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癌细胞。作者手稿；PMC 2011年7月28日发布。
以最终编辑形式发布为：
癌细胞。2007年4月；11(4): 335–347.
数字对象标识：2016年10月10日/j.ccr.2007.02.006
预防性维修识别码：PMC3145406型
NIHMSID公司：尼姆斯310033
PMID：17418410

HIF-2α通过增强c-Myc转录活性促进缺氧细胞增殖

约翰·D·戈尔丹,1,2 杰西卡·贝尔托夫特,1,三 胡成军,1,2 J.阿兰·迪尔,1,2和M.塞莱斯特·西蒙1,2,4,5
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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摘要

HIF-2α促进von Hippel-Lindau(VHL（甚高频）)缺陷性肾透明细胞癌（RCC）肿瘤发生，而HIF-1α抑制RCC生长。由于HIF-1α拮抗c-Myc功能，我们假设HIF-2α可能增强c-Myc活性。我们在这里证明HIF-2α促进缺氧RCC和多个其他细胞系的细胞周期进展。这与c-Myc启动子结合增强、激活和抑制靶基因的转录效应以及与Sp1、Mizl和Max的相互作用有关。最后，HIF-2α增强了原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的c-Myc转化。c-Myc活性增强可能有助于HIF-2α介导的肿瘤进展VHL（甚高频）肿瘤抑制因子，并影响缺氧肿瘤细胞的行为。

介绍

低氧（O2)在实体瘤中经常出现这种水平，缺氧应激反应对疾病的自然史有重要影响(Pugh和Ratcliffe，2003年). 肿瘤的生长、血管生成、侵袭和转移均受缺氧刺激基因表达的调节，主要由缺氧诱导因子（HIFs）介导。HIF作为异二聚体发挥作用，其中O2-不稳定的α亚基与稳定的β亚基（也称为ARNT）形成复合物，并在整个基因组中结合缺氧反应元件（HRE）。两个α亚基，HIF-1α和HIF-2α，已被证明可以增加缺氧细胞中的靶基因转录。当与ARNT复合时，它们激活编码糖酵解酶、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-2和红血球蛋白的基因(胡等，2003;塞门扎，2003年). HIF可以通过假定的转录靶点（如细胞周期蛋白D1）改变细胞周期进程(Baba等人，2003年)p21和p27的间接调制(加德纳等人，2001年;Green等人，2001年;Koshiji等人，2004年).

虽然低氧诱导转录的最初特征主要集中在HIF-1α，但HIF-2α最近被证明调节独特的基因和生理功能(Covello等人，2006年;胡等，2003;Tian等人，1998年). HIF-α亚单位的表达谱不同，HIF-1α普遍表达，HIF-2α仅限于内皮、肾脏、心脏、肺和小肠(Ema等人，1997年;Tian等人，1997年;Wiesener等人，2003年). HIF-1α独特地激活糖酵解酶基因，而HIF-2α优先激活VEGF、转化生长因子-α（TGFα）、赖氨酰氧化酶、Oct4和Cyclin D1(Baba等人，2003年;Covello等人，2006年;Erler等人，2006年;Gunaratnam等人，2003年;胡等，2003;Wang等人，2005年). 有针对性地中断HIF-2型不同小鼠品系中的α基因座导致不同的表型，包括心动过缓和血管缺陷导致的胚胎致死、肺成熟受损导致的围产期致死、多器官衰竭和线粒体功能障碍导致的胚胎和出生后致死(Compernolle等人，2002年;Peng等人，2000年;Scortegagna等人，2003年;Tian等人，1998年). 每种情况都与由心脏和血管缺陷引起的E10.5致死率有很大不同HIF-1型α破坏(Carmeliet等人，1998年;Iyer等人，1998年;Ryan等人，1998年).

HIF-2α（而非HIF-1α）促进RCC异种移植模型中的肿瘤生长。在表达pVHL的786-O RCC细胞中过度表达稳定的HIF-2α可将异种移植生长恢复到亲本水平VHL（甚高频）空单元格(Kondo等人，2003年;Kondo等人，2002年;拉瓦尔等人，2005年)而稳定HIF-1α的过度表达抑制肿瘤生长(Maranchie等人，2002年;拉瓦尔等人，2005年). 对VHL病患者肾脏癌前病变的研究也表明HIF-2α在异型增生细胞的转化中起作用，因为HIF-2β的表达随着异型增生程度的增加而增加，而HIF-1α的表达则减少(Mandriota等人，2002年;拉瓦尔等人，2005年). HIF-2α似乎在促进肿瘤发生方面也具有更广泛的作用。ES细胞产生的皮下畸胎瘤，HIF-2αcDNA“敲入”到HIF-1型α基因座的质量是WT对照组的四倍，主要是由于增殖增加(Covello等人，2005年). 这不仅仅是HIF-1α丢失的结果Hif-1型α−/−ES细胞源性畸胎瘤未能显示出持续的生长优势(Carmeliet等人，1998年;Hopfl等人，2002年;Ryan等人，1998年). 最近一项关于神经母细胞瘤的研究表明，HIF-2α在长期轻度缺氧条件下保持稳定，这增加了一种有趣的可能性，即即使在经历轻微缺氧应激的肿瘤中，HIF-1α也可能促进血管生成(Holmquist-Mengelbier等人，2006年).

