成年早期视网膜自发胶质钙波的形成

自发性胶质细胞钙²⁺视网膜中出现波动

胶质钙²⁺用共焦显微镜在隔离视网膜的内表面进行监测，其中Ca²⁺信号在Müller细胞终末和星形胶质细胞体和突起中成像。胶质细胞表现出钙的自发（即非刺激）波²⁺在单元格之间传播的提升(图1A类; 补充电影S1，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。这些波遵循类似于诱发波的同心扩展模式，从起始点开始扩展4-8秒，然后在接下来的5-10秒内收缩。

在单独的窗口中打开

图1。

自发性细胞间胶质细胞钙²⁺孤立视网膜中的波从Müller细胞开始传播。A类，自发波是从视网膜上的多个点发起的。这个假彩色比图像将60秒的视频压缩了最大ΔF类/F类投影。在60 s期间产生了15个自发波。B–D类，一个Ca²⁺放大倍率较高时显示的波形。像我们观察到的所有波一样，该波在Müller细胞中启动并传播，但不是星形胶质细胞。B类，波开始前的钙荧光图像（平均5帧）。区域1-4是参与波的Müller细胞。红色区域是星形胶质细胞。C，亮度增加（ΔF类/F类)在随时间绘制的每个区域中。虽然波在星形胶质细胞的胞体中传播²⁺]_我在牢房里没有上升。D类，A最大ΔF类/F类波浪期间框架的投影（与B类)，显示细胞中含有[Ca²⁺]_我增加。

自然钙²⁺波只通过Müller细胞传播，未观察到向星形胶质细胞传播。在高倍镜下记录的15个波中，这些波总是在Müller细胞中产生，并在没有Ca的情况下通过星形胶质细胞传播²⁺星形胶质细胞升高(n个=8波）(图1B–D类). 然而，我们不能排除星形胶质细胞偶尔也经历钙离子的可能性²⁺增加。波以24.3±1.7μm/s的速度传播，最大直径为68.4±2.2μm(n个=4只动物的18波）。

自发波随年龄增长而增加

自发波的产生频率取决于动物的年龄(图2A类). 频率等于每分钟1.0毫米²在120日龄的动物中，每毫米每分钟0.27倍²20日龄动物的价值。这些波频率的测量是在视网膜在灌注室中放置20–70分钟后进行的。

在单独的窗口中打开

图2。

自发钙的频率²⁺波浪的产生随着年龄的增长而增加。A类在不同年龄的动物中自发波的平均频率（从成像开始后20到70分钟计数）。频率随年龄增长而增加(第页< 0.05).B类，每个年龄段出现高初始波频率（定义为成像前6分钟内出现3个或更多波）的动物比例。条形图上方的数字表示每个箱子中的动物总数。C，在大鼠中观察到的最高波动率随大鼠年龄增加而增加(第页< 0.005;R（右）²= 0.33). 每个点代表一只动物。D类，暴露在高光照下1-4个月并没有增加大鼠显示高初始波频率的比例。

老年动物的一些视网膜区域在视网膜置于灌注室后立即显示出非常高的自发波生成频率。这种高频波产生在～15分钟内衰减（参见图4A类). 15分钟后达到稳定的基线波生成速率，并且与在视网膜中没有发生高频波生成的区域中看到的速率相似。视网膜显示初始高波生成率的概率随着动物年龄的增长而增加(图2B类). 记录第一分钟测得的最大波速也随着动物年龄的增加而增加(图2C). 在12个月大的动物视网膜中，频率为每分钟56±24波/mm².

在单独的窗口中打开

图4。

自然钙²⁺波的产生依赖于P2受体和细胞外ATP。A类、苏拉明（100μ米; P2R拮抗剂）降低自发波的频率。控制值（ctrl）和苏拉明值之间的差异叠加在高初始波发生率的衰减上。自然钙²⁺波数以1分钟为间隔进行分类，每次试验均按试验第一分钟内的波数进行标准化。B类、苏拉明（100μ米)和apyrase（100 U/ml；ATP降解酶），但不是TTX（200 n米)DL-AP7（100μ米; NMDAR拮抗剂）、卡宾诺酮（100μ米; 缝隙连接阻滞剂）或腺苷受体拮抗剂混合物（100n米DPCPX，1μ米MRS 1191，1μ米MRS 1706，1μ米ZM 241385）降低了自发波的产生频率。自成像开始后3至6分钟，对自发波计数进行平均，并将其归一化为第一分钟内的波计数。开始成像后1分钟添加药物*第页< 0.05.

因为胶质细胞钙的比率²⁺波浪的产生随着年龄的增长而增加，我们推测波浪的出现可能是累积损伤的结果，可能是由于暴露于光照所致。为了测试这一点，我们将大鼠暴露在1000勒克斯的环境光（约为正常光照水平的30倍）下1-4个月，假设这会加速波浪的发展。然而，我们发现光处理对波的入射没有影响，这表明自发Ca的产生²⁺波浪不是由于光照射引起的视网膜损伤所致(图2D类). 事实上，在光照动物中有减少波生成的趋势，但通过双向方差分析，光照与年龄之间的交互作用并不显著(第页= 0.07).

