当前生物量。作者手稿；可在PMC 2011年8月4日获得。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：项目经理3150487
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院150848
ARF6调节肿瘤细胞源性质膜微泡的脱落
,1 ,1 ,1 ,2 ,2 ,2和1,三
Vandhana Muralidharan查里
1美国圣母大学生物科学系
玛丽斯·罗马奥
2居里研究所，巴黎研究中心，法国F-75248
菲利普·查夫里尔
2法国巴黎Recherche中心居里研究所，F-75248
格拉卡菜籽
2法国巴黎Recherche中心居里研究所，F-75248
Crislyn D’Souza舞蹈
1美国圣母大学生物科学系
1美国圣母大学生物科学系
2法国巴黎Recherche中心居里研究所，F-75248
三通信地址：Crislyn D’Souza-Schory，圣母大学生物科学系，邮箱369，Galvin Life Sciences Building，Notre Dame，IN 46556-0369。ude.dn@sazuosdc - 补充资料
01.
GUID:4DCAF105-2C26-4A40-8B10-728BB52ED2F7
摘要
背景
MAPK信号增强、小GTPase激活、细胞骨架重排和蛋白酶定向靶向细胞外基质降解位点，都伴随着肿瘤细胞的侵袭过程。一些研究表明，小GTP结合蛋白ARF6参与肿瘤细胞侵袭，尽管ARF6促进这一过程的分子基础尚不清楚。
结果
我们表明，ARF6 GTP/GDP循环调节了肿瘤细胞向周围环境释放蛋白酶负载的血浆膜衍生微泡。为了实现微泡脱落，ARF6-GTP依赖性磷脂酶D激活促进细胞外信号调节激酶（ERK）向质膜的募集，而ERK反过来磷酸化并激活肌球蛋白轻链激酶（MLCK）。微囊释放需要MLCK介导的MLC磷酸化。ARF6激活的抑制伴随着PKC介导的MLC磷酸化，阻止微泡脱落。蛋白质货物似乎被选择性地分为微泡，微泡相关整合素受体促进了与ECM的粘附。
结论
肿瘤细胞中的微泡脱落通过基于肌动球蛋白的膜脱落机制发生，该机制受ARF6上核苷酸循环的调节。微泡脱落似乎会将选定的细胞成分，尤其是与细胞粘附和运动有关的成分释放到周围环境中。这些发现表明，ARF6的激活和微泡的蛋白水解活性都被认为与肿瘤进展直接相关，可能成为疾病的生物标志物。
简介
转移是癌症的一个致命标志，当细胞从原发肿瘤上脱落并“侵入”周围组织到达远端位置时，就会发生转移[1]. 生长因子诱导的信号传导、Rho家族GTPases介导的细胞骨架重排以及细胞粘附和迁移潜能的改变都伴随着细胞侵袭过程[2]. 此外，来自所有四类（丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶）的蛋白酶与ECM降解有关，它们的表达、激活和分泌对肿瘤细胞侵袭至关重要[三].
在过去几年中，ARF6属于小GTP结合蛋白ARF家族，已成为一种重要的信号分子，并被证明可以调节膜运输和肌动蛋白细胞骨架重塑，这两者都可以影响迁移/侵袭潜能的获得（综述于[4]). 最近的研究利用在体外细胞侵袭试验表明，在侵袭性黑色素瘤、胶质瘤和乳腺癌细胞系中，ARF6 GTP/GDP周期可以调节侵袭潜能[4]. siRNA对ARF6的细胞耗竭或显性阴性ARF6突变体表达对ARF5活化的抑制可减轻肿瘤细胞侵袭在体外最近在动物模型中的研究也揭示了ARF6激活在黑色素瘤和胶质瘤细胞侵袭中的重要作用[5,6]. 此外，对各种乳腺肿瘤细胞系的筛选揭示了ARF6蛋白表达与侵袭能力之间的直接关系[7]. 最后，ARF6交换因子GEP100在70%的原发性乳腺导管癌中表达，并且在恶性肿瘤中优先与EGFR共表达[8].
ARF6促进细胞侵袭的细胞基础可能是什么？首先，ARF6被牵涉到对入侵昆虫营业额的调节[4]. 其次，ARF6通过其对膜交通和重塑的影响，调节蛋白酶的分泌。目前的研究重点是ARF6在蛋白酶释放中的作用。我们表明，ARF6通过其对磷脂代谢和ERK激活的影响，通过调节血浆膜衍生微泡向周围环境的脱落来调节蛋白酶的释放。囊泡从细胞表面向外分裂而脱落，这是一个选择性过程，在正常范围内发生，在肿瘤细胞中更为常见，两者都是体内和在体外[9]. 这些释放的微泡（也称为微粒、颗粒和外体）广泛存在于各种生物流体中，包括外周血和腹水；它们的组成取决于它们来源的细胞[10,11]. 它们被认为通过减小细胞大小来促进细胞侵袭、逃避免疫反应、骨矿化甚至肿瘤细胞的灌注[12]. 在这里，我们提供了肿瘤细胞脱落的ARF6阳性微泡的结构和生化特征。我们还表明，微泡中包含的蛋白酶载体功能强大，并促进基质降解。最后，我们描述了ARF6操纵肌动球蛋白机械以促进肿瘤细胞表面微泡脱落的途径。这些发现意义重大，特别是有报道表明，肿瘤细胞脱落的微泡的蛋白水解活性与恶性肿瘤和侵袭性直接相关[13,14].