中度缺氧（0.5%~3%O2)通过HIF-1α依赖性增加细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CKI）p21和p27的表达，可导致细胞周期阻滞(加德纳等人，2001年;Goda等人，2003年;Green等人，2001年). p21和p27不是HIF的直接靶点；HIF-1α对原癌基因c-Myc的抑制及其启动子转录抑制的缓解导致其表达改变(Koshiji等人，2004年;Koshiji等人，2005年;Mack等人，2005年). HIF-1α可能通过改变其协同因子之一Sp1的相互作用来拮抗c-Myc活性(Koshiji等人，2004年;Koshiji等人，2005年). 目前还没有关于HIF-1α对细胞周期进程影响的公开数据。

c-Myc是一种控制G1-S细胞周期转换的碱性螺旋-环-螺旋/亮氨酸拉链（bHLH/LZ）转录因子，在许多人类肿瘤中过表达(Adhikary和Eilers，2005年;尼尔森和克利夫兰，2003年). c-Myc通过与保守E盒（CACGTG）及其结合伙伴Max结合来激活生长促进基因的转录，如细胞周期蛋白D2、鸟氨酸脱羧酶和E2F1，并通过与转录起始元件（Inr）结合来抑制多个基因的表达，尤其是p21和p27在与Max和Sp1或Miz1的复合体中(Coller等人，2000年;Fernandez等人，2003年). 由于c-Myc通常不稳定并在低水平表达，它与拮抗转录因子（如Mad、Mnt和Mga）竞争Max结合。有趣的是，Mad/Max复合物通过E盒抑制表达，而Miz1在与不含c-Myc的Inr结合时起转录激活剂的作用(Adhikary和Eilers，2005年).

鉴于HIF-1α和HIF-2α可能对肾肿瘤生长有相反的作用，并且HIF-1β对c-Myc的抑制作用已建立(Koshiji等人，2004年;Koshiji等人，2005年)，我们假设HIF-2α实际上促进c-Myc转录活性。这将导致细胞周期进程加快和肿瘤生长增加。我们检测了786-O和RCC4 RCCs的pVHL表达恢复、胚胎上皮细胞（ECs）和NIH3T3细胞，并观察到HIF-2α介导的c-Myc活性增强和细胞周期进展。作为对照，还评估了HIF-1α在每种情况下的作用，HIF-1β表现出预期的增殖抑制作用。HIF-2α也在肿瘤发生中起作用，促进c-Myc/RasV12G诱导的原发性MEF转化。

结果

HIF-2α促进细胞周期进展，而HIF-1α抑制细胞周期进展

为了研究HIF-α亚单位对肿瘤细胞周期进展的差异影响，我们选择了主要表达HIF-1α（HCT116结肠癌细胞）或HIF-2α（WT8，786-O RCC细胞表达pVHL）的细胞系。我们证实了已发表的关于HIF-α亚基在这些细胞中的表达和定位的数据(Koshiji等人，2004年;Maxwell等人，1999年). 正如预期的那样，HCT116细胞在核部分表达HIF-1α，而WT8细胞则不表达，即使长时间接触射线胶片。缺氧WT8细胞中HIF-2α的表达主要在细胞核部分。HCT116细胞中也检测到HIF-2α，但其水平约为WT8细胞的10%(图1A). 为了将这些数据与转录靶点相关联，从生长于21%或0.5%O的细胞中提取mRNA224、48和72小时，并通过定量实时PCR（QRT-PCR）进行分析。正如预期的那样，两种细胞株都增加了HIF-1α/HIF-2α共同靶点VEGF的表达(补充图1A)然而，只有HCT116细胞显示HIF-1α特异性靶向磷酸甘油酸激酶（PGK；补充图1B;胡等，2003)只有WT8细胞增加了HIF-2α特异性靶点的水平10月4日(补充图1C;Covello等人，2006年). 值得注意的是，虽然HCT116细胞表现出基础Oct4表达，但这些细胞中缺氧诱导HIF-2α对转录水平没有进一步影响，可能是由于HIF-2蛋白水平较低。因此，我们得出结论，HIF-1α是HCT116细胞中的功能性HIF-α亚单位，HIF-2α是WT8细胞中的职能性HIF--α亚单位。

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HIF-1α和HIF-2α在HCT116和WT8细胞中的差异表达与缺氧条件下细胞周期的差异进展相关。答：。在0.5%O下孵育4小时后，HCT116（“FICT”）和WT8细胞中HIF-α表达的蛋白质印迹2显示HIF-α亚基的差异表达。星号表示背景波段。Akt和Creb免疫印迹评估负荷和细胞分离效率；Akt存在于细胞核和细胞质中，而Creb只存在于细胞核中。B。HCT116和WT8细胞在21%或0.5%O浓度下生长的代表性BrdU掺入曲线248小时。C、。缺氧24、48和72小时后HCT116和WT8细胞中BrdU掺入变化总结。3次实验的平均结果，误差条±1 SEM，*p<0.05，**p<0.01。D。在常压（N）或缺氧（H）条件下通过连续细胞计数测量增殖；数据来自一个有代表性的实验。误差±1 SD。

鉴于这两种细胞系表现出不同的HIF-α表达和活性，我们通过BrdU掺入评估了它们的细胞周期进展。HCT116细胞在缺氧条件下生长时，细胞在G1期积累，S期细胞百分比相应降低。典型FACS图(图1B，上部面板）和三个实验的总结(图2C，上部面板）。缺氧48小时或72小时后，这些变化具有统计学意义（p<0.05）。相反，当WT8细胞在0.5%的氧浓度下生长时224小时、48小时（p<0.01）或72小时后，观察到S期细胞百分比显著增加，G1期细胞百分比下降（p<0.05）。同样，两个代表性的FACS图(图1B，下部面板）和摘要数据(图1C，下部面板）。在常氧或缺氧条件下，通过连续细胞计数测量与增殖相关的细胞周期变化(图1D)缺氧时，WT8细胞数量增加，HCT116细胞数量减少。这些影响在早期最为明显，在培养6天后由于汇合作用而减弱。因此，当HIF-1α和HIF-2α分别表达时，它们对细胞周期进展和增殖具有相反的影响，且在长时间过程中保持稳定，HIF-2β促进这两个过程。

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HIF-1α和HIF-2α对细胞周期进程具有拮抗作用。答：。在0.5%氧浓度下24小时后，WT8细胞中HIF-1α（1.1，1.2，1.3）或HIF-2α（2.2）稳定过度表达HIF-α亚单位2.B。缺氧24小时后过度表达HIF-1α或HIF-2α的WT8细胞中BrdU掺入变化总结。至少3次实验的平均结果，误差条±1 SEM，*p<0.05，**p<0.01。C、。在常压（N）或缺氧（H）条件下通过连续细胞计数测量增殖；数据来自一个有代表性的实验。误差±1 SD。D。用空载体（p1，p2）、抗HFF-1α（142，144）或HIF-2α（241，242）的shRNA转导的pVHL挽救的RCC4细胞中HIF-α亚单位的表达2.E.公司。HIF-1α或HIF-2α基因敲除克隆的增殖，在常氧（N）或缺氧（H）条件下通过连续细胞计数测量；数据来自一个有代表性的实验。误差±1 SD。

