嘌呤能受体介导的钙离子的重塑²⁺EGF诱导乳腺癌细胞上皮-间充质转化的信号转导

摘要

介绍

上皮-间充质转化（EMT）是一条与肿瘤转移相关的途径。[1]这一过程涉及细胞-细胞和细胞-细胞外基质粘附的降解，以及随后连接蛋白如E-钙粘蛋白的下调[1],[2]细胞经历细胞骨架的重组和III型中间丝波形蛋白的产生[3]这些改变与细胞形态的改变有关，从上皮细胞形态转变为间充质细胞或成纤维细胞样形态[4],[5].

癌细胞依赖于肿瘤微环境的细胞外信号[6]，如表皮生长因子（EGF），可促进乳腺癌细胞迁移[7].戈斯瓦米等 [8]描述了体内旁分泌环，表达集落刺激因子-1（CSF-1）的癌细胞通过旁分泌环招募肿瘤相关巨噬细胞，然后这些巨噬细胞分泌EGF，促进癌细胞的伸长和迁移。体外一些细胞系对EGF刺激进行EMT反应[4]例如人类乳腺癌细胞株MDA-MB-468。

一旦转化为迁移表型，癌细胞将面临一系列新的环境挑战。例如，循环系统和次级肿瘤微环境可能不利于细胞生长和存活。EMT导致的细胞重构，即细胞对循环系统或继发肿瘤部位的药物的反应发生改变，可能有利于转移过程[9],[10].

血管平滑肌细胞发生细胞重塑，其结果是对外界刺激的反应发生改变，从收缩表型转变为增殖表型[11],[12]血管平滑肌细胞转化为增殖表型是血管修复的重要机制，但也可能导致血管疾病[11]血管平滑肌细胞的增殖表型对G蛋白偶联受体活化剂（如血管紧张素II、凝血酶和血管加压素）的反应性质发生改变[13]然而，很少有研究评估在与癌细胞EMT相关的表型转换过程中，细胞表面受体介导的信号是否也发生类似的改变。

许多细胞表面受体，包括一些受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体和配体门控离子通道通过胞浆钙的变化发出信号²⁺浓度。钙是一种重要的细胞内信号分子，调节多种生理和病理过程[14],[15]例如，Ca²⁺-相关蛋白Orai1和STIM1对存储操作的钙进入途径很重要，在乳腺癌细胞迁移和转移中很重要[16].

两种对乳腺癌细胞很重要的外部刺激，可引起细胞内钙²⁺反应是丝氨酸蛋白酶和5′-三磷酸腺苷（ATP）。丝氨酸蛋白酶激活蛋白酶激活受体（PAR）家族的质膜受体[17]PAR2是一种G蛋白偶联受体，在暴露于丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶后经历蛋白水解切割和活化[18]PAR2的激活触发磷脂酶C激活下游的细胞内信号级联，导致IP的产生_三和钙的动员²⁺来自细胞内储存[19]间质样细胞系MDA-MB-231中PAR2沉默[20]抑制细胞迁移[19]凝血蛋白酶VIIa和Xa是PAR2受体的内源性配体；这些凝血蛋白通过PAR2激活刺激人类乳腺癌细胞的迁移[19]ATP还可以通过其对P2X非选择性阳离子通道和P2Y代谢性嘌呤能受体的影响，充当外部旁分泌因子和肿瘤促进剂[21]这些受体的激活导致细胞溶质钙的升高²⁺通过流入（P2X）[22]和存储释放（P2Y）机制[23]在肿瘤环境中，ATP在微摩尔浓度范围内释放[24]ATP通过Ca增加MCF-7人乳腺癌细胞的增殖²⁺-P2Y下游依赖性PI3K/Akt通路₂和/或P2Y₄嘌呤能受体[25].