结果
LOX的表型变异ARF6-GDP和LOXARF6-GTP公司细胞系
为了研究ARF6促进细胞侵袭的机制，我们利用LOXARF6-GTP公司和LOXARF6-GDP分别稳定表达HA-标记的GTPase缺陷型ARF6突变体ARF6-Q67L或显性阴性ARF6突变ARF6-T27N的细胞系。LOX显微镜检查中观察到的最显著的表型ARF6-GDP细胞是存在于细胞表面的泡状球状结构(). 这些结构也可以在LOX和LOX的表面上看到ARF6-GTP公司细胞系()尽管它们不太明显。相反，在后两种细胞系中，小泡被释放到生长介质中(). LOX生长介质中缺乏囊泡ARF6-GDP细胞提示ARF6的激活可能是释放它们所必需的。当通过生长培养基低速离心收集并检测总蛋白或检测ARF6表达时，小泡从LOX中脱落ARF6-GTP公司细胞表现出明显更多的蛋白质和ARF6，表明相对于亲本细胞系，这些细胞的脱落增加(). 此外，脱落囊泡上不存在突变ARF6-GDP。
LOX中观察到的表型变异ARF6-GDP和LOXARF6-GTP公司突变系（A）父母LOXARF6-GTP公司和LOXARF6-GDP如图所示，将细胞系固定并用罗丹明-指骨肽染色，以显示肌动蛋白丝分布或β1-整合素抗体。面板显示LOX细胞系的表型范围。棒材：10µm。（B）父母LOXARF6-GTP公司和LOXARF6-GDP采用相控显微镜对低汇合培养的细胞进行成像。箭头指向LOX和LOX生长介质中脱落的小泡ARF6-GTP公司细胞。棒材：10µm。（C）从2.2×10释放到生长介质中的囊泡6LOX、LOXARF6-GTP公司和LOXARF6-GDP通过western blotting（左）或蛋白质定量（右）分离并检测ARF6和β1整合素。通过western blotting检测细胞裂解液中的ARF6和α-微管蛋白。LOX中的低分子量和高分子量ARF6带ARF6号机组细胞分别对应内源性和HA标记的外源性ARF6。（D）液氧ARF6-GTP公司和LOXARF6-GDP将细胞接种在FITC明胶包被的盖玻片上，并允许其侵入。固定细胞，并对其进行皮质素（蓝色）和肌动蛋白（红色）染色（上部面板），或β1整合素（红色）（中部和下部面板）。箭头指向侵略者，箭头表示脱落的小泡。注意LOX的树状化表型ARF6-GTP公司底层明胶相对较厚时的细胞（中间面板）。棒材：10µm。（E）液氧ARF6-GTP公司和LOXARF6-GDP用电子显微镜分析细胞系。上图显示LOX表面附近的异质性囊泡结构ARF6-GTP公司细胞。下图显示了似乎钉在LOX表面的囊泡结构ARF6-GDP细胞。条形：1000nm。（F）从同等数量（1.5×10）释放到生长培养基中的囊泡6分离培养的指示肿瘤细胞系中的细胞），并通过western blotting检测ARF6。
在早期的研究中，当LOX细胞接种在明胶基质上时，囊泡的释放并不明显[15]可能是因为它们在细胞侵袭部位释放到基质中。此外，由于之前研究中使用的瞬时转染效率低，他们的检测可能会受到阻碍。然而，在本研究中，仔细检查了LOXARF6-GTP公司在涂有明胶的盖玻片上的细胞，我们能够检测到细胞表面基质中存在小泡(). 此外，如所示-上图中，这些囊泡结构似乎与延伸到明胶基质中的皮质素阳性侵入体不同。囊泡虽然标记有β1整合素，但不含皮质素(，另请参见)也存在于入侵国[16]. 囊泡中皮质素标签相对于入侵足的定量如所示图S1一些细胞呈现出用微泡装饰的膨胀膜乔木（参见，中间面板）。当下面的明胶相对较厚（≥5 m）时，细胞倾向于采用这种树状化表型，暗示着水平运动。细胞最初可能在粘附面形成内陷性，当它们侵入“实质性”基质并横向移动时，这种乔木表型就会生效。相反，LOXARF6-GDP当细胞贴在明胶上时，细胞呈球状，这主要是由于细胞表面布满小泡，细胞下方基质几乎没有降解(，下面板）。如前所述，显性阴性ARF6突变体表达后，在粘附表面未观察到侵入体突起[15]. 因此，ARF6活化与两个明显不同的细胞过程相耦合，这两个细胞过程与基质侵袭、侵入体形成和表面小泡释放到周围环境有关。在这项研究中，我们重点关注ARF6调节肿瘤细胞表面小泡脱落的机制。
微泡脱落需要ERK信号（A）父母LOX和LOXARF6-GTP公司用30µM U0126处理品系，分离并定量培养基中脱落的微泡以获取蛋白质。显示了来自5个独立实验的数据。棒材：10µm。（B）父母LOX和LOXARF6-GTP公司用U0126处理或不处理的细胞系进行固定并染色肌动蛋白。箭头指向细胞表面的微泡。（C）将GFP-ERK（绿色）和Myc-tagged-ARF6突变体（红色）瞬时转染到LOX中，固定并用抗Myc染色。内体中GFP-ERK和ARF6-GDP重叠，ARF6-GTP表达的细胞表面有一个显著的ERK库。棒材：10µm。（D）父母LOXARF6-GDP和LOXARF6-GTP公司进行亚细胞分离，并通过免疫印迹法分析细胞膜和胞液组分中内源性磷酸-ERK和总-ERK的数量。
LOX的形态学检查ARF6-GTP公司和LOXARF6-GDP使用电子显微镜（EM）的细胞系表明，细胞表面的小泡大小不均匀（300-900纳米）(). 基于EM的研究也表明，细胞没有出现核分裂或凋亡的迹象。所有上述结果表明，ARF6 GTPase循环调节着肿瘤细胞向周围环境释放异质性囊泡。
我们还检测了其他肿瘤细胞系中的囊泡脱落；SW480是一种结肠癌细胞系，PC3是一种前列腺癌细胞系，MDA-MB-231是一种侵袭性乳腺癌细胞系。通过相差显微镜进行的大体形态检查表明，上述所有细胞系的生长介质中都存在脱落囊泡（数据未显示）。通过免疫印迹分析从生长介质中收集的脱落囊泡，发现在分离的囊泡上存在内源性ARF6(). 此外，这些肿瘤细胞系中ARF6（T27N）的表达对ARF6功能的显性抑制阻止了囊泡释放（SW480细胞系的数据显示于图S2).
