SPARC介导心肌梗死后早期细胞外基质重塑

摘要

基质细胞蛋白是细胞外基质（ECM）成分起辅助作用，但不是结构作用，以改变细胞与ECM的相互作用(12). 分泌的酸性富含半胱氨酸的蛋白质（SPARC、骨连接蛋白、BM40）是一种胶原结合的基质细胞蛋白，在成纤维细胞和内皮细胞中强烈表达，在心肌细胞中低水平表达。此外，也有报道称SPARC表达与α-平滑肌肌动蛋白阳性肌成纤维细胞和CD45阳性白细胞相关。SPARC刺激多种细胞类型的细胞信号传导、粘附、存活、增殖和迁移(4,14). SPARC调节合成后的前胶原加工和组装成纤维，除了涉及转录或降解的机制外，还为胶原沉积提供第三层调节(14).

β肾上腺素能受体刺激大鼠心脏SPARC水平升高(11)左心室肥厚患者的左心室(15). Bradshaw等人(三)有报道称，SPARC缺失可减弱压力过负荷诱导的胶原积聚，从而改善舒张功能。

Schellings等人(16)研究表明，由于前14天内破裂和心力衰竭的发生率增加，SPARC缺失导致心肌梗死后死亡率增加四倍。破裂发生率增加与成熟胶原纤维沉积减少有关。此外，在SPARC阴性小鼠中输注转化生长因子-β（TGF-β）第2天心肌梗死前破裂率降低，胶原沉积增加。同时，输注TGF-β并未改变梗死愈合，表明SPARC通过TGF-α依赖和独立的途径发挥作用。然而，SPARC在MI后早期设置中的角色尚未定义。在本研究中，我们评估了SPARC阴性小鼠的早期心肌梗死反应，以分离重塑中关键的SPARC依赖性功能，并探讨SPARC缺失改变心肌成纤维细胞对心肌梗死的反应这一假设，这可能有助于更全面地了解导致心肌梗死相关心脏破裂发生率较高的因素。

材料和方法

所有动物程序均按照实验动物护理和使用指南（美国国家卫生研究院第85-23号出版物，1996年修订），并经南卡罗来纳医科大学动物护理和使用委员会机构和圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心批准。

结果

存活率、超声心动图和尸检分析。

通过免疫印迹法，在WT小鼠的梗死区，SPARC蛋白水平在第3天(图1). WT心肌梗死后3天的存活率为96%(n个=1只小鼠死亡）和86%的SPARC无效小鼠(n个=4只小鼠死亡；P（P）=0.37，按费希尔精确计算t吨-测试）。1例无效死亡可归因于破裂，1例WT和3例无效死亡归因于心律失常或急性充血性心力衰竭。

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图1。

左心室（LV）分泌的酸性和富含半胱氨酸（SPARC）的蛋白质水平在第3天心肌梗死后（MI）。顶部：代表性免疫印迹图像。底部：野生型（WT）量化第0天(n个=12），重量第3天远程（LVC；n个=11）和重量第3天梗死（LVI）；n个=11).左侧：可溶部分。赖特：不溶性部分*P（P）<0.05与对照组第0天.^#P（P）与远程LVC相比<0.05。

WT和无效小鼠的超声心动图、尸检和梗死面积分析如图所示表1.第0天以幼稚WT和空白小鼠作为对照。与基线时年龄匹配的WT小鼠相比，SPARC阴性小鼠体重减轻。心梗后WT组和无心梗组与各自组相比均显示扩张增加第0天控制；然而，与WT MI后组相比，MI后空白小鼠的扩张增加减弱。同样，两个心肌梗死组的射血分数均下降，与WT心肌梗死后组相比，无心肌梗死后小鼠射血分数的下降减弱。射血分数的提高表明SPARC阴性小鼠在第3天MI后与WT相比第3天MI后。