自发波通过ATP的释放传播

人工诱发胶质细胞钙²⁺视网膜中的波通过两种机制在细胞间传播。星形胶质细胞向星形胶质细胞的增殖是由小分子扩散介导的（可能是IP_三;Venance等人，1997年)通过缝隙连接，而星形胶质细胞到Müller细胞和Müler细胞到Möller的增殖是通过ATP的释放及其对P2嘌呤能受体的作用介导的(纽曼，2001).

我们询问自发波通过米勒细胞的传播是否也由ATP释放介导。荧光素-萤光素酶-ATP化学发光法用于监测自发钙离子交换过程中ATP向细胞外空间的释放²⁺波浪生成。钙成像首次用于定位一只年龄较大的大鼠（175–325天）的分离视网膜的富含波的区域。然后在同一个波幅丰富的视网膜区域进行几分钟的ATP化学发光成像。我们观察到多个向外扩散的自发化学发光信号，表明ATP释放的自发波(图3). 自发ATP波的传播速度（22.0±2.1μm/s；n个=4波）与自发Ca的传播速度密切匹配²⁺波浪。ATP波的最大直径（85.3±3.1μm）略大于Ca波²⁺波浪。校准荧光素-荧光素酶化学发光图像，以确定视网膜表面ATP的绝对浓度。细胞外ATP峰值浓度等于2μ米在ATP释放自发波的中心。这比机械诱发波产生的ATP峰值水平小一个数量级(纽曼，2001). 这是合理的，因为机械诱发波的幅度大得多，直径也大得多。

在单独的窗口中打开

图3。

孤立视网膜中ATP释放的自发波。用荧光素-荧光素酶化学发光法观察视网膜自发钙高频率区域的ATP释放²⁺波浪。A类，中的化学发光图像x个,年坐标，显示其峰值处的自发ATP波。这张图片描绘了相同的自发波，如B类.B类,C，化学发光的线性扫描图像表示为亮度与时间的等高线图，显示在纵轴上。在这两个示例中，线条扫描（如中的红线所示A类)位于每个波的中间。像自发钙²⁺波，ATP波从一个中心点（在每个图形的中心/顶部）开始膨胀，然后收缩，总时间为8-15秒。

荧光素-萤光素酶化学发光结果表明，ATP以与自发Ca相匹配的空间模式释放²⁺波浪。为了测试ATP是否在波传播中起因果作用，我们阻断了ATP对胶质嘌呤能受体的作用。在老年大鼠（116-327天）的高初始波频率期间进行药理学实验。苏拉明（P2受体拮抗剂；100μ米)将自发波产生频率降低52±7%(n个=7视网膜）(图4A类,B类). 苏拉明具有非选择性作用，可能会阻断钙²⁺通过拮抗P2受体以外的机制产生波动。因此，我们用apyrase（一种选择性水解细胞外空间ATP的酶）阻断了ATP的作用。Apyrase（100 U/ml）将自发波的频率降低了95±4%(n个=4视网膜）(图4B类). 与苏拉明相比，安吡酶的更大作用可能反映了苏拉明对P2受体的不完全阻断。

我们还通过应用缝隙连接阻断剂卡雷诺酮来测试缝隙连接是否参与自发波的传播。卡宾诺酮（100μ米)不影响产生的自发波数量(n个=3视网膜）(图4B类)或者波的平均速度或直径（数据未显示），这表明缝隙连接在自发波的传播中没有发挥重要作用。这与自发波中缺乏星形胶质细胞的参与是一致的，因为视网膜星形胶质细胞之间的波传播是由缝隙连接介导的，而Müller细胞之间的传播则不是(纽曼，2001). 我们还应用TTX来确定神经元尖峰是否有助于自发波的产生。TTX（200 n米)不影响产生的自发波数量(n个=4视网膜）(图4B类). 此外，DL-AP7和(n个=5视网膜）（100μ米; NMDA受体拮抗剂）或腺苷受体拮抗剂混合物(n个=4视网膜）（100 n米A1的DPCPX，1μ米A2用ZM 241385_A类, 1 μ米A2的MRS 1706_B类、和1μ米A3受体的MRS 1191）对产生的自发波数量有任何影响(图4B类).