考虑到这些实验是在不同组织来源的肿瘤细胞系中进行的，观察到的效果可能是HIF非依赖性缺氧反应的结果，或者是组织特异性对缺氧反应的差异2剥夺。因此，我们使用经过工程设计的WT8细胞稳定地过度表达不断增加的HIF-1α（称为“1.1”、“1.2”和“1.3”）或HIF-2α（称之为“2.2”）(图2A). 在0.5%氧浓度下生长后，评估这些细胞的细胞周期进展224小时。与HCT116细胞中的观察结果一致，在WT8细胞中，HIF-1α过表达恢复了低氧诱导的G1期细胞数量增加和S期细胞数量减少（p<0.05），而HIF-2α过表达继续提高了S期细胞的比例(图2B; p<0.01）。对这些细胞的增殖也进行了评估，发现与缺氧诱导的细胞周期变化有关(图2C). 通过联合表达HIF-1α和HIF-2α，我们证实HIF-1β诱导WT8细胞的细胞周期阻滞，消除了它们对缺氧表现出组织特异性细胞周期反应的可能性。为了进一步支持这些数据，我们使用pVHL拯救的RCC4 T3-14细胞系，该细胞同时表达HIF-1α和HIF-2α(胡等，2003)用靶向HIF-1α或HIF-2α或空载体的shRNAs稳定转导（Lum等人。，提交的手稿). 通过免疫印迹评估HIF-α亚基的表达，显示HIF-1α基本上完全敲低，HIF-2α敲低>75%(图2D). 通过测量HIF-α共享和独特靶点VEGF、PGK和Oct4的表达，证实了敲除的疗效(补充图2A). 接下来，在缺氧0、24或48小时后测量BrdU掺入量。虽然用空载体转导的克隆显示S期细胞百分比逐渐下降，但HIF-2α敲除的克隆显示出更急剧的下降。相反，pVHL通过HIF-1α敲除拯救RCC4细胞，显示S期细胞百分比增加(补充图2B). 当进行细胞计数时，在缺氧条件下，转染载体的细胞中只观察到轻微的增殖减少(补充图2C)而HIF-1α敲除后显著增加，HIF-2α敲除时显著减少。所有克隆在常氧条件下均无明显增殖(图2E). 因此，HIF-2α以一种剂量依赖性方式被HIF-1α拮抗的方式促进细胞周期进展，表明这两种HIF-α亚单位作用于同一途径。这些对RCC4增殖的影响尤其显著，因为选择性敲除每个HIF-α会破坏缺氧增殖的平衡效应，从而有效地增强缺氧增殖（仅在HIF-2α存在的情况下）或抑制缺氧增殖（只有HIF-1α）。该分析与肾细胞癌的发展尤其相关，因为大多数人类肾肿瘤在肿瘤进展期间表现出HIF-1α丢失，同时维持HIF-2α(Mandriota等人，2002年;拉瓦尔等人，2005年).

HIF-2α以c-Mye依赖方式增强c-Myc靶基因的表达

为了研究c-Myc在这些细胞周期变化中的作用，我们评估了c-Myc靶点p21和p27（被c-Myc抑制）以及Cyclin D2和E2F1（被c-Myc激活）的低氧表达。虽然其他因素也调节这些基因，但我们将其称为“c-Myc靶点”，以区别于PGK和Oct4等直接HIF靶点。在上述条件下，我们观察到缺氧HCT116细胞中p21和p27 mRNA表达增加，与c-Myc的抑制减弱一致。相反，低氧WT8细胞表现出p21和p27 mRNA表达降低，与c-Myc增强的抑制作用一致(图3A). 我们观察到对c-Myc激活靶点的相反影响：缺氧HCT116细胞中的细胞周期蛋白D2和E2F1 mRNA水平降低，缺氧WT8细胞中的升高(图3B). 这些结果通过21%O培养细胞提取物的免疫印迹试验得到证实2或0.5%O248小时(图3C). 虽然数据显示了相对细微的表达变化，但它们与通常观察到的c-Myc一致(Bouchard等人，1999年;Coller等人，2000年). 为了证实HIF-1α和HIF-2α对c-Myc靶基因的拮抗作用，还在过表达HIF-1α和HIF-2α的稳定WT8系中评估了p27和细胞周期蛋白D2的表达。与细胞周期分析一致，HIF-1α表达增加与p27诱导和Cyclin D2抑制的剂量依赖性增加相关，而HIF-2α表达增加则与p27表达减少和Cycrin D2表达增加相关，正如在亲本细胞系中观察到的那样(图3D).

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表达HIF-1α或HIF-2α的肿瘤细胞株对细胞周期调节器表现出不同的缺氧效应。A.在0.5%氧浓度下24、48或72小时后，HCT116和WT8中c-Myc抑制靶点p21和p27的表达2。QRT-PCR测量的结果和4个实验的平均值，误差为±1 SEM。如文中所述，表达HIF-1α的HCT116细胞和表达HIF-2α的WT8细胞对缺氧的反应与c-Myc靶表达相反。B。如上所述，c-Myc激活的靶点Cyclin D2和E2F1在HCT116和WT8中的表达。C、。缺氧48小时后HCT116和WT8中c-Myc靶蛋白表达的Western blot分析。D。0.5%O2下24小时后过度表达HIF-1α或HIF-2α的WT8细胞中c-Myc靶点的表达。E.公司。HCT116和WT8缺氧48小时后，通过CDK2 IP评估p21和p27与CDK2相互作用的变化。