ARF6-GTP促进血浆膜衍生“微泡”释放到周围环境中
有越来越多的证据表明存在非常规分泌机制，例如不利用经典信号肽分泌运输途径的外泌体和微泡的释放。外泌体是多泡体/晚期内泌体的内囊泡，在胞吐时释放[17]. ARF6调节的脱落小泡的形态学特征表明，它们是“微泡”，因此被称为微泡。通过约10000g离心分离ARF6阳性囊泡颗粒，不同于通过约100000g离心沉淀的外泌体().表明ARF6阳性囊泡在100000g组分中不存在。对10000g和100000g组分的整装制剂的超微结构分析证实了10000g微泡相对于100000g组份中外分泌体特征的更均匀50-70nm囊泡的异质性().
ARF6阳性微泡与外泌体不同（A）亲代LOX和LOX释放的微泡ARF6-GTP公司按照方法所述对细胞系进行分级，并从每个组分中检测ARF6的等效蛋白。内源性ARF6和HA标记突变体ARF6仅在10000g组分中富集。（B）从LOX中分离的分馏囊泡群ARF6-GTP公司细胞通过全贴装电子显微镜进行分析。与典型外泌体的100000g组分中更均匀的50-70nm小泡相比，10000g组分分离出的微泡更大（300-900nm）且不均匀。条形：500nm。（C）LOX的表面ARF6-GDP用Annexin V（绿色）标记细胞以划分PS外化区域，β1-整合素（红色）标记细胞表面标志物。顶部面板仅显示Annexin V标签。当绿色信号减弱时，可以观察到囊泡脱落部位的Annexin V标记富集。棒材：10µm。(D类)父母LOXARF6-国内生产总值和LOXARF6-GTP公司用50nM冈田酸处理或不处理3小时的细胞系，固定并标记裂解的caspase-3（绿色），用topro-3-碘化物（蓝色）染色。比例尺：10µm。
研究表明，PS（磷脂酰丝氨酸）外化伴随着血浆膜衍生微泡的脱落[11]. 事实上，我们发现PS在微泡表面的外化是基于与高亲和力PS结合蛋白Annexin-V的反应性。这在LOX中尤为明显ARF6-GDP细胞表面有微泡的细胞(). 我们还注意到，这些微泡不是凋亡小体。如上所述，ARF6突变体在LOX细胞中的表达不会引起形态学变化，例如浓缩染色质和固缩核，或标记裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。另一方面，当用冈田酸（一种已知的凋亡诱导剂）处理时，分裂的caspase 3标记的细胞比例较高(). 因此，ARF6的激活促进了微泡的释放。
棚状微泡含有蛋白酶并促进ECM降解
以前的报告表明，乳腺癌和卵巢癌细胞系脱落的微泡含有MMP-2和MMP-9等蛋白酶[18]. 我们发现，如明胶酶谱图所示，来自10000g组分的ARF6阳性微泡含有高分子量和低分子量明胶酶()和MT1MMP(). 值得注意的是，MT1MMP沉默显著降低了亲代LOX细胞的基础侵袭性（我们未发表的观察结果）。此外，脱落的囊泡接种在FITC-明胶上时，能够降解基质，并在微泡膜周围出现黑点().
脱落微泡含有功能性蛋白酶和其他选择性膜蛋白（A）相同数量的亲代LOX和LOX释放出的微泡ARF6-GTP公司分离细胞，用明胶酶谱分析微泡裂解物。检测细胞裂解液中α-微管蛋白的表达。微泡裂解物中存在高分子量和低分子量明胶酶。（B）在不存在或存在抗β1整合素封闭抗体AIIB2的情况下，将从生长培养基中分离出的棚状微泡轻轻覆盖在FITC-明胶涂层玻璃盖玻片上8小时。对盖玻片进行肌动蛋白染色（红色），以识别微泡（见箭头）。FITC-明胶上的黑点表明在隔离的微泡下发生降解（左侧面板）。在AIIB2抗体存在的情况下，微泡与基质的粘附性降低到10%以下。图像特意显示残留标签（右侧面板）。棒材：10µm。（C）非渗透LOXARF6-GTP公司用β1-整合素抗体标记细胞，标记细胞外表面。棒：10µm。（D）父母LOXARF6-GDP和LOXARF6-GTP公司细胞固定并染色肌动蛋白（绿色）和内源性MHC-1（红色）。棒材：10µm。（E）LOX裂解物ARF6-GTP公司通过western blotting分析细胞或脱落微泡的内源性蛋白或转染蛋白（EGFP-VAMP3或EGFP-VAMP7）。
有人提出，β1整合素促进脱落的微泡与ECM的相互作用，并且在肿瘤环境的酸性pH特征诱导的微泡破裂后释放囊泡内容物[19]. 我们发现在分离的微泡中加入灭活β1整合素抗体AIIB2()或LOX细胞（未显示），阻止粘附和基质降解，表明微囊膜中的蛋白质拓扑结构仍保持不变，整合素受体与基质的结合对微囊介导的基质降解很重要。AIIB2还标记细胞的细胞外表面并脱落微泡(). 因此，虽然侵入体表面的蛋白酶有助于局部细胞周蛋白水解，但微泡释放可以提供一种机制，使远端部位的快速定向蛋白水解产生较少阻力的途径。
将货物选择性分拣成细胞表面微泡
除蛋白酶外，β1整合素受体和MHC I类分子中的微泡也被选择性富集。MHC I类分子和整合素受体均通过ARF6调节的内胚小室进出质膜[20].显示了LOX中MHC类别1的标签ARF6-GDP核周室和细胞表面的细胞，但主要在LOX中的细胞表面ARF6-GTP公司细胞。脱落囊泡的Western blotting分析显示，除内源性ARF6外，微囊泡中还存在MHC-I、β1整合素、VAMP3和MT1-MMP(). 值得注意的是，MT1-MMP的加工形式存在于微泡中。然而，微泡中没有转铁蛋白受体、VAMP7或Rab8A以及已知的侵入体、皮质素和Tks5成分。因此，通过再循环内体运输到细胞表面的货物似乎被选择性地分类到这些表面微泡中。