中所示的药理学实验图4在解剖后高频波产生的初始阶段进行。我们还对Ca进行了表征²⁺在解剖后20–70分钟，在稳定基线生成期间产生波，以确定这些波是否也通过ATP释放传播。在老年动物（265-294天）的对照实验中，Ca²⁺波的产生速率为0.74±0.43波/分钟/mm²(n个=3只动物）。添加apyrase（100 U/ml）完全消除了波的产生(n个=3只动物）；在总共35分钟的观察中，未发现任何波动。

ATP敏感性不随年龄增长而增加

我们推测，随着年龄的增长，胶质细胞ATP敏感性的增加可能是老年动物波发生频率增加的原因。为了验证这个假设，我们使用了3μ米不同年龄动物视网膜的ATP。ATP的应用总是产生Ca²⁺Müller细胞和星形胶质细胞增加，但我们发现这种增加的幅度与动物的年龄无关(n个=24只动物）(图5A类). 为了确保ATP反应不饱和，我们还在1μ米和0.3μ米.而Ca²⁺反应较小，在这些浓度下，我们没有发现年龄对反应幅度的影响（数据未显示）。结果表明，胶质细胞ATP敏感性的改变并不是老年动物自发波生成率增加的基础。

在单独的窗口中打开

图5。

ATP释放量（而非ATP敏感性）随年龄增长而增加。A类胶质细胞的ATP敏感性与年龄无关。3μ的浴缸应用米ATP产生Ca²⁺Müller细胞和星形胶质细胞的增加与动物的年龄无关。B–E类、机械刺激星形胶质细胞体细胞触发钙波²⁺和ATP。老年动物在诱发波期间释放的ATP量更大。B类，诱发Ca²⁺wave（最大亮度投影）。C，诱发ATP波（峰值直径处的单帧）。D类、Ca峰值²⁺老年大鼠诱发波的增加与青年大鼠无差异。E类老年大鼠诱发波ATP峰值浓度高于青年大鼠。差异显著(第页<0.05）从23秒到34秒。英寸D类和E类，钙的亮度测量²⁺荧光和ATP化学发光是整个微观场的平均值。F类，自生钙²⁺老年动物的波浪最大直径较大。每个时间点显示的直径是该时间达到的最大直径。每波分析时，年轻和老年大鼠之间的差异显著(第页<0.001）或每只动物(第页< 0.005).

老年动物的胶质细胞释放出更多的ATP

钙波传播涉及ATP释放和钙离子²⁺根据释放的ATP进行提升。自从加州²⁺ATP引起的升高不随年龄增长而增加(图5A类)，我们推测在Ca²⁺波传播可能随年龄增长而增加。我们通过唤起Ca来测试这一点²⁺在来自20日龄或320日龄动物的视网膜中具有机械刺激的波。我们交替进行胶质细胞钙显像试验²⁺使用Fluo-4(图5B类)用荧光素酶成像ATP释放(图5C). 虽然Ca峰值²⁺诱发波的增加在20至320天内没有变化(图5D类)，诱发波产生的ATP峰值浓度在老年动物中显著高于年轻动物(图5E类). 细胞间胶质细胞钙²⁺波，ATP以再生方式释放(纽曼，2001). 年长和年幼动物之间ATP信号的差异可能代表再生ATP释放的增加，因为这种差异在刺激后的5到20秒之间增长(图5E类). 与老年动物体内ATP释放量增加相一致，我们还发现老年动物的自发波达到最大直径（137-158天；n个=18波），比幼年动物（40–63天；n个=21波）(图5F类).

自发波导致血管收缩

人工诱发胶质细胞钙²⁺波浪和Ca²⁺笼状化合物光解在单个胶质细胞中诱发的增加，可以扩张和收缩视网膜中的血管(Metea和Newman，2006年). 我们研究了自发生成的钙²⁺波浪对视网膜血管也有类似的影响。血管和胶质细胞钙²⁺同时在老年动物（139–224天）的视网膜中监测钙的高频率²⁺波浪生成。在三个实验中的三个实验（每个实验来自不同的动物），自发波从小动脉的一侧传播到另一侧，血管显示出与波同步的收缩(图6，补充电影S2，在线阅读网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。在每种情况下，Ca²⁺波从距离血管至少20μm处开始，在收缩开始前至少两秒。收缩总是从Ca所在的同一视频帧开始²⁺波浪越过了船。血管收缩了基线直径的24%、11%和9%。这些收缩发生在自发波区域内的一小段血管上，持续时间仅为胶质细胞钙²⁺高程。接近小动脉但未传播过血管的钙波不会引起血管收缩(n个=7只动物的41波）。没有观察到血管扩张，正如预期的那样，因为我们的林格氏管充满了95%的氧气，这有利于血管收缩而不是扩张(Gordon等人，2008年;Mishra等人，2008年).

在单独的窗口中打开

图6。

自然钙²⁺波浪引起小动脉收缩。A类，共聚焦荧光图像显示自发Ca²⁺wave（最大投影图像）。胶质细胞被Fluo-4标记，小动脉被右旋糖酐-荧光素填充，以显示管腔。B类，小动脉与自发钙同步收缩²⁺波浪。大Ca²⁺红色和绿色区域的上升代表着一个自发波在血管中传播。加利福尼亚州²⁺信号是在A类以及在蓝线处测量的血管直径A类.