为了进一步扩展这些观察结果，对另外两个模型系统进行了分析。首先，我们测量了上述RCC4细胞系中p27和细胞周期蛋白D2的mRNA和蛋白质变化。在空载体转导的细胞中，这些靶点的mRNA或蛋白水平几乎没有变化。在HIF-1α敲除的克隆中，观察到p27减少，Cyclin D2增加，而在HIF-2α敲除克隆中，p27增加，Cycrin D2减少(补充图2E、2F). 这些发现与上述细胞周期变化相关，尽管在载体转导的细胞中发现S期百分比略有下降，但c-Myc靶点没有变化。这可能是严格缺氧水平（0.5%O2)用于本研究。其次，为了使用相对未分化且不太可能具有人类肿瘤细胞系突变负荷的特定遗传系统，我们生产了胚胎上皮细胞（EC；Mansfield等人，2005年)从第8.5天开始，含有靶向缺失的胚胎Hif公司-1α (Carmeliet等人，1998年)或Hif公司-2α (Compernolle等人，2002年). 共分析了六条线，其中两条线Hif公司-1α和2Hif公司-2α空行，每个行有一个WT同窝控件。显示了来自每个基因型的一个代表性细胞系的结果。首先，确认HIF-α表达和靶基因诱导(补充图3A、3B). 接下来，我们测量了c-Myc靶点p27和细胞周期蛋白D2的mRNA表达。在低氧WT细胞系中未检测到p27的变化，而在仅表达HIF-1α的低氧细胞中p27 mRNA水平升高，而在只表达HIF-2α的细胞中p27mRNA水平降低(补充图3C，上部面板）。对于细胞周期蛋白D2，我们观察到所有表达HIF-2α的细胞系（即WT或Hif公司-1α−/−)缺氧时mRNA表达增加，而只有Hif公司-2α−/−细胞周期蛋白D2 mRNA水平下降(补充图3C，下部面板）。Western blot分析证实了观察到的mRNA变化(补充图3D). 因此，在多细胞系统中观察到持续的HIF-α介导的c-Myc影响细胞周期调节因子的调节。

由于c-Myc的生物效应是通过影响G1-S相变的多种因素的协调调节来介导的，因此在48小时对缺氧HCT116和WT8细胞进行细胞周期素依赖性激酶2（CDK2）免疫沉淀（IP），并测试共沉淀p21和p27。我们观察到缺氧HCT116细胞中与CDK2相关的p21水平显著增加，而p27的变化较小。然而，应该注意的是，HCT116细胞表达的p21水平高于p27水平。直接相反，在缺氧WTS细胞中，p27与CDK2的关联几乎完全消失，而检测到最小的p21(图3D和数据未显示）。因此，c-Myc靶点表达的变化与CDK2复合物成分的更显著差异相关，这与上述观察到的缺氧对细胞周期进展的影响一致。

数据表明HIF-α对细胞周期进展的影响与c-Myc靶基因表达之间存在相关性。为了确认基因表达和细胞周期变化是HIF-α亚单位缺氧激活的直接结果，并测试c-Myc的需求，用抗HIF-1α、HIF-2α和c-Myc或对照的siRNA转染HCT116和WT8细胞。siRNA。每个siRNA的靶基因敲除率均超过60%(图4A). c-Myc敲除有时与HIF-1α或HIF-2α表达减少相关。我们认为这是c-Myc基因敲除的直接结果，因为它是以剂量依赖的方式发生的，并且有两个单独的siRNAs对抗c-Myc（数据未显示）。缺氧20小时时，对照siRNA未改变HIF对p27的影响(图4B). 当用抗HIF-1α的siRNA处理时，缺氧HCT116细胞未能诱导p27 mRNA，而当用抗HIF-2α的siRNA处理时，WT8细胞不再表现出p27表达下降。最后，c-Myc siRNA导致p27 mRNA水平升高，而缺氧对两种细胞类型均无影响。同样，在HIF-1αsiRNA处理的缺氧HCT116细胞中，细胞周期蛋白D2水平没有降低，或在HIF-2αsiRNA治疗的缺氧WT8细胞中，Cyclin D2水平也没有升高。此外，当缺氧48小时后用BrdU掺入法检测细胞时，HCT116中HIF-1α和WT8中HIF-2α的敲除消除了缺氧对细胞周期进展的影响(图4D). 这些数据表明，HIF-1α和HIF-2α是改变缺氧细胞周期进程和以c-Myc依赖方式调节c-Myc靶基因表达所必需的。

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HIF-α对p27和细胞周期蛋白D2水平的影响需要c-Myc。答：。Western blot分析显示siRNA抑制HCT116和WT8细胞中HIF-1α（H1）、HIF-2α（H2）和c-Myc（M）的表达，以及荧光素酶控制（c）。B。QRT-PCR分析显示，在0.5%氧浓度下，siRNA处理细胞20小时后p27表达2用QRT-PCR从4个实验中测量的结果显示，误差为±1 SEM。C、。QRT-PCR分析显示细胞周期蛋白D2在siRNA处理的细胞中的表达。上述测量结果。D。用BrdU掺入法测量21%O浓度下用对照或HIF-1αsiRNA处理的异步HCT116细胞和用对照或HIF-2αsiRNA治疗的WT8细胞的细胞周期进展2（N） 或0.5%O2（H） 48小时。显示了3次实验的平均结果，误差条±1 SEM，*p<0.05