ARF6-GTP诱导的微泡脱落需要细胞外信号调节激酶（ERK）
ARF6增强的黑色素瘤细胞侵袭依赖于细胞外信号调节激酶（ERK）的激活[15]. 此外，ARF6 GTPase循环调节ERK激活[15,21,22]c-Raf/A-Raf下游[23]. 因此，我们研究了ARF6-GTP诱导的微泡脱落是否也依赖于ERK信号。LOX和LOX的治疗ARF6-GTP公司含有MEK抑制剂U0126（ERK上游的激酶）的细胞显著抑制了基底细胞的脱落，ARF6-GTP增强了微泡的脱落(). MEK抑制后，亲代LOX和LOXARF6-GTP公司细胞表面积聚的类似LOX的微泡ARF6-GDP表型(). 同样，MEK抑制也阻止PC3和SW480细胞的微泡脱落(补充图3). 因此，ARF6调节的微泡脱落需要ERK。
与HeLa细胞的早期发现一致[21]我们发现ERK定位于LOX中的细胞质ARF6-国内生产总值单元格(). 相反，膜相关ERK主要位于LOX和LOX的细胞表面ARF6-GTP公司细胞。这在亚细胞分级研究中变得更加明显，其中活化的磷酸-ERK分布在LOX的膜部分中显著更多ARF6-GTP公司单元格(). 因此，ARF6激活可能会增强ERK向质膜的再分配，进而促进其磷酸化和微泡释放。
ARF6调节的ERK激活需要磷脂酶D
研究表明，ARF6模拟磷脂酶D（PLD）活性[4]. 此外，PLD已被证明有助于ERK激活。在这里，我们测试了ARF6调节PLD活性是ERK激活所必需的假设。首先，我们检测了PLD失活后的磷酸化ERK水平。我们发现ARF6-N48I（一种PLD激活缺陷的ARF6突变体）的表达抑制了ERK的激活()和微泡脱落(). ARF6-N48I表达细胞中PA水平显著降低()ERK分布在胞质结构中(图S4). 接下来，我们使用初级醇来抑制PLD，这会导致磷脂酰醇的形成，而磷脂酸的形成是通过取代水来实现的。我们发现用1-丁醇处理细胞也会抑制ERK激活（数据未显示）和微泡脱落(). 因此，PLD激活是ERK激活的上游，对ARF6调节的微泡脱落至关重要。
ARF6诱导的ERK激活需要PLD（A）通过western blotting检测瞬时转染HA-taged-ARF6-N48I突变体的LOX细胞裂解液中的磷酸化ERK和总ERK。这些数据代表了3个单独的实验。通过密度测定法对条带强度进行量化，并显示磷酸化ERK与总ERK的比率。（B）通过差速离心分离亲本LOX和转染ARF6-N48I的LOX细胞释放到培养基中的微泡，并对蛋白质含量进行定量，数据如图所示。与未转染对照组相比，表达ARF6-N48I的细胞生长介质中的微泡较低。（C）LOX细胞与编码ARF6-N48I和GFP-Spo20-PABD（荧光PA探针）的表达质粒共转染。当ARF6突变体表达时，PA水平降低。（D）用0.3%叔丁醇或正丁醇处理LOX细胞30分钟，固定并染色肌动蛋白以显示表面相关的微泡。在每种实验条件下，对表面显示八个或八个以上微泡的细胞进行评分，并测定抑制小泡脱落的百分比。每个实验观察250个细胞，并绘制四个独立实验的数据。（E）LOX裂解物ARF6-GDP用普萘洛尔（0.1mM）和阿替洛尔（10uM）处理的细胞探测磷酸ERK和总ERK。通过密度计定量条带强度。数据代表了3个独立实验。（F）液氧ARF6-GDP观察用普萘洛尔或阿替洛尔处理的细胞，并对细胞表面有微泡的细胞进行上述评分。心得安治疗LOXARF6-GDP细胞恢复了小泡脱落。
接下来，我们研究了是否可以挽救LOX中微泡的脱落ARF6-GDP通过恢复磷酸化-ERK水平，或通过独立于ARF6的途径刺激PLD活性。用PA磷酸水解酶抑制剂普萘洛尔治疗[24]，恢复LOX中的磷酸化-ERK水平ARF6-GDP单元格，如中所示以及诱导LOX中的微泡脱落ARF6-GDP单元格(). 与普萘洛尔不同，另一种GCPR拮抗剂阿替洛尔对磷酸化ERK水平或微泡释放没有任何影响(). 这些数据证实了PLD和ERK激活在调节微泡脱落中的重要性。最后，我们测定了1-丁醇对组成活化MEK表达诱导的微泡脱落的影响。与亲代LOX细胞相比，活化的MEK使微泡脱落增加了12倍以上；然而，1-丁醇对微泡脱落几乎没有影响，证实ERK位于PLD活化的下游（数据未显示）。
ERK通过磷酸化肌球蛋白轻链促进微泡脱落
用一种小分子肌球蛋白II活性抑制剂（blebbistatin）或latrunculin a（一种抑制肌动蛋白聚合的肌动蛋白结合毒素）处理LOX细胞，会严重影响微泡的释放。在有气泡抑素的情况下，不会形成微泡(). 85–90%的latrunculin A处理的细胞在细胞表面出现聚集的微泡(). 因此，latrunculin A治疗也抑制了亲本LOX和LOX的微泡释放ARF6-GTP公司单元格(). 因此，小泡脱落可能是通过肌动蛋白依赖机制介导的。MLCK，加利福尼亚州2+/钙调蛋白依赖性激酶，磷酸化肌球蛋白II轻链（MLC）以促进肌动蛋白基细胞骨架的收缩[25]. ERK被证明磷酸化MLCK，MLCK反过来磷酸化Thr18/Ser19处的MLC，从而刺激MLC活性[26,27]. 我们验证了以下假设：ARF6-GTP在囊泡释放位点诱导ERK激活导致MLCK的局部激活，而MLCK反过来刺激MLC的丝氨酸磷酸化，以产生微囊分裂所需的力。为了支持这一论点，LOX肿瘤细胞的免疫荧光标记显示，磷酸化-MLC定位于细胞表面微泡的“颈部”().