表1。

超声心动图和尸检结果

	野生型		SPARC空
超声心动图
	第0天	第3天医疗保险	第0天	第3天医疗保险
样本大小，n个	28	22	20	25
心率，心跳/分钟	465 ± 9	494 ± 11	445 ± 9	452 ± 7‡
乳末容积，ml	45 ± 2	83 ± 5*	39 ± 3	63 ± 5†‡
收缩末期容积，ml	20 ± 2	67 ± 4*	14 ± 2	46 ± 4†‡
喷射分数，%	57 ± 2	19 ± 1*	65 ± 2*	28±2†‡
中风量，ml	25 ± 1	16 ± 2*	25 ± 2	16 ± 1†
游离壁（梗死）壁厚（收缩），mm	1.05 ± 0.03	0.54 ± 0.04*	1.02±0.05	0.56±0.04†
舒张末期半径至梗死壁厚度，mm/mm	2.55 ± 0.05	4.34 ± 0.20*	2.33 ± 0.08	3.90 ± 0.21†
尸检
	第0天控制	第3天医疗保险	第0天控制	第3天医疗保险
体重，克	25.1 ± 0.7	22.7 ± 1.1*	20.1 ± 0.6*	18.0 ± 0.7‡
LV质量，mg	86 ± 3	102 ± 4*	67 ± 2*	86 ± 3†‡
LV至BW，mg/g	3.4 ± 0.1	4.8 ± 0.1*	3.4 ± 0.1	4.8 ± 0.1†
肺湿重至体重mg/g	5.0 ± 0.1	9.3 ± 0.7*	5.0 ± 0.2	8.3 ± 0.7†
肺干重与体重之比，mg/g	1.1 ± 0.1	2.0 ± 0.2*	1.2 ± 0.1	1.8 ± 0.2
梗死面积，%		52 ± 2		47 ± 2

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数据为平均值±SE.SPARC，分泌蛋白，酸性，富含半胱氨酸；LV，左心室；BW，体重；心肌梗死。

^*P（P）<0.05与野生型第0天控制；

^†P（P）<0.05 vs.零第0天控制；

^‡P（P）<0.05与野生型第3天惯性矩。

心肌梗死后WT组和无心肌梗死组的LV质量体重比均增加，心肌梗死组之间无差异。与WT MI相比，空MI的肺湿重/体湿比降低，表明空小鼠在MI后水肿较少。两组之间的壁变薄和梗死面积相似，表明功能反应不是由于损伤严重程度的初始差异造成的。

形态分析。

我们测量了苏木精和伊红染色切片的外周和心肌细胞横截面积(图2). WT-MI组的LV与无LV相比扩张增加，与超声心动图检查结果一致。肌细胞横截面积为137±5μm²对于WT第0天(n个=28）并增加到169±4μm²对于WT第3天(n个=22;P（P）< 0.05). 同样，心肌细胞面积为132±6μm²对于null第0天(n个=20）并增加至163±3μm²对于null第3天(n个=25;P（P）< 0.05). 补偿性肥大反应在无效小鼠中表现正常，与SPARC无效小鼠压力超负荷诱导的肥大研究结果一致(三). 巨噬细胞通过Mac-3免疫组化进行定量。梗死区WT巨噬细胞水平为2.22±0.17%(n个=22），梗死区的零巨噬细胞水平为2.47±0.15%(n个=24;P（P）=NS）。

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图2。

SPARC缺失减弱左室舒张第3天MI后。A类：来自WT和SPARC null的苏木精和伊红染色切片的代表性显微照片第0天和第3天心肌梗死后左心室。B类：外周长的量化，表明缺乏SPARC会减弱第3天MI后。样本大小为n个=28（WT）第0天,n个=22（WT）第3天,n个=20表示空第0天、和n个=25表示空第3天. *P（P）与对照组相比<0.05（WT或零第0天).⁺P（P）<0.05与WT第3天.