在这些研究中，我们研究了EGF诱导的EMT是否与受体亚型对外部刺激的重塑有关。细胞内钙的相应变化²⁺信号可能帮助细胞更好地满足与转移相关的需求。

结果

ATP敏感性的变化

如前所述[4]，经EGF（50 ng/mL）处理的MDA-MB-468细胞在24小时后间充质标志物波形蛋白水平升高(图1 A和B)72小时后上皮蛋白E-cadherin逐渐减少(图1B). 我们还评估了EGF（50 ng/mL，24小时）对钙的影响²⁺MDA-MB-468细胞中的信号传导。虽然我们发现胰蛋白酶激活PAR2的效力没有显著差异，但我们确实观察到10倍的统计学显著性(P（P）<0.05）与对照细胞（EC）相比，ATP效力发生变化₅₀分别为1.731µM和0.175µM）(图1C). 这表明EGF可以诱导对某些细胞外刺激（包括ATP）的反应发生特定变化。为了进一步研究这种效应，我们检测了与EGF介导的EMT相关的ATP信号在MDA-MB-468乳腺癌细胞中的差异反应和机制。

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图1

EGF诱导的EMT和受体介导的Ca²⁺发送信号。

如图所示，在用EGF（50 ng/mL）或对照药物治疗24、72或120小时之前，MDA-MB-468乳腺癌细胞处于血清饥饿状态。A类，免疫荧光（IF）图像的代表性面板，显示EGF刺激后（24小时）波形蛋白表达（红色）和DAPI核染色（蓝色）。B类，EGF治疗后E-钙粘蛋白和波形蛋白的代表性免疫印迹（左）和相对于β-肌动蛋白负载对照定量的汇总数据（右）。汇集值代表独立实验中一式三份进行的6口汇集井的平均值±S.D。使用双向ANOVA和Bonferroni后验进行统计分析，*表示P（P）<0.05.C类，[Ca的评估²⁺]_中青旅在用不同浓度的胰蛋白酶（PAR2激活）或ATP（P2受体激活）刺激后，用EGF处理MDA-MB-468细胞（24小时）。图表示峰值相对[Ca测量的平均剂量响应曲线²⁺]_中青旅来自3个独立实验的9口井，显示为±S.D.平均EC₅₀值如插图所示，*表示EC的重要性₅₀值，P（P）<0.05，未配对t检验。

ATP诱导钙的性质变化²⁺瞬态

除了激动剂效力的变化外，我们还观察到Ca²⁺与ATP刺激相关的配置文件。EGF处理24小时改变了用一系列ATP浓度刺激的MDA-MB-468细胞的峰后衰减动力学(图2). 暴露于EGF的细胞表现出更快地恢复到基线细胞溶质钙²⁺与不存在EGF时相比。

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图2

EGF处理对钙的影响²⁺对ATP刺激的反应。

如图所示，去除MDA-MB-468细胞的血清，用或不用EGF处理24小时。A、，平均值[Ca²⁺]_中青旅用1 mM ATP刺激的细胞内的瞬态。B、，[加利福尼亚州²⁺]_中青旅使用10µM、100µM和1 mM ATP进行评估。百分比[Ca²⁺]_中青旅显示了每种ATP浓度在试验结束时（800 s）的回收率，并表示3个独立实验中9个孔的平均±s.D。使用双向方差分析和Bonferroni后验进行统计分析；*表示P（P）<0.05.

为了评估这种效应的时间依赖性，在分析ATP介导的[Ca]增加之前，用EGF处理MDA-MB-468细胞1、6、12和24小时²⁺]_中青旅(图3A). EGF处理后1和6小时，ATP诱导的钙²⁺瞬态无变化，与对照细胞相似。然而，早在EGF暴露后12小时，衰变动力学就出现了适度的变化。24小时时，峰值相对[Ca显著不同²⁺]_中青旅和[Ca的衰变动力学²⁺]_中青旅ATP介导的短暂反应明显；这种效应对应于波形蛋白蛋白表达的显著增加(图3B).

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图3

波形蛋白的表达和ATP反应中的功能改变。

A、 MDA-MB-468细胞在测定[Ca（钙）]之前被血清饥饿并用EGF处理1、6、12和24小时²⁺]_中青旅带1 mM ATP。数据显示为平均相对值[Ca²⁺]_{细胞色素氧化酶}来自3个独立实验的9口井。B、 EGF治疗后波形蛋白的代表性免疫印迹（左）和合并数据（右）归一化为β-肌动蛋白负荷控制。值表示3个独立隔离的6口混合井的平均值±S.D。使用双向方差分析和Bonferroni后验进行统计分析*P（P）<0.05.