HIF-α亚单位调节c-Myc启动子结合以及与Sp1、Miz1和Max的相互作用

为了阐明HIF-α亚单位调节c-Myc活性的机制，我们通过染色质免疫沉淀（ChIP）检测了缺氧对HCT116和WT8细胞中c-Myc启动子占用的影响。对c-Myc、HIF-1α、HIF-2α和p53进行ChIP检测，并进行QRT-PCR分析。数据表示为具有特定抗体的IP与同型匹配对照的背景信号之间的平均倍差。结果平均来自四个单独的实验，分别进行缺氧处理、ChIP和PCR分析。在这些实验中，用Inr处的引物分析了3个c-Myc抑制的靶标（p21、p27和p15），并分析了3个c-Myc激活的靶标（ODC、细胞周期蛋白D2和E2F1），引物指向它们的E盒元件，分别以碱基−1158、282（内含子1中）和−354为中心。在所有病例中，在缺氧条件下，正常毒性HCT116细胞检测到的c-Myc ChIP信号降低至接近背景水平。当在WT8细胞中进行c-Myc ChIP时，在缺氧细胞中观察到来自所有受试启动子的信号显著增加(图5A). 以前的研究已经证明HIF-1α与p21和MutSα的Inr结合(Koshiji等人，2004年;Koshiji等人，2005年). 我们还检测到HIF-1α与HCT116细胞中的p21 Inr和VEGF HRE（中心位于碱基-968）的结合，以及HIF-2α与WT8细胞中相同位点的结合。然而，HIF-α亚单位均未与任何其他测试的c-Myc DNA结合区域结合(补充图4A、4B). 这些数据表明，HIF-2α对c-Myc调节基因的影响与c-Myc与其启动子结合水平的增加有关，但c-Myc靶点的缺氧调节不需要HIF-2 a-DNA结合。为了证实每个HIF-α亚基对等基因细胞系统中c-Myc启动子结合的影响，我们在HEK293细胞中重复了这一分析，该细胞通过多西环素诱导表达了HIF-亚基的Myc标记的正常毒性稳定的双脯氨酸突变体（DPM）(补充图5A;胡等，2003). 如前所述，HIF-1α导致c-Myc DNA结合减少，HIF-2α导致c-Myc DNA结合增加(补充图5B). 类似地，Myctag IPs（针对HIF-α亚单位）显示HIF-βDNA与p21 Inr和VEGF HRE结合，但没有其他检测位点(补充图5C). 用针对p21启动子上−2.3 kB处p53结合位点的引物进行对照PCR反应。确认抗体特异性，用p53 ChIP检测信号，但未检测其他抗体(补充图4C,第五天;Koshiji等人，2004年).

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ChIP显示低氧细胞中c-Myc启动子占用发生改变。答：。HCT116和WT8细胞在21%O下生长2（N） 或0.5%O2（H） 持续20小时，然后通过ChIP进行分析。用抗c-Myc抗体或同型对照进行IP后，使用SYBR绿通过QRT-PCR评估提取物。图表显示了c-Myc IP和兔IgG对照（背景）之间的折叠差异，以及4个单独实验的结果，误差条±1 SEM。B。HCT116和WT8中HIF-α蛋白诱导的时间进程，分别为1小时、2小时和20小时，温度为0.5%O2.*表示非特定带。C、。在上述同一时间点进行HIF靶基因诱导的QRT-PCR时间进程。3次实验的平均结果，误差杆±1 SEM。D。0.5%O孵育HCT116和WT8细胞中的c-Myc启动子结合2持续1或2小时，然后由ChIP如上所述进行分析。4个独立实验的结果显示，误差棒±1 SEM。

数据强烈表明HIF-α亚单位改变c-Myc启动子结合，而不是其激活转录的能力。为了了解这些影响的潜在机制，我们确定是否需要HIF转录活性。如上所述进行ChIP，但细胞在0.5%O下培养2仅持续1-2小时。在这些时间点，观察到HIF-α蛋白诱导(图5B)，但HIF-α靶基因的诱导不是(图5C). 在0.5%O浓度下，HCT116细胞与p21、p27和Cyclin D2启动子的c-Myc结合减少2，而在WT8细胞中观察到增强的结合(图5D). 作为额外的对照，对用放线菌素D预处理的细胞进行ChIP，观察到类似的结果（数据未显示）。因此，我们得出结论，HIF-1α和HIF-2α对c-Myc启动子结合的影响独立于各自的转录靶点。

由于c-Myc活性是其蛋白水平的函数，我们研究了缺氧对c-Myc积累的影响，以及其结合伙伴Sp1、Miz1和Max及其竞争对手Mad1的影响。HCT116和WT8细胞在0.5%氧浓度下生长4小时或20小时，未检测到蛋白质水平的一致变化2(补充图6A). 对c-Myc mRNA水平和蛋白质稳定性的评估显示，在缺氧条件下没有持续变化（数据未显示）。值得注意的是，低氧培养4或20小时与HCT116细胞中c-Myc与Sp1、Miz1和Max的共沉淀显著减少相关，而与WT8细胞中这些蛋白的共沉淀增加相关，尽管与HCT116-细胞中的减少相比不太显著(图6A). 当进行Mad1 IP时，观察到相反的结果：缺氧HCT116细胞中的Mad1/Max关联增加，而缺氧WT8细胞中的关联减少。为了证实这些数据，还对Sp1、Miz1和Max进行了IP测试。与之前一样，我们观察到这些蛋白与c-Myc在缺氧HCT116细胞中的共沉淀减少，而在缺氧WT8细胞中的共同沉淀增加(图6B).

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HIF-α对c-Myc活性的影响与c-Myc与Sp1、Mizl和Max的不同相互作用相关。答：。在0.5%O下生长的HCT116和WT8细胞中，c-Myc IP后Sp1、Mizl和Max的共沉淀以及MadI IP后Max的共沉淀2持续4小时和20小时。B。缺氧培养20小时的HCT116和WT8细胞在Sp1、Mizl或Max IP后c-Myc共沉淀。C、。在用DFX处理HCT116和WT8细胞4小时后，在Sp1、Mizl和Max或同型对照IP后，HIF-1α和HIF-2α共沉淀。D。载体控制（V1）和HIF-1α过表达细胞系在0.5%的氧浓度下培养2对共沉淀HIF-1α、HIF-2α和c-Myc进行最大IP分析。E.公司。载体控制（V1）和HIF-2α过表达细胞系在0.5%的氧浓度下培养2对共沉淀HIF-2α和c-Myc进行最大IP分析。

