，所讨论的原则也延伸到了其他神经疾病和疾病干细胞治疗的发展。干细胞技术在神经退行性疾病方面的进展已在别处综述[61,109,110]干细胞已被广泛研究用于阿尔茨海默病、多发性硬化症、帕金森病和脊髓损伤[111–113]. 在所有情况下，细胞都会影响上述三个基本原理：替换丢失的细胞，增强和支持细胞，或丰富细胞微环境。事实上，ES-derived少突胶质细胞目前正在用于脊髓损伤的人体试验，其中提出的机制包括细胞替换和环境富集以促进神经元生长[114]. 总的来说，我们在将干细胞疗法从实验台转化为运动神经元疾病患者方面取得了长足进展，针对多种疾病的细胞移植技术领域有望继续进步。

执行摘要

干细胞：正确工作的正确工具

  • ▪
    单个干细胞系可能具有不同的先天支持能力，生长因子的产生可能对其功能至关重要。
  • ▪
    干细胞治疗的优势在于它能够在单一治疗中对抗疾病治疗的多个方面。

运动神经元疾病机制的探讨

  • ▪
    肌萎缩侧索硬化症（ALS）疾病表型复杂，运动神经元丢失可能是多种机制作用的结果，包括神经营养支持丧失和胶质细胞功能障碍。
  • ▪
    在脊髓性肌萎缩中，运动神经元丢失与存活运动神经元（SMN）1蛋白水平的显著降低相关，而存活运动神经元1蛋白水平可能通过改变代偿性SMN2表达水平而恢复。
  • ▪
    诱导的多能干细胞提供了一个系统，可以以特定于患者的方式检查疾病机制和测试潜在的治疗方法。

干细胞对运动神经元疾病的疗效

  • ▪
    治疗ALS的系统方法可能需要同时维持脊髓和神经肌肉接头。
  • ▪
    干细胞治疗结合基因治疗上调SMN2蛋白水平可能为脊髓性肌萎缩提供细胞支持。

将干细胞治疗从工作台转移到床边

  • ▪
    体外和体内数据支持干细胞治疗ALS的功效，大型动物和人类的数据为人类脊髓干细胞移植提供了一种创新手段。
  • ▪
    目前正在进行一项一期试验，以检验将人类脊髓干细胞直接脊髓内移植到ALS患者脊髓中的可行性和安全性。
  • ▪
    迄今为止，初步患者组的结果是有希望的，随着持续的成功，该试验为干细胞疗法转化为运动神经元疾病和其他神经退行性疾病铺平了道路。

鸣谢

我们感谢M Marsala、M Hefferan、J Riley、B Raore和J Taub为本试验的临床前研究提供的技术援助，并感谢K Johe和当前试验的数据安全监测委员会的宝贵投入。我们感谢M Polak和C Kelly的临床协助和临床数据收集。我们感谢埃默里肌萎缩侧索硬化中心、患者和家属的参与。

临床前研究部分由A Alfred Taubman医学研究所、肌萎缩侧索硬化协会和Neuralstem，Inc.资助。SA Sakowski由NIH支持（T32 NS00722-28）。

脚注

财务和竞争利益披露

除已披露的内容外，作者与与手稿中讨论的主题或材料存在财务利益或财务冲突的任何组织或实体没有其他相关关联或财务参与。

在这份手稿的制作过程中没有使用任何写作辅助。

NM Boulis是能够安全准确地注射人类脊髓的设备的发明者。NeuralStem，Inc.已购买此技术的独家许可证。NM Boulis收到了发明人的这部分费用，并有权获得该技术分销的特许权使用费。

参考文献

特别值得注意的论文被强调为：

▪ 感兴趣的

▪▪ 有相当大的兴趣

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