EGF诱导的ATP反应的改变不是与EMT相关的细胞间粘附丧失的结果

EMT的一个决定性特征是细胞形态的改变和细胞间接触的丧失[26]考虑到缝隙连接通过允许钙通道促进细胞间通讯²⁺离子和IP_三相邻单元格之间[27]，[Ca的性质变化²⁺]_中青旅ATP诱导的信号可能是EGF诱导的细胞间通讯丢失所致。为了评估这一点，我们测量了[Ca²⁺]_中青旅在非粘附性MDA-MB-468乳腺癌细胞中。在悬浮细胞中，EGF处理在ATP剂量-反应曲线中产生了相同的变化(图4A)和[Ca的性质²⁺]_中青旅瞬态(图4B&C)如粘附细胞所示(图2). 这表明EGF处理的细胞对ATP反应的改变不是与EMT相关的细胞间接触丧失的结果。

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图4

EGF治疗后非粘附MDA-MB-468细胞中的ATP信号。

A、 [Ca的评估²⁺]_中青旅用不同浓度的ATP刺激后用EGF处理的非粘附MDA-MB-468细胞（24小时）。图表示峰值相对[Ca测量的平均剂量响应曲线²⁺]_中青旅并显示为±S.D.平均EC₅₀值如插图所示，*表示EC的重要性₅₀价值观；P（P）<0.05，未配对t检验。B、 平均值[Ca²⁺]_中青旅用1 mM ATP刺激悬浮细胞的瞬态。C、 百分比[Ca²⁺]_{细胞色素氧化酶}使用10µM、100µM和1 mM ATP评估分析结束时（800 S）的回收率±S.D。使用双向方差分析和Bonferroni后验进行统计分析；*表示对<0.05. 数值代表了3个独立实验中的12口井。

EGF诱导MDA-MB-468乳腺癌细胞嘌呤能受体谱的改变

ATP介导的钙变化的另一种可能解释²⁺信号可能是由于EGF刺激导致MDA-MB-468细胞中嘌呤能受体谱的改变。为了研究嘌呤能受体转录的变化是否先于EMT，我们使用实时RT-PCR分析了嘌呤受体库的表达。七个P2X（P2X_1–7)和八个P2Y（P2Y_{1, 2, 4, 6, 11–14})研究了EGF刺激MDA-MB-468细胞的受体亚型。在EGF治疗12小时后评估转录的变化，因为基因转录的变化预计先于功能反应，如ATP诱导的钙的变化²⁺信号转导和波形蛋白诱导。通过评估24小时时所有样本的波形蛋白蛋白表达，证实了EGF介导的EMT（数据未显示）。图5A显示了在没有和存在EGF治疗的情况下，MDA-MB-468细胞中嘌呤能受体的相对水平。两组中P2X水平均较高₄未被EGF改变。在这两个治疗组中，P2X的mRNA水平均较低或检测不到₁，第2X页₂，第2X页_三，第2X页₆，第2页₄，第2页₁₁，第2页₁₂和P2Y₁₄.

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图5

EGF对MDA-MB-468细胞嘌呤能受体转录谱的影响。

在RNA分离和实时RT-PCR分析之前，用EGF或对照处理血清剥夺的MDA-MB-468细胞12小时。A、 -ΔC_T型研究了所有P2受体的值。带C的示例_T型超出检测极限的值为35(▪ 表示目标注册超过检测极限（C_T型>35）EGF和对照处理的一个或多个样品中表示靶点仅在EGF样品中高于检测极限）。B、 P2X变化定量₅EGF处理（12小时）后的mRNA。C、 P2X的拆卸效率₅siRNA（siP2X₅)使用实时RT-PCR评估相对于非靶向对照（siNT）；代表3个独立实验中的5口井。D、 经siNT或siP2X处理的MDA-MB-468细胞中EGF诱导的波形蛋白表达（IF）₅。结果代表3个独立实验中的9口井（除非另有规定），并用S.D.表示(*P（P）<0.05，未配对t检验）。

然而，EGF治疗确实诱导了嘌呤能ATP受体组的转换，包括P2Y增加2.1倍₆mRNA和P2Y减少2.6倍₁₃mRNA表达(图5A). P2X在EMT诱导下对嘌呤能受体的诱导最大₅其中EGF增加了4.6倍(图5B); 表明P2X升高₅这可能是某些乳腺癌细胞转移表型的特征。

鉴于P2X增加的幅度₅在我们的EMT模型中，我们评估了P2X的后果₅下调EGF诱导的波形蛋白表达。我们获得了超过80%的P2X击倒率₅P2X转染细胞中的mRNA₅siRNA（siP2X₅)相对于非靶向siRNA控制（siNT）(图5C). 抑制P2X₅与适度但重要的(P（P）<0.05）EGF诱导的波形蛋白表达减少(图5D).