ERK调节的微泡脱落需要MLCK磷酸化（A）用100µM blebbistatin或2µM Latrunculin A处理LOX细胞，固定并染色肌动蛋白，以显示表面相关的微泡。棒：10µm。（B）父母LOXARF6-GTP公司和LOXARF6-GDP将培养中的细胞与含有2µM Latrunculin A（Lat A）的新鲜培养基孵育45分钟。分离出释放的微泡，对其进行蛋白质定量，并显示数据。（C）固定LOX细胞并对其进行内源性磷酸化MLC（绿色）和肌动蛋白（红色）染色。注意磷-MLC在表面微泡“颈部”的定位。棒材：5µm。（D）LOX的细胞裂解物ARF6-GTP公司和LOXARF6-GDP通过蛋白质印迹分析细胞系的内源性磷酸化MLC。α-微管蛋白表达也被评估为等负荷的指标。通过密度扫描测量带密度。（E）用western blotting分析经U0126（30uM）处理的LOX细胞裂解液中内源性磷酸化MLC、磷酸化ERK、总ERK和α-微管蛋白。免疫印迹上第2和第3道之间的额外道被剪接出来。通过密度扫描测量带密度。（F）液氧ARF6-GDP用各种抑制剂处理细胞；Go6976（PKC抑制剂-10uM）、ML-7（MLCK抑制剂-10uN）、U0126（MEK抑制剂-30uM）和SB203580（p38抑制剂-10uL）在37°C下保持2小时。通过western blotting检测细胞裂解液中的磷酸-MLC、磷酸-ERK和α-微管蛋白。
我们通过western blotting检测了亲本LOX和LOX突变株系中MLC的磷酸化。如所示，LOX中磷酸化-MLC水平显著增加ARF6-GTP公司细胞与亲代LOX细胞进行比较。父母LOX和LOX的治疗ARF6-GTP公司含有ML-7（MLCK抑制剂）的细胞可以阻止MLC磷酸化和微泡脱落(图S5). 综上所述，这些数据表明ARF6通过一种涉及ERK依赖性MLC磷酸化的机制促进微泡分裂。
如中所示与我们的预期相反，在LOX中未观察到磷酸化-MLC水平的下降ARF6-GDP细胞，事实上它们略高于基础水平。对这一观察的一个可能解释是，LOX中MLC的磷酸化ARF6-GDP细胞具有“抑制性”且不依赖ERK。为了进一步研究这一点，我们比较了亲本LOX和LOX突变株中U0126存在和不存在时磷酸化MLC的水平。如中所示，在亲代LOX和LOX中存在MEK抑制剂时，磷酸化MLC的抑制作用是明显的ARF6-GTP公司但LOX中的磷酸化MLC水平没有受到抑制ARF6-GDP细胞。此外，ML7处理对LOX中MLC磷酸化几乎没有影响ARF6-GDP单元格(图S5). 这进一步证实了LOX中MLC的磷酸化ARF6-GDP细胞不受ERK介导。
我们研究了其他途径，如PKC或p38的激活[28,29]LOX中MLC磷酸化ARF6-GDP细胞。为了区分PKC-和p38介导的MLC、LOX的磷酸化ARF6-GDP用p38抑制剂SB203580或PKC抑制剂Go6976处理细胞。我们发现磷酸化-MLC水平因PKC抑制而降低(). 因此，LOX中的MLC磷酸化ARF6-GDP通过PKC发生，并且独立于磷酸化ERK。我们还注意到MLC磷酸化独立于亲本LOX和LOX中的PKCARF6-GTP公司由于在PKC抑制剂存在的情况下未观察到磷酸化-MLC水平的降低(图S4). 因此，在LOXA中RF6-GDP细胞MLC被PKC磷酸化，PKC是抑制性的，而在LOX中ARF6-GTP公司细胞，MLC磷酸化由ERK上游调节，ERK是促进MLC调节收缩的一个步骤，反过来，微泡分裂（参见). 与这些发现相关的是，PKC介导的MLC磷酸化已被证明可降低MLC活性。在这方面，犬基底动脉的缓慢伸展伴随着肌球蛋白轻链（MLC）的三磷酸化20)在Thr9、Thr18，序列号19从而抑制肌源性收缩，从而使肌肉松弛[30]. 总之，ARF6-GTP通过一种涉及ERK依赖的MLC磷酸化的机制促进微泡分裂，而ARF6-GDP通过PKC诱导的MLC磷化具有相反的作用。
ARF6介导的细胞侵袭调控的工作模型答：。活化的ARF6通过促进侵入体形成和微泡脱落促进肿瘤细胞侵袭。侵入体的形成和微泡的释放需要ARF6和ERK。B。右侧显示了微泡脱落所需的ARF6调节的ERK激活下游的信号通路。ARF6调节ERK在质膜上的定位及其激活需要PLD。ERK诱导的MLCK磷酸化反过来促进了基于肌动球蛋白的膜分裂所需的MLC磷酸化，从而导致微泡释放。
讨论
微泡介导的蛋白酶释放是肿瘤细胞生物学中一个重要但尚未研究的领域。我们的研究表明，ARF6在调节含有功能性蛋白酶的微泡脱落方面起着关键作用。微泡释放依赖于PLD活性，这反过来导致ERK的激活。ERK磷酸化并激活MLCK，MLCK是磷酸化ERK的已知底物。MLCK反过来磷酸化并活化MLC。这将使微泡颈部基于肌动蛋白的收缩，促进其释放到细胞外空间。
越来越多的证据表明，微泡的释放有助于ECM降解。在这方面最引人注目的是，据报道在I-IV期卵巢癌患者的恶性卵巢腹水中存在具有侵袭性的蛋白酶膜微泡[14]. 研究还表明，晚期腹水的微泡明显多于早期疾病，尽管微泡的侵袭能力与疾病分期无关。这些研究证实了此处所述数据的生理相关性和重要性。事实上，我们表明，细胞周蛋白水解的关键介质MT1-MMP的加工形式存在于微泡中。
除了促进细胞外基质降解外，微泡还可以促进癌基因在癌细胞亚群之间的水平传播[31]. 胶质母细胞瘤细胞脱落的小泡除含有血管生成因子外，还含有微小RNA[32]. 研究还表明，微泡能够使肿瘤逃避免疫监视，从而促进肿瘤细胞存活[33]. 与这些发现一致，我们观察到MHC-I类包含在微泡中。尽管货物似乎是通过ARF6调节的内体途径，即MHC i类和β1整合素受体以及VAMP-3，但货物如何被引导至表面相关囊泡仍需进一步研究[4]被输送到微泡。微泡中没有VAMP-7和Rab8，这两种物质都参与了MT1-MMP向细胞表面的传递[34,35]以及转铁蛋白受体，在某些细胞类型中，转铁蛋白也通过ARF6室进行转运（在[4]). 因此，货物似乎被选择性地分类成细胞表面的微泡。我们认为，囊泡脱落发生在质膜上的特定位置，旨在将选定的细胞成分释放到周围环境中，尤其是那些参与细胞-基质相互作用和基质降解的成分。Rab8和VAMP-7依赖性可能促进细胞周蛋白水解。
这项研究也支持这样的观点，即微泡释放伴随着局部脂质紊乱和囊泡介导的蛋白水解需要整合素受体与ECM结合[36]. PS外化引起的局部脂质紊乱也被证明发生在其他非凋亡过程中，如肌管形成[37]非凋亡淋巴细胞表面信号蛋白活性的快速调节[38].