成纤维细胞ECM基因阵列。

除了SPARC（在空白小鼠中不存在）外，有22个基因编码ECM和粘附分子，它们在分离自第0天以及远隔和梗死区第3天MI后LV。表2总结了22个具有统计意义的变化。有趣的是，从两组患者的远端和梗死区分离的成纤维细胞显示出相似的表达模式，表明这两个区域的成纤维纤维细胞在单个细胞水平上具有相似的ECM和粘附分子反应。

表2。

WT和SPARC阴性心脏成纤维细胞间ECM基因的差异表达

	与WT相比第0天		与Null比较第0天
基因	WT LVC	WT等级	无效的第0天	零LVC	零LVI
亚当斯2				↓	↓
镉2				↓	↓
Vcam1型	↓	↓	↓
百万3	↓	↓	↓
高级证书				↓	↓
Ctnb1号机组				↓	↓
伊特加夫			↑
Tgfb1型				↑
伊特加姆	↑
第4a1列			↑	↓	↓
Itgb1号机组			↑	↓	↓
第4a2列					↓
Fn1型			↑	↓	↓
倾倒2			↑	↓	↓
亚当斯5				↓	↓
喇嘛2	↓	↓		↓	↓
拉姆1			↑	↓
发布			↑	↓	↓
伊特加3			↑	↓
第3a1列			↑
CCN 2（CTGF）					↓
CD-31（PECAM-1）	↓	↓	↓

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野生型；LVI和LVC，左室梗死区和非梗死区；结缔组织生长因子；血小板内皮细胞粘附分子-1。箭头指示在P（P）所列组<0.05。

在SPARC中为空第0天成纤维细胞ECM基因阵列、MMP-3、VCAM1和CD31（PECAM-1）水平降低，而Col3a1、Col4a1、Fn1、Lamc1、Postn、TIMP-2和一些整合素（α_三, α_v（v）、和β₁)与WT中的基因表达水平相比升高第0天成纤维细胞。我们得出结论，这些基因的调控受SPARC缺失的影响。

我们在屏幕上测量了胶原蛋白Iα1、IIα1、IIIα1、IVα1、IVα2、IVα3、Vα1和VIα1。在这些胶原蛋白亚型中，IIIα1和IVα1胶原蛋白是组间唯一存在统计差异的胶原蛋白。WT心肌梗死后成纤维细胞中III型胶原mRNA水平实际上降低，而IV型胶原mRNA水平升高。心肌梗死后原代小鼠成纤维细胞中III型胶原和IV型胶原水平均降低。事实上，SPARC缺失伴随着胶原蛋白表达的减少，这可能对以后的瘢痕形成产生负面影响。

通过路径分析，出现了六种变化模式(图3B类)从成纤维细胞ECM基因阵列结果中得出以下结论：1)SPARC除了调节沉积外，还调节胶原蛋白的生成（尤其是胶原蛋白III和IV）；2)SPARC影响其他ECM基因的表达，尤其是纤维连接蛋白和骨膜蛋白，这在心脏成纤维细胞中以前没有报道过；三)SPARC以不同的模式调节不同的ECM基因，我们可以看到六种不同的变化模式；和4)CD31（PECAM-1）、III型胶原和CCN2（结缔组织生长因子（CTGF））可能由SPARC间接调节，因为通路分析显示这些基因在该簇中整合最少(图3A类). 基于阵列分析中发现的基因差异表达，我们通过免疫印迹法测量心肌组织TIMP-2、纤维连接蛋白、CTGF和MMP-3的水平(图4).

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图3。

A类：心脏成纤维细胞ECM基因阵列基因水平的聚类树状图显示。结果根据ΔΔCt方法进行分析，将原始数据归一化为三个管家基因（Gusb、Hprt1和Hsp90ab1），并以2个基因的对数比报告^-ΔCt值。心脏成纤维细胞分离自第0天对照组和远端（LVC）和梗死（LVI）区域第3天来自WT和空白小鼠的MI样本。在评估的84个细胞外基质和粘附分子基因中，有22个基因在组间通过ANOVA分析存在统计差异，并将其用于聚类分析。Genespring GX 11.0制作了树状图和彩色图像。色标范围从对数比−6.9及以下的蓝色到对数比6.9及以上的红色。每个基因由一行彩色方框表示。每个组织由一列表示。B类：LVC和LVI中的基因水平标准化为第0天控制值并根据6个图案绘制。顶部：每个部分的WT级别。底部：空级别。样本大小为n个=WT为4第0天,n个=WT为6第3天远程LVC，n个=WT为3第3天梗死LVI，n个=7表示空第0天,n个=6表示空第3天远程LVC，以及n个=5表示空第3天梗死LVI。