第二页₅mRNA在具有间充质特征的乳腺癌细胞系和侵袭性基底样临床乳腺癌标本中显著上调。

研究P2X的意义₅在乳腺癌中，我们检测了其在其他EMT模型和临床样本中的表达。我们首先比较了P2X₅间质样PMC42-ET乳腺癌细胞系与表达上皮样标记物的衍生亚系PMC42-LA之间的表达[28].第2页₅在PMC42-ET细胞中的表达是PMC42-LA的13倍(图6A)，进一步表明与P2X的关联₅和转移表型。研究P2X的分布₅在一组已知转录亚型的乳腺癌细胞系中，我们查询了24个人类乳腺癌细胞株的P2X基因芯片数据库₅ [29].第2页₅与管腔来源的细胞系相比，在基底样乳腺癌细胞系中显著富集(图6B). 为了确定这些细胞系数据的潜在临床相关性，我们检查了264例人类乳腺癌病例的微阵列基因表达数据集[30]正如我们在细胞系中发现的，P2X₅与管腔A、B亚型和ERBB2+肿瘤相比，基底亚型肿瘤中显著过度表达(图6C). Perou等人定义的不同转录乳腺癌亚型[31]，基底样乳腺癌具有高度侵袭性，难以治疗，并且容易转移。此外，这些癌症与EMT有关，并且在转录上类似于间充质细胞[32].

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图6

P2X的表达₅在乳腺癌细胞系和临床样本中。

A、 P2X定量₅PMC42-ET（间充质）乳腺癌细胞相对于PMC42-LA（上皮样）乳腺癌的mRNA表达*P（P）<0.05，未配对t检验。B、 相对P2X₅利用来自24个人类乳腺癌细胞系的微阵列数据，通过转录谱分析，对其表达进行了检测。采用Mann-Whitney检验评估统计显著性(*P（P）<0.05). C、 P2X评估₅在代表四种转录亚型的264例人类乳腺癌样本中的水平。使用Kruskall-Wallis检验和Dunn的后验进行统计分析，*表示P（P）<0.05. 水平线表示每个簇的中值。

讨论

转移是乳腺癌妇女死亡的主要原因[33]随着EMT在这方面的研究越来越多。尽管细胞转移时会遇到细胞外信号的改变，但很少有研究调查EMT导致的细胞表面受体的变化[34]使用EGF诱导的EMT模型，我们研究了两种通过胞浆钙变化发出信号的细胞表面受体。在这里，我们报告了ATP介导的钙的效力的显著变化²⁺发送信号。这并不是因为细胞信号级联的总体变化，因为在与PAR2激活相关的细胞中没有观察到类似的变化。除了ATP效价的改变外，嘌呤能受体组的改变与EGF诱导的EMT有关。

EMT导致ATP反应的改变可能反映了嘌呤能受体调节过程在肿瘤进展中的重要性。实体肿瘤缺氧核心坏死释放的ATP可能是肿瘤微环境中重要的旁分泌信号[24]事实上，通过离子型P2X和代谢型P2Y受体的ATP信号调节一系列细胞事件，包括增殖、分化、凋亡和侵袭[21],[35]因此，这些过程的平衡可能取决于所表达的细胞嘌呤能受体的特异性。PC3和DU-145激素难治性前列腺癌细胞，具有类似的表达谱（P2X_4,5,7,第2页_1,2,4,6)对雌激素和孕激素不敏感的MDA-MB-468乳腺癌细胞，在ATP刺激下发生生长抑制[36].