肌动蛋白聚合和肌球蛋白功能的药理学抑制可阻止微泡释放，这表明外向裂变可能是通过肌动蛋白-肌球蛋白的过程发生的。我们发现，依赖ARF6的ERK激活促进MLCK磷酸化和随后的MLC磷酸化，从而促进囊泡颈部基于肌动球蛋白的收缩，导致微泡释放。这种调控的复杂性表现在这样一个事实上：当ARF6激活被阻断时，不仅ERK激活和ERK调节的MLCK磷酸化不会随之而来，而且PKC介导的MLC磷酸化和失活也会因此发生(). 所有这些观察都支持早期的发现，即ARF6诱导的ERK激活对肿瘤细胞侵袭具有深远的影响。ARF6诱导的ERK激活依赖于PA的积累。PA可以促进ERK向细胞表面的募集，如上文所述，但也可能需要改变脂质环境，以促进ERK级联的成分（如Raf）向质膜的募集[39,40].
侵入体和微泡似乎是不同的结构。皮质素是入侵脚的真正成分，在微泡中不存在。虽然侵入体表面的蛋白酶可能代表了前缘/侵入膜边缘的局部细胞周蛋白水解机制，但微泡的释放可能促进更远处的局部蛋白水解并形成侵入途径。一些肿瘤株可能同时表现出两种侵袭机制，而在其他肿瘤株中，其中一种机制可能占主导地位。侵入体的形成和微泡的释放都依赖于ARF6诱导的ERK激活().
膜微泡脱落不仅限于病理条件，在正常生理条件下也可以观察到。例如，骨骼细胞分泌的微泡使骨矿化体内而正常内皮细胞分泌的微泡与血管生成有关[41]. 微泡也被证明在胚胎干细胞中的mRNA转移中发挥作用，并可能在病毒包装和向细胞外环境输送中发挥作用[12,42] [36]. 因此，除了为癌症治疗和诊断提供策略外，有关微泡脱落机制的知识还可能有助于了解其他需要质膜出芽的事件。
实验程序
抗体和质粒
本研究中使用了以下抗体（括号中的供应商）。抗中性β1-整合素，AIIB2，（衣阿华大学发育研究杂交瘤库），抗Rab-8A和抗Tsk5（圣克鲁斯），抗MHC-Ⅰ类（Serotec），抗HA（Covance），来自Zymed的抗TfnR，抗磷酸-MLC、磷酸-ERK、总ERK、皮质酮和裂解caspase 3（细胞信号传导）抗体，抗α-微管蛋白抗体（Sigma）、抗GFP（Roche）。MT1-MMP抗体来自M.C.Rio博士（法国）的礼物。GFP-ERK（Addgene质粒14747）来自Addgene[43]. HA-taged ARF6-N48I由Nicholas Vitale博士（国家科学研究中心和路易斯·巴斯德大学）提供。编码GFP-VAMP3和GFP-VAMP7的质粒是Thiery Galli（IJM，巴黎，法国）赠送的礼物。
细胞培养和微泡分离
LOX，LOXARF6-GTP公司和LOXARF6-GDP细胞系按描述进行培养[5]. 细胞接种在50%汇合的组织培养瓶中。在大约80%的汇合处小心地从细胞中取出培养基，并在800g下连续离心10分钟，2500g下连续离心机离心15分钟，10000g下连续分离30分钟。如有指示，随后将上清液在100000g下离心1小时。分离的微泡在PBS中清洗、溶解，并使用Bradford分析（BioRad）估计蛋白质含量。
明胶酶谱检测
如前所述，在RIPA缓冲液中溶解从生长培养基中分离的微泡，并在含有明胶的SDS-PAGE凝胶上分离，以评估明胶酶活性[44].