为了确定HIF-1α和HIF-2α可能改变c-Myc/Max结合的转录诱导依赖机制，我们研究了HIF-1β和HIF-2α与Sp1、Miz1和Max的相互作用，我们注意到这些相互作用的化学计量比存在差异：HIF-1α/Max复合物约占细胞HIF-1β的0.25%，而HIF-2α/Max-复合物占细胞HIF-2α的2%(图6C). 对照免疫印迹检测Max-IP的特异性，显示其和丰富的转录因子Rb无共沉淀（数据未显示）。接下来，我们使用过度表达HIF-1α（1.1、1.2和1.3）和HIF-2α（2.1、2.2和2.3）的WT8细胞系，测试HIF-α水平对c-Myc/Max结合的影响。当HIF-1α过表达细胞系和载体对照（V1）以0.5%的浓度孵育时O%在20小时内，尽管全细胞裂解液中c-Myc和Max的水平相似，HIF-1α/Max结合水平的增加与c-Myc/Max结合和HIF-2α/Mas结合的降低相关。如前所述，随着HIF-1α水平的增加，HIF-2α的表达降低(拉瓦尔等人，2005年). 然而，HIF-2α/Max结合的减少大于表达差异(图6D). 另一方面，当HIF-2α过表达细胞系在缺氧条件下培养时，观察到c-Myc/Max结合的剂量依赖性增加，与HIF-2(图6E). 在常氧条件下，这些品系的c-Myc/Max结合没有差异(补充图6B、C). 这些数据证明了包含HIF-1α和Max或HIF-2α和Max的复合物的形成。HIF-1对c-Myc/Max复合物形成的抑制，以及HIF-2对c-Myc/Max复合物生成的促进与每个α亚基的表达水平及其与Max的相互作用相关，表明对c-Myc复合物的组成有直接影响。

HIF-2α促进NIH3T3细胞的细胞周期进展

在多种细胞类型中观察到HIF-1α和HIF-2α对c-Myc靶点的差异作用后，我们接下来证实了它们对NIH3T3细胞的细胞周期进展的影响，NIH3T_3细胞具有特征性的细胞周期反应。为此，我们分离出具有多西环素反应性表达DPM-HIF-1α-Myctag和DPM-HIF-2α-Myctag的NIH3T3细胞克隆，从而将HIF-α亚单位从任何HIF-非依赖性缺氧对细胞周期进展的影响中分离出来。使用两个表达HIF-1α的克隆（151和101）和两个表达的HIF-2α（265和201）进行进一步分析。诱导型HIF-1α的表达水平与0.5%O诱导的水平相似2虽然在NIH3T3细胞中没有内源性HIF-2α，但多西环素诱导的HIF-2α产生的VEGF mRNA的增加与缺氧或HIF-1α诱导相似（数据未显示）。图7A显示了在多西环素治疗48小时后每个转基因的稳定诱导，克隆265中有一些基线HIF-2α表达。用BrdU掺入法检测强力霉素治疗对细胞周期进展的影响。显示了典型的FACS图(图7B). 对4个独立实验的结果进行平均，在多西环素治疗24或48小时后，观察到HIF-1α诱导的S期细胞百分比显著下降，G1期细胞百分比增加（p<0.05）(图7C，上部面板）。有趣的是，在HIF-2α诱导系中，24小时后S期百分比显著增加（p<0.05），但48小时后没有增加(图7C，下部面板）。当测量增殖率时，多西环素治疗后HIF-1α诱导细胞的增殖率显著降低，HIF-2α诱导细胞增殖率显著增加，与细胞周期特征一致(图7D). 尽管HIF-1α仅在1天内增强S期进入，但这足以导致实验过程中细胞数量增加。我们的结论是，HIF-α亚单位对肿瘤细胞系中细胞周期进展的影响可以推广到多种细胞类型，包括那些具有完整细胞周期调节的细胞，并且不需要HIF-非依赖性缺氧效应。

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多西环素调节的NIH3T3细胞表达正常毒性稳定的HIF-1α或HIF-2α，对细胞周期进展具有不同的影响。答：。用强力霉素治疗24或48小时后，免疫印迹显示HIF-α亚单位表达。B。HIF-1α（151）和HIF-2α（201）表达克隆0和2天强力霉素的代表性FACS图。C、。通过BrdU掺入测定强力霉素调节的3T3（克隆151和201）的细胞周期进展。3个实验的结果显示，误差条±1 SEM，*p<0.05。D。通过连续细胞计数测量增殖；数据来自一个有代表性的实验。误差±1 SD。

HIF-2α增强原发性MEF的RasV12G/c-Myc转化

鉴于HIF-2α促进RCC肿瘤的发展(Mandriota等人，2002年)，我们测试了HIF-2α促进初级MEF转化的能力。为此，将第13.5天胚胎的第4代MEF转染DPM-HIF-1α-FLAG或DPM-HIF-2α-FLAG，以及RasV12G、c-Myc或两者。让细胞生长到对峙状态，30天后通过Wright-Giemsa染色评估病灶形成情况。如代表性分析所示(图8A)与单独的RasV12G和c-Myc相比，HIF-2α与RasV11G和c-Myc联合转染导致病灶形成增加32%，而HIF-1α联合转染则导致病灶形成减少25%。三个实验的完整分析(图8B)显示了带有空载体的RasV12G/Myc、DPM-HIF-1α-FLAG和DPM-HIF-2α-FLAG之间的统计显著性差异（所有病例均p<0.01）。有趣的是，DPM-HIF-2α-FLAG与c-Myc单独联合转染导致41%的增加（p<0.05），而DPM-HIF1α-FRAG导致32%的减少（p<0.05）。从这些培养皿中提取Foci并生成细胞株，所有这些细胞在软琼脂中形成菌落(图8C). 这些克隆也用于评估转染蛋白的表达。相对于模拟转染对照组，在所有已建立的细胞系中检测到c-Myc和RasV12G的过度表达，c-Myc的过度表达导致内源性c-Myc受到抑制（内源性蛋白用星号表示）。有趣的是，从转染DPM-HIF-1α-FLAG的平板上获得的细胞株似乎无法维持该转基因的表达，但那些转染DPM-HIF-2α-FRAG的细胞株却能维持该转基因表达(图8D和数据未显示）。总之，这些数据支持HIF-2α在促进转化中的作用，并表明HIF-1α可以抑制转化。