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图4。

通过免疫印迹法测定心肌纤维连接蛋白、CCN2[结缔组织生长因子（CTGF）]和基质金属蛋白酶-3（MMP-3）的水平。左侧：可溶性分数水平。赖特：不溶性分数水平。A类：WT LV梗死区的可溶性纤维连接蛋白水平增加了5倍，而这种增加在空白区减弱。WT小鼠梗死区的不溶性纤维连接蛋白水平也增加。空白小鼠体内的第0天控件与WT控件进行比较。B类：WT LV远端和梗死区的可溶性CCN2（CTGF）水平均增加，而零区的CTGF水平在第0天以及偏远地区。WT小鼠梗死区的不溶性CTGF水平也增加，而空白小鼠仅在第0天对照组。C类：WT和空白小鼠梗死区的可溶性活性MMP-3水平均降低。有趣的是，活性MMP-3水平在空区最高第0天控制时间点。与空白小鼠相比，空白小鼠梗死区的不溶性活性MMP-3减少第0天值。样本大小为n个WT=12第0天,n个WT=11第3天LVC、，n个WT=11第3天LVI、，n个=11表示空第0天,n个=9表示空第3天LVC，以及n个=9表示空第3天LVI*P（P）与对照组相比<0.05（WT或零第0天).⁺P（P）<0.05 vs.同一时间点的WT。^#P（P）<0.05 vs.在同一时间点远程。

MI后LV组织的免疫印迹。

各组LV组织中TIMP-2蛋白水平没有差异，这与远端和梗死成纤维细胞中mRNA水平的变化形成对比。TIMP-2的标准化密度测定值为119±14 U（WT）第0天控件(n个=12），WT LVC远程区域128±10 U(n个=11），WT LVI梗死区143±13 U(n个=11），125±14 U为零第0天控件(n个=11），对于零LVC远程区域为105±12 U(n个=9），LVI梗死区为95±20 U(n个=9;P（P）=NS）。

与WT梗死区相比，SPARC阴性梗死区的可溶性纤维连接蛋白水平较低(图4A类). 虽然两个梗死区域的水平与第0天在没有SPARC的情况下，响应变钝。在空白心脏中，不溶性纤维连接蛋白在基线时较高，这与SPARC空白成纤维细胞中检测到的基因表达高于取自第0天心脏(表2和图3). 这些结果表明，除了影响胶原蛋白的表达和沉积外，SPARC还可能在心肌梗死后纤维连接蛋白的调节中发挥重要作用。

与心肌梗死后WT心脏的远端水平相比，心肌梗死后SPARC空心的远端CTGF水平较高(图4B类). 尽管心肌梗死后WT心脏的CTGF水平显著且呈线性增加第0天在空白小鼠的偏远区域，发现CTGF基因表达高于WT。事实上，WT成纤维细胞在MI后没有显示CTGF表达增加，这表明CTGF的主要来源是体内存在的另一种细胞类型，例如巨噬细胞。在不溶性部分，WT梗死区的CTGF水平升高，但LV梗死区CTGF不升高。SPARC梗死区心肌梗死后CTGF的水平没有增加，这可能导致心肌梗死后后期观察到的心肌破裂。

WT和无梗死LV中MMP-3水平下降，与成纤维细胞中发现的基因表达下降一致(图4C类). 在成纤维细胞中，MMP-3基因水平显著低于空白第0天与WT相比第0天细胞；然而，LV的样本第0天与WT LV组织相比，空白LV组织中活性MMP-3水平增加。MMP-3是几种MMP的上游激活物，包括MMP-9(13). 因此，在没有SPARC的情况下，基线ECM周转率可能更高，而心肌梗死后MMP-3的减少预计有利于ECM在第3天.