“体外”降解试验
明胶降解试验如前所述[45]. 或者，将分离的微泡接种在涂有明胶的盖玻片上培养6-8小时。
免疫荧光染色和显微镜检查
将培养细胞/微泡镀在聚赖氨酸涂层或明胶涂层玻璃盖玻片上，并按所述进行固定和处理[5]. 通过用罗丹明phaloidin（Molecular Probes）染色来观察F-肌动蛋白的分布。根据制造商的协议，使用Beckman-Coulter的试剂盒，用FITC-Annexin V标记细胞表面。固定细胞，并在有指示的地方标记表面的β1-整合素（无通透性），然后进行免疫荧光显微镜检查。使用尼康显微镜和Bio-Read MRC 1024共聚焦3通道扫描系统对细胞进行可视化。
电子显微镜（EM）
如前所述进行常规和整体电子显微镜检查[46]. 简言之，用2.5%戊二醛将盖玻片上生长的细胞固定在0.1M二羧酸缓冲液中过夜，并按所述进行处理。对于全贴装膜制备，将100000 g和10000 g颗粒轻轻悬浮在小体积PBS中，并在formvar-carbon涂层EM格栅上放置20分钟，然后进行EM处理。
致谢
我们感谢Oystein Fodstad博士（挪威镭医院）提供的LOX细胞系，Holly Hoover博士对ARF6细胞系的生成做出的宝贵贡献，以及Jogender S.Tushir博士对所述信号通路的关键见解。JC是GLOBES-NSF和礼来基金会的博士后研究员。这项工作得到了国家癌症研究所（CA115316）对CD-S的部分资助。
脚注
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
参考文献
1Chambers AF、Groom AC、MacDonald IC。转移部位癌细胞的扩散和生长。Nat Rev癌症。2002;2:563–572.[公共医学][谷歌学者] 2Vega FM，Ridley AJ。癌细胞生物学中的Rho GTPases。FEBS信函。2008;582:2093–2101.[公共医学][谷歌学者] 三。Egeblad M，Werb Z。基质金属蛋白酶在癌症进展中的新功能。Nat Rev癌症。2002;2:161–174.[公共医学][谷歌学者] 4D’Souza-Schorey C，Chavrier P.ARF蛋白质：在膜交通及其他方面的作用。Nat Rev Mol细胞生物学。2006;7:347–358.[公共医学][谷歌学者] 5Muralidharan-Chari V、Hoover H、Clancy J、Schweitzer J、Suckow MA、Schroeder V、Castellino FJ、Schorey JS、D'Souza-Schorey C.ADP-核糖基化因子6调节体内致瘤性和侵袭性。癌症研究。2009;69:2201–2209. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6胡B，史B，Jarzynka MJ，Yain JJ，D’Souza-Schorey C，Cheng SY.ADP-核糖基化因子6通过IQdomain GTPase激活蛋白1-Rac1介导的途径调节胶质瘤细胞侵袭。癌症研究。2009;69:794–801. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Hashimoto S、Onodera Y、HashimotoA、Tanaka M、Hamaguchi M、Yamada A、Sabe H。乳腺癌侵袭活动中Arf6的要求。美国国家科学院院刊。2004;101:6647–6652. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Morishige M、Hashimoto S、Ogawa E、Toda Y、Kotani H、Hirose M、Wei S、Hashimo A、Yamada A、Yano H、Mazaki Y、Kodama H、Nio Y、Manabe T、Wada H、Kobayashi H、Sabe H。GEP100将表皮生长因子受体信号与Arf6激活联系起来，从而诱导乳腺癌侵袭。自然细胞生物学。2008;10:85–92.[公共医学][谷歌学者] 9Morel O，Toti F，Hugel B，Freyssinet JM。《细胞微粒：生物活性血管效应物的分散储存池》。当前操作血液。2004;11:156–164.[公共医学][谷歌学者] 10Ratajczak J、Wysoczynski M、Hayek F、Janowska-Wieczorek A、Ratajgzak MZ。膜衍生微泡：细胞间通信的重要和未被重视的介质。白血病。2006;20:1487–1495.[公共医学][谷歌学者] 11Hugel B、Martinez MC、Kunzelmann C、Freyssinet JM。膜微粒：硬币的两面。生理学（贝塞斯达）2005;20:22–27.[公共医学][谷歌学者] 12Cocucci E，Rachetti G，Meldolesi J.脱落微泡：不再是人工制品。趋势细胞生物学。2009;19:43–51.[公共医学][谷歌学者] 13Dolo V、D'Ascenzo S、Violini S、Pompucci L、Festuccia C、Ginestra A、Vittorelli ML、Canevari S、Pavan A.体内外卵巢癌细胞在膜泡中释放Matrix降解蛋白酶。临床实验转移。1999;17:131–140.[公共医学][谷歌学者] 14Graves LE、Ariztia EV、Navari JR、Matzel HJ、Stack MS、Fishman DA。卵巢癌腹水衍生膜泡的侵袭性。癌症研究。2004;64:7045–7049.[公共医学][谷歌学者] 15Tague SE、Muralidharan V、D’Souza-Schorey C.ADP-核糖基化因子6通过激活MEK/ERK信号通路调节肿瘤细胞侵袭。美国国家科学院院刊。2004;101:9671–9676. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Bowden ET、Onikoyi E、Slack R、Myoui A、Yoneda T、Yamada KM、Mueller SC。cortactin和磷酸酪氨酸的共同定位鉴定了人类乳腺癌细胞中的活性内隐肽。实验细胞研究。2006;312:1240–1253.[公共医学][谷歌学者] 17Fevrier B，Raposo G.外泌体：内体衍生小泡运输细胞外信息。当前操作细胞生物学。2004;16:415–421.[公共医学][谷歌学者] 18.Dolo V、Ginestra A、Cassara D、Violini S、Lucania G、Torrisi MR、Nagase H、Canevari S、Pavan A、Vittorelli ML。基质金属蛋白酶9、β1整合素和人淋巴细胞抗原I类分子在8701-BC乳腺癌细胞脱落的膜泡上的选择性定位。癌症研究。1998;58:4468–4474.[公共医学][谷歌学者] 19Taraboletti G、D'Ascenzo S、Giusti I、Marchetti D、Borsotti P、Millimaggi D、Giavazi R、Pavan A、Dolo V。肿瘤脱落囊泡中VEGF的生物可用性取决于酸性pH诱导的囊泡破裂。肿瘤。2006;8:96–103. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20唐纳森·J·G。Arf6的多重作用：在质膜上进行分类、构建和信号传递。生物化学杂志。2003;278:41573–41576.[公共医学][谷歌学者] 21Robertson SE、Setty SR、Sitaram A、Marks MS、Lewis RE、Chou MM。细胞外信号调节激酶调节非依赖于氯氰菊酯的胞内转运。分子生物学细胞。2006;17:645–657. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Tushir JS，D’Souza-Schorey C.ARF6依赖性ERK和Rac1激活调节上皮小管发育。Embo J。2007;26:1806–1819. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Nekhoroshkova E、Albert S、Becker M、Rapp UR。