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HIF-1α促进原发性MEFs形成病灶。答：。来自用空pcDNA3.1和pBABE载体、RasV12G、c-Myc、DPM-HIF-1α和DPM-HIF-2α转染的MEFs的代表性Wright Giemsa染色板。B。显示了所有转染组合的菌落计数。3次实验的结果，误差条±1 SEM，*p<0.05，**p<0.01。C、。来自疫源地的细胞系在软琼脂中形成菌落。显示了20倍和100倍的放大倍数。D。免疫印迹分析HIF-2α、c-Myc和Ras在从转染c-Myc、RasV12G和pCDNA3.1、DPM-HIF-1α和DPM-HIF-2α的平板上选取的病灶中获得的代表性克隆中的过度表达。*表示内源性蛋白质。E.公司。HIF-α调节c-Myc活性的模型。我们认为HIF-1α特异性地破坏c-Myc/Max和c-Myc/Sp1复合物，允许更多Mad/Max相互作用和DNA结合。另一方面，我们假设HIF-2α稳定c-Myc/Max复合物，进而促进E-box和Inrs处的c-Myc DNA结合。

讨论

在本研究中，我们发现HIF-2α促进肾癌细胞、NTH3T3细胞、HEK293细胞和胚胎上皮细胞的c-Myc转录活性和细胞周期进展。此外，HIF-2α与RasV12G和c-Myc协同促进MEF转化。这是一种新的途径，我们相信它对缺氧条件下正常细胞和转化细胞的增殖，以及对失去VHL（甚高频）肿瘤抑制剂。这也是首次描述HIF-1α和HIF-2α通过改变共同途径而直接相互对抗的效应。

先前的数据表明，HIF-1α调节缺氧细胞的c-Myc功能。在这些研究中，HIF-1α通过抑制DNA结合，特别是通过竞争Sp1抑制c-Myc转录活性(Koshiji等人，2004年;Koshiji等人，2005年;To等人，2006年). 我们重复了这些发现，并观察到HIF-1α/Max结合，这可能阻止c-Myc/Max相互作用。虽然在以前的研究中，HIF-1α也与c-Myc在同一位置结合DNA，但我们观察到HIF-α在p21 Inr上结合，而不是在测试的其他五个c-Myc靶启动子上，这表明不需要置换来调节c-Myc。HIF-2α似乎也通过调节c-Myc/Sp1、c-Myc/Miz1和c-Myc/Max相互作用来调节c-Myc。当HIF-2α存在时，与正常氧相比，检测到更多的c-Myc/Max、c-Myc/Miz和c-Myc/Sp1复合物，更少的Mad/Max复合物。HIF-2α与Max共沉淀，表明它也通过直接结合或作为更大复合物的一部分与这些蛋白质相互作用。根据这些数据和之前报告的数据(Koshiji等人，2005年;To等人，2006年)，我们提出以下模型(图8E)：我们认为HIF-1α的存在直接阻断了c-Myc与其DNA结合伙伴的相互作用。另一方面，HIF-2α可能通过直接将其招募到这些复合物中，或在形成后稳定这些复合物，促进c-Myc与Max的相互作用，从而促进Sp1和Miz1的相互作用。这可能是通过选择性阻断Max与Mad1的相互作用来实现的，Mad1与c-Myc竞争可用的细胞Max。要了解HIF-1α/Max、HIF-1β/Sp1和HIF-2α/Max相互作用的精确影响，需要进一步分析形成的多聚物复合物。

除c-Myc外，多个HIF-2α靶点促进增殖和转化，是肿瘤生长所必需的。HIF-2α直接激活Oct4、Cyclin D1和TGFα的表达，它们都可以促进MEF或NIH3T3细胞的转化(Alt等人，2000年;Gidekel等人，2003年;Twardzik等人，1982年). 在我们的研究中，这些靶点的HIF-2α激活与转化无关，因为在上述转化的MEF细胞系或NIH3T3细胞中未检测到Oct4和TGF-α，并且无论HIF-α表达如何，Cyclin D1的mRNA和蛋白水平都相似（数据未显示）。然而，其他HIF-2α靶点的激活可能通过阻断其对细胞凋亡的影响，在c-Myc驱动的增殖和转化中协同作用。

尽管HIF-1α在促进增殖和转化的能力方面是独特的，但它与HIF-1α一样对血管生成、侵袭和代谢有影响，所有这些都有助于肿瘤的生长和进展。许多临床研究已将HIF-α亚单位的存在与不良患者预后相关。然而，HIF-α提交物的差异效应可能在具有更完整细胞周期控制的细胞中发挥关键作用，正如前肿瘤细胞以及许多科学模型系统的情况一样。同样，HIF-α激活的幅度可能会改变哪些途径或效应更为主导。例如，HIF-1α激活Vhl公司−/−Ras-transformed MEF抑制皮下移植生长(Mack等人，2005年)，同时Hif-1型α−/−Ras-transformed MEF形成的皮下肿瘤比WT小(Ryan等人，2000年). 值得注意的是Vhl公司−/−MEF显示血管增强但增殖受限在体外然而Hif-1型α−/−MEF表现出有限的VEGF表达。缺氧HIF-1α的激活似乎是肿瘤血管生成所必需的，而持续激活则抑制细胞周期的进展。调节缺氧细胞存活也可以改变肿瘤行为，最近的一项研究发现HIF-1α或HIF-2α在胶质瘤细胞中过度表达(Acker等人，2005年). 胶质瘤以广泛的缺氧区域和大量细胞死亡而闻名。HIF-α的过度表达促进了这一点，导致凋亡导致肿瘤尺寸减小(Acker等人，2005年). 因此，每一个HIF-α都有可能成为肿瘤的促进剂或抑制物，这取决于特定肿瘤类型的生物学特性及其发展阶段。