由于SPARC已被证明与MMP-9相关，并且在空白小鼠的心脏成纤维细胞和LV组织中发现MMP-3水平发生改变，因此我们也测量了MMP-9的水平。MMP-9在梗死区升高，但WT组和空白组之间的水平无差异(P（P）=NS）。

为了确定SPARC缺失是否影响心肌梗死后成纤维细胞和内皮细胞的反应，我们测量了α-平滑肌肌动蛋白、hsp-47、骨膜抑素和TGF-β的成纤维细胞激活标记物和CD31（PECAM-1；内皮细胞数量）。各组间α-平滑肌肌动蛋白和TGF-β的水平没有变化，表明心肌梗死后3天的时间点在暴发性成纤维细胞激活之前。WT小鼠梗死区hsp-47和CD31水平降低，但不降低(图5)表明SPARC缺失会减弱ECM和血管生成反应的早期减少。在WT中，骨蛋白酶水平从9044±586 U增加第0天WT中12922±585和15191±768 U的样品第3天心肌梗死后远端和梗死区（两者P（P）< 0.05). 骨蛋白酶同样增加了SPARC阴性小鼠心肌梗死后的LV，从10514±712 U增加到第0天控制到14009±794和15328±759 U为空第3天心肌梗死后远端和梗死区（两者P（P）< 0.05). 尽管在SPARC阴性的心脏组织中骨膜炎水平呈上升趋势，与SPARC阴性成纤维细胞中的发现类似，但骨膜炎水平的差异并没有达到统计学意义。

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图5。

WT梗死区热休克蛋白（HSP-47）和CD31[血小板内皮细胞粘附分子-1（PECAM-1）]水平降低，但SPARC阴性小鼠在第3天心肌梗死后免疫印迹。A类：对LV提取物的可溶性部分进行Hsp-47印迹。B类：LV提取物的不溶性部分被CD31印迹。对于这两种情况，WT左室梗死区的水平都降低了，而这种降低在无效左室提取物中减弱。样本大小为n个WT=12第0天,n个WT=11第3天LVC、，n个WT=11第3天LVI，n个=11表示空第0天,n个=9表示空第3天LVC，以及n个=9表示空第3天LVI*P（P）与对照组相比<0.05（WT或零第0天).^#P（P）<0.05 vs.在同一时间点远程。

讨论

这项研究的目的是检测SPARC在心肌梗死后早期重塑事件中的作用(16)显示SPARC缺失导致心肌梗死后破裂率增加。我们研究了SPARC基因缺失对心脏成纤维细胞超声心动图参数和ECM合成重建前3天的功能影响。本研究的重要和独特发现是，SPARC阴性小鼠的MI诱导导致1)改善功能性重塑参数，包括射血分数下降减弱和扩张程度减轻；和2)ECM和细胞粘附分子表达方面的成纤维细胞表型改变。这是SPARC在心肌梗死后早期调节成纤维细胞功能的首次证明。

在我们的研究中，SPARC阴性小鼠在第3天心肌梗死后。Schellings等人之前的研究(16)，他们观察到左室功能在第3天MI后WT和SPARC无效小鼠。在我们的实验设计中，有两个关键差异可以解释这种差异。我们的小鼠使用混合背景菌株（C57/BL6和SV129），而Schellings等人的研究中的小鼠使用纯C57/BL六背景。C57/BL6菌株已被证明是一种纤维素酶原菌株(10)，并且报道了不同菌株之间破裂率的差异(8,18). 此外，我们研究中的小鼠年龄为4-6.5个月（相当于30-45岁的人类），而Schellings等人(16)2.5至4.5个月大（相当于20至30岁的人）。因此，菌株和年龄差异可以解释这两项研究中SPARC阴性小鼠心肌梗死反应的轻微差异。进一步研究比较SPARC缺失对不同物种和年龄心肌梗死后重塑的影响是有必要的。特朗贝塔和布拉德肖(17)最近有报道称，SPARC缺失小鼠的牙周韧带老化减弱，表明SPARC缺失情况下MI上叠加的年龄可能会产生不同的结果。鉴于LV破裂在以后普遍存在，确定SPARC的缺失是否会从重塑的早期阳性调节器转变为晚期阴性调节器将是一件有趣的事情。如果是这样的话，这种转变的原因虽然目前尚不清楚，但可能会非常有趣。例如，这些研究可能有助于辨别心肌梗死后早期的心脏功能参数是否预测心脏破裂，或者破裂是否严格由突然的结构衰竭引起。