A-RAF激酶在ARF6调节的胞内膜交通中发挥作用。公共科学图书馆一号。2009;4：e4647。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Jovanovic OA、Brown FD、Donaldson JG。Arf6的一个效应域突变涉及磷脂酶D在内胚体膜再循环中的作用。分子生物学细胞。2006;17:327–335. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25.Sobieszek A、Strobl A、Ortner B、Babiychuk EB。钙（2+）-钙调蛋白依赖性修饰平滑肌肌球蛋白轻链激酶，导致其被钙调蛋白协同激活。生物化学杂志。1993;295（第2部分）：405–411。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Klemke RL，Cai S，Giannini AL，Gallagher PJ，de Lanerolle P，Cheresh DA。有丝分裂原活化蛋白激酶对细胞运动的调节。细胞生物学杂志。1997;137:481–492. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Nguyen DH、Catling AD、Webb DJ、Sankovic M、Walker LA、Somlyo AV、Weber MJ、Gonias SL。肌球蛋白轻链激酶在Ras/ERK下游发挥作用，以整合素选择性方式促进尿激酶型纤溶酶原激活剂刺激细胞的迁移。细胞生物学杂志。1999;146:149–164. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Goldberg PL、MacNaughton DE、Clements RT、Minnear FL、Vincent PA。TGF-β1激活p38 MAPK可增加MLC磷酸化和内皮单层通透性。美国生理学杂志肺细胞分子生理学。2002;282：L146–L154。[公共医学][谷歌学者] 29Bogatcheva NV、Verin AD、Wang P、Birukova AA、Birukov KG、Mirzopoyazova T、Adyshev DM、Chiang ET、Crow MT、Garcia JG。福尔波酯增加牛肺内皮细胞的MLC磷酸化和肌动蛋白重塑，但不增加收缩。美国生理学杂志肺细胞分子生理学。2003;285：L415–L426。[公共医学][谷歌学者] 30Obara K，Ito Y，Shimada H，Nakayama K。冈田酸对犬基底动脉的舒张作用涉及PKCalpha的激活和Thr-9处肌球蛋白轻链的磷酸化。欧洲药理学杂志。2008;598:87–93.[公共医学][谷歌学者] 31Al-Nedawi K，Meehan B，Micallef J，Lhotak V，May L，Guha A，Rak J.通过来自肿瘤细胞的微泡进行致癌受体EGFRvIII的细胞间转移。自然细胞生物学。2008;10:619–624.[公共医学][谷歌学者] 32Skog J、Wurdinger T、van Rijn S、Meijer DH、Gainche L、Sena-Esteves M、Curry WT，Jr、Carter BS、Krichevsky AM、Breakefield XO。胶质母细胞瘤微泡运输促进肿瘤生长的RNA和蛋白质，并提供诊断生物标记物。自然细胞生物学。2008;10:1470–1476. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Valenti R、Huber V、Iero M、Filipazzi P、Parmiani G、Rivoltini L.肿瘤释放的微泡作为免疫抑制的载体。癌症研究。2007;67:2912–2915.[公共医学][谷歌学者] 34Bravo-Cordero JJ、Marrero-Diaz R、Megias D、Genis L、Garcia-Grande A、Garcia MA、Arroyo AG、Montoya MC。MT1-MMP的促侵袭活性受一种新的Rab8-依赖性胞外途径调节。Embo J。2007;26:1499–1510. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35.Steffen A、Le Dez G、Poincloux R、Recchi C、Nassoy P、Rottner K、Galli T、Chavrier P。MT1-MMP依赖性侵袭受TI-VAMP/VAMP7调节。当前生物量。2008;18:926–931.[公共医学][谷歌学者] 36Freyssinet JM.细胞微粒：它们有什么害处或好处？血栓止血杂志。2003;1:1655–1662.[公共医学][谷歌学者] 37.范登·艾因德SM、范登·霍夫MJ、鲁特林斯佩格CP、范·海尔德WL、亨弗林ME、维梅杰·科尔斯C、舒特B、博格斯M、拉梅克尔FC。肌管形成需要在细胞-细胞接触区瞬时表达磷脂酰丝氨酸。细胞科学杂志。2001;114:3631–3642.[公共医学][谷歌学者] 38Elliott JI、Surprenant A、Marelli-Berg FM、Cooper JC、Cassady-Cain RL、Wooding C、Linton K、Alexander DR、Higgins CF。淋巴细胞中膜磷脂酰丝氨酸分布作为非凋亡信号机制。自然细胞生物学。2005;7:808–816.[公共医学][谷歌学者] 39Andresen BT、Rizzo MA、Shome K、Romero G。磷脂酸在Ras/MEK/Erk信号级联调节中的作用。FEBS信函。2002;531:65–68.[公共医学][谷歌学者] 40Hong JH、Oh SO、Lee M、Kim YR、Kim DU、Hur GM、Lee JH、Lim K、Hwang BD、Park SK。磷脂酶D1通过形成磷脂酸增强溶血磷脂酸诱导的ERK磷酸化。生物化学与生物物理研究委员会。2001;281:1337–1342.[公共医学][谷歌学者] 41Taraboletti G、D’Ascenzo S、Borsotti P、Giavazzi R、Pavan A、Dolo V。内皮细胞脱落基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9和MT1-MMP作为膜囊泡相关成分。《美国病理学杂志》。2002;160:673–680. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42Ratajczak J、Miekus K、Kucia M、Zhang J、Reca R、Dvorak P、Ratajdzak MZ。胚胎干细胞衍生的微泡对造血祖细胞重新编程：mRNA和蛋白质水平传递的证据。白血病。2006;20:847–856.[公共医学][谷歌学者] 43Yung Y、Yao Z、Aebersold DM、Hanoch T、Seger R。MEK1和PTP-SL对ERK1b的调节发生改变，ERK1b对Elk1的磷酸化发生改变是由于ERKs调控C末端序列的取消所致。生物化学杂志。2001;276:35280–35289.[公共医学][谷歌学者] 44Manicourt DH，Lefebvre V.基质金属蛋白酶和作用于蛋白聚糖、酪蛋白或明胶的其他蛋白酶的分析。分析生物化学。1993;215:171–179.[公共医学][谷歌学者] 45.Hoover H，Muralidharan-Chari V，Tague S，D’Souza-Schorey C.研究ADP-核糖基化因子6在肿瘤细胞侵袭和细胞外信号调节激酶激活中的作用。方法酶制剂。2005;404:134–147.[公共医学][谷歌学者] 46Raposo G、Nijman HW、Stoorvogel W、Liejendekker R、Harding CV、Melief CJ、Geuze HJ。B淋巴细胞分泌抗原呈递小泡。《实验医学杂志》。1996;183:1161–1172. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