这些数据对多种肿瘤类型的肿瘤发生和发展具有重要意义。在肾癌的背景下，几个HIF-2α靶点似乎在肿瘤的发生和发展中很重要，包括VEGF、Oct4和TGFα。我们的数据表明，HIF-2α促进MEF转化，而HIF-1α抑制MEF转化。这支持了HIF-2β活性的相对增加以及HIF-1β的丢失与获得发育异常特征相关的证据VHL（甚高频）−/−肾损伤(Mandriota等人，2002年;拉瓦尔等人，2005年). 在我们的研究中，由于VEGF、Oct4和Cyclin D1与MEF转化无关，这些数据也表明HIF-2α介导的c-Myc活化在RCC启动中具有独特的作用。我们的发现也与其他常见恶性肿瘤有关。在最近对神经母细胞瘤、结肠直肠癌和非小细胞肺癌（均表达α亚单位）的研究中，HIF-2α的表达比HIF-1α与预后不良更具决定性意义(Giatromanolaki等人，2001年;Holmquist-Mengelbier等人，2006年;Yoshimura等人，2004年). 鉴于将c-Myc（或其家族成员n-Myc）与每种肿瘤类型联系起来的数据，HIF-2α介导的c-Myc活性增强可能在这些以及其他人类癌症中起作用。

材料和方法

细胞培养

HCT116（取自ATCC）和WT8细胞（W.G.Kaelin的亲手赠品）在含有10%FBS（Gemini Biosystems）、2 mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100μG/ml链霉素和0.1 mM MEM非必需氨基酸的DMEM中培养。MEF保存在含有10%FBS（Hyclone）和上述补充剂的DMEM中。内皮细胞按照描述进行衍生和培养(Mansfield等人，2005年). 根据制造商的规范（Clontech，Mountamview，CA），用反向Tet-Activator稳定转染NIH3T3细胞（ATCC），然后用pTRE-DPM-HIF-1α-Myctag和pTRE-DBM-HIF-2α-Myctag转染。分离克隆后，将这些细胞系（以及Tet-on HEK293细胞）保存在DMEM、10%FBS（Clontech Tet-approved）、150μg/ml Hygromycin B和上述补充剂中。在NIH3T3细胞中使用0.5μg/ml的多西环素（克隆泰克），在HEK293细胞中使用2μg/ml的多西环素。

缺氧

缺氧（0.5%O2，5%一氧化碳2，94.5%氮2)使用体内2低氧工作站（Ruskin Technologies）或正压室内，接收来自定制混合罐（Arrgas）的气体。DFX（Calbiochem）被用作最终浓度为200μM的缺氧模拟物。

细胞周期分析

在这些实验中，细胞被镀到一定的密度，使其在分析当天达到50%的汇合度。然后在接下来的几天内开始治疗（缺氧或多西环素），使所有细胞在收获时培养相同的时间和相似的融合度。在使用10μM BrdU进行20分钟脉冲后，按照标准方案（Becton Dickinson）进行BrdU分析。细胞用Alexa-488抗BrdU（Invitrogen）和0.1 M碘化丙啶染色，并在LSR FACS机器（Becton Dickinson）中进行分析。对于扩散分析，104细胞被镀在6厘米2板和在8天内在血细胞仪中每个时间点计数的2个板。转化分析如所述补充方法.

QRT-PCR

按照制造商的说明，使用Trizol试剂从细胞中提取总RNA（Invitrogen）。使用Superscript II（Invitrogen）和随机六聚体引物（Boehringer Mannheim）从2μg RNA中生成cDNA。针对18S（应用生物系统）的引物用于ΔΔC的内源性控制T型分析。针对人类和小鼠VEGF、PGK、Oct4、p27和Cyclin D2以及人类p21和E2F1生成引物集（序列可按要求提供）。分析在应用生物系统7900HT序列检测系统中进行，扩增用SYBR绿定量。

siRNA分析

使用抗HIF-1α（Hs_HIF1_2和3）、HIF-2α（Hs _HIF1.2和4）和c-Myc（Hs _Myc_2和3。按照指示使用HiPerfect试剂（Qiagen）进行转染。转染6小时后，改变培养基，将细胞置于缺氧条件下20小时（用于表达分析）或48小时（用于细胞周期分析）。如上所述，采集细胞进行蛋白质和RNA分析。

免疫沉淀和Western Blot分析

对于免疫沉淀分析，细胞在25 mM Tris pH 8.0、100 mM NaCl和含有完整蛋白酶抑制剂（Roche）和200μM DFX的1%Triton X-100中溶解。对于所有其他的蛋白质印迹，在RIPA中进行裂解。亚细胞分离如前所述(Qu等人，2004年). 染色质IP的抗体和方案在补充文本中列出。

​

重要性

低氧诱导因子（HIFs）的激活是实体肿瘤生物学的一个重要特征。在这里，我们描述了两个HIF-α亚单位之间的基本区别：表达HIF-2α的肿瘤细胞通过促进c-Myc转录活性表现出增殖增加，而HIF-1α通过对抗c-Myc抑制细胞周期进展。HIF-2α对细胞周期进程的独特增强，再加上HIF-α对血管生成、侵袭和转移的影响，可能比单独激活HIF-1α产生更糟糕的临床结果。这与RCC、神经母细胞瘤、结直肠癌和非小细胞肺癌的临床数据一致，并突出了HIF-2α作为抗癌治疗的特定靶点的重要性。

补充材料

SF1气体

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SF2气体

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三氟化硫

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SF4气体

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SF5气体

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六氟化硫

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补充1

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补充2

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致谢

我们非常感谢艾布拉姆森家族癌症研究所的许多成员，特别是克雷格·汤普森，以及史蒂夫·麦克马洪和格德·布洛贝尔的有益建议。布莱恩·基思和布莱恩·巴恩哈特对手稿进行了批判性评估。这项工作得到了NIH项目拨款CA104838和霍华德·休斯医学院的支持。J.D.G.得到了医学科学家培训拨款和NRSA T32止血和血栓形成拨款的支持。J.A.B.得到了兽医培训补助金的支持。M.C.S.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。

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