钙的动力学和空间特征²⁺瞬变指示下游信号级联的激活，因此细胞对激动剂激活的反应[15]我们观察到，在用EGF处理的细胞中，ATP介导的胞质钙瞬变的性质发生了变化，并且剂量-反应曲线向右移动，这进一步证明了对ATP的反应改变可能是EGF介导的EMT的结果。

除了改变Ca²⁺我们还报道了嘌呤能受体在上皮向间质样表型转化过程中的变化。嘌呤能受体转录套件的这种变化以P2X的显著增加为标志₅，第2页₆P2Y减少₁₃表达式。在血管重塑过程中也可以看到嘌呤能受体亚型的变化[37]血管平滑肌细胞从收缩表型过渡到增殖（或合成）表型时P2X降低₁P2Y水平和增加₁和P2Y₂mRNA表达[38]我们的结果支持，尽管涉及不同的嘌呤能受体，但由于EMT，嘌呤受体转录发生重塑。

我们研究了P2X增加的潜在意义₅EGF诱导EMT期间的嘌呤受体，因为该亚型与在该模型中观察到的嘌呤-能表达的最大变化相关。研究P2X变化的后果₅表达，我们采用siRNA基因沉默方法来敲低P2X₅在EGF诱导的EMT模型中。第二页₅沉默显著降低EGF介导的EMT标记波形蛋白的诱导。第二页₅受体形成功能性同源三聚体或可能与P2X组装成异多聚体₁亚基[39],[40].作为P2X₁在该细胞系中未检测到mRNA，并且在EGF刺激下，P2X的转录没有明显变化₅在这种基于细胞的模型中，亚单位很可能会组装成同源离子通道。功能P2X₅同质化通道对钙具有渗透性，并且对氯离子和大型有机离子NMDG具有显著的渗透性[39]氯离子稳态在胶质瘤细胞中发生改变，并与侵袭表型相关[41].

第二页₅ATP激活抑制骨骼肌卫星细胞的增殖和P2X的作用₅在抑制癌细胞增殖方面[42]位于实体肿瘤侵袭前沿的癌细胞显示细胞增殖减少，同时细胞迁移和侵袭增加[43],[44]ATP介导的P2X后增殖减少₅激活可能是EMT过程中上皮（增殖）表型向间充质（迁移）表型转变的重要机制[45].

确定P2X中的更改₅转录可能是一些乳腺癌细胞的特征性特征，与我们检测的P2X水平相关的间充质表型更多₅与亲本间充质细胞系PMC42-ET相比，具有上皮特征的乳腺癌细胞系（PMC42-LA）中的表达[28].第2页₅间充质表型丰富。这促使我们调查P2X₅在一组通过转录谱分类为管腔或基底的人类乳腺癌细胞系中的表达。第二页₅与管腔样细胞系相比，侵袭性更强的基底样细胞系表达上调。P2X评估₅使用来自264例人类乳腺癌样本的微阵列数据进行表达，这些乳腺癌样本被分类为腔型（A/B）、ERBB2+或基底型，表明P2X₅与所有其他亚型相比，在临床乳腺癌样本的基础亚型中显著上调。基本分子亚型代表了一组癌症，通常表达EMT相关标记[32]，临床预后较差，常伴有肺和脑的优先转移[31],[46]最近发现的乳腺癌克劳丁低固有亚型与基底样乳腺癌相似，呈三重阴性，并富含EMT标记物[47]此外，乳腺癌细胞系中间充质表型的基因表达谱与从临床受试者分离的高度恶性乳腺癌干细胞有显著重叠[48]。未来的研究可以进一步探讨P2X的作用₅通过在claudin-low亚群乳腺癌和恶性乳腺癌干细胞中的表达来表征间充质表型。未来的研究评估由于EMT对细胞内钙信号和波形蛋白蛋白诱导的影响，MDA-MB-468中所有嘌呤能受体发生改变的作用也很有价值。

总之，EGF在MDA-MB-468乳腺癌细胞中诱导EMT与ATP钙信号反应的改变有关，并导致细胞表型与嘌呤能受体转录谱的改变，尤其是P2X的上调₅.抑制P2X₅EMT标记波形蛋白表达减少，其表达增加与与间充质表型相关的乳腺癌细胞相关。

材料和方法

支持信息

脚注

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