SPARC缺失改变了心脏成纤维细胞表型。我们的研究结果表明，SPARC的作用可能是通过改变细胞反应来改变重塑动力学，可能是除了直接的ECM作用之外，也可能是独立于ECM作用。在我们的研究中，我们将成纤维细胞活化受损定义为成纤维细胞在心肌梗死后增加ECM生成的能力下降。成纤维细胞CTGF结果表明，SPARC缺失使CTGF脱离MI伤口愈合方程。SPARC缺失被基线时CTGF水平的增加所补偿，这表明基线时胶原合成更高，并通过胶原蛋白IIIα1和IVα1在表2在WT小鼠中，心肌梗死后只需要CTGF，而在SPARC阴性小鼠中，CTGF一直需要。对这种下降的一种解释可能是，由于SPARC阴性小鼠未受损心脏中的胶原蛋白水平降低，但未成功，因此SPARC阴性心脏中的心脏成纤维细胞不断尝试组装更多ECM。高水平的CTGF第0天和远端空成纤维细胞提示胶原和CTGF可能是肌细胞-成纤维细胞相互作用的重要介质(2,9).

偏远地区整合素亚型的转换很有趣。WT小鼠的整合素α增加_米在MI后的偏远区域，而空白小鼠的β₁并降低α₃这一结果与以下事实一致，即心肌梗死后WT和无梗死后巨噬细胞数量没有差异，这与Schellings等人报告的结果一致(16)对于第7天时间点。由第14天，Schellings等人(16)与WT相比，空区的巨噬细胞数量有所减少，表明SPARC可能在心肌梗死后后期调节巨噬细胞活性和慢性免疫反应。

除了改变成纤维细胞反应外，SPARC缺失还可能影响巨噬细胞和内皮细胞反应，这将有助于观察到的重塑表型减弱。SPARC在巨噬细胞和内皮细胞中表达，SPARC与清道夫受体稳定蛋白1相互作用，调节巨噬细胞清除(19). 因此，SPARC缺失可能影响MI环境中的炎症和血管生成反应。CD31水平下降第3天WT左室心肌梗死后，但在缺乏SPARC的情况下，这种下降减弱。这表明SPARC缺失有助于保护梗死区域的血管数量，而不是刺激血管生成反应。需要进一步研究来阐明SPARC在这两种细胞类型中的作用。

综上所述，本研究首次探讨了SPARC在心肌梗死后成纤维细胞ECM生成中的作用。而SPARC的删除导致在第3天心肌梗死后，缺乏SPARC也导致成纤维细胞ECM反应迟钝。因此，根据梗死瘢痕表型，预测SPARC抑制的不同时间会产生不同的结果。

赠款

本研究由国家生物医学成像与生物工程研究所拨款1R03-EB-009496和国家心脏、肺和血液研究所拨款SC2-HL-101430（给Y.Jin）提供支持；国家心脏、肺和血液研究所授予2P01-HL-48788和HL-094517以及退伍军人管理功绩奖（授予a.D.Bradshaw）；国家心脏、肺和血液研究所拨款R01-HL-75360，美国心脏协会AHA 0855119F，以及Max和Minnie Tomerlin Voelcker基金（致M.L.Lindsey）。S.M.McCurdy于2008年获得美国生理学会夏季本科生研究奖学金的资助。

披露

作者未声明任何利益冲突，无论是财务上的还是其他方面的。

参考文献