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基因发育。2004年1月1日；18(1): 88–98.
数字对象标识：10.1101/gad.285404
预防性维修识别码：PMC314282型
PMID：14724179

静止细胞中后发复合体的丢失导致非计划性肝细胞增殖

卡琳·G·沃思,1 罗密奥·里奇,2 胡安·吉梅内斯·阿宾,1 沙赫亚尔·塔希比格鲁,1 Nobuaki R.Kudo公司,1 Wolfram Jochum公司,3 米雷尔·瓦瑟尔·科涅特,4和金·纳斯迈思1,5
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

后期增殖复合体或环体（APC/C）是一种泛素蛋白连接酶，与Cdc20和Cdh1一起作用于有丝分裂蛋白，使其被蛋白质体降解。有丝分裂期间APC–Cdc20活性通过破坏安全蛋白和细胞周期蛋白触发后期。APC–Cdh1在G过程中促进细胞周期蛋白和其他蛋白质的降解1我们表明，在胚胎发生过程中APC/C的丢失在胚胎期E6.5（E6.5）之前是早期致死的。为了研究APC/C在静止细胞中的作用，我们有条件地灭活了小鼠中的亚单位Apc2。删除应用程序2静止期肝细胞重新进入细胞周期并在中期停滞，导致肝功能衰竭。细胞周期中的再注入要么在没有任何增殖刺激的情况下发生，要么很容易被诱导。我们证明APC具有防止肝细胞意外重新进入细胞周期的额外功能。

关键词：间期增殖复合物，APC，细胞周期，G0，静止细胞

泛素介导的蛋白水解在多种生物过程中起着关键作用，包括有丝分裂、转录控制、免疫系统调节、信号转导和发育(Ben-Neriah 2002年;Conaway等人，2002年;Harper等人，2002年;彼得斯2002). 这种形式的蛋白质水解的第一步是将多个泛素链共价连接到目标蛋白质上。这是由特定的泛素蛋白连接酶完成的，其中许多具有RING-H2指结构域作为其催化核心的一部分(Jackson等人，2000年;Pickart 2001年).

第一个与定义的基本生理功能相关联的RING-finger泛素蛋白连接酶之一是多亚单位后延复合体或环体（APC/C；Irniger等人，1995年;King等人，1995年;Sudakin等人，1995年). APC/C由11个亚单位组成，在所有真核细胞有丝分裂期间对破坏蛋白质至关重要(Peters等人，1996年;Zachariae等人，1996年). APC/C的两个亚单位Apc2和Apc11构成催化核心，能够在体外泛素化靶蛋白(Gmachl等人，2000年;Leverson等人，2000年). Apc2和Apc11相互作用，分别含有cullin同源结构域和RING-finger结构域(Yu等人，1998年;Zachariae等人，1998年b;Tang等人，2001年).

APC／C通过诱导姐妹染色单体凝聚力的破坏，在大多数（如果不是所有的话）真核细胞中触发后期的开始。它通过泛素化一种叫做securin的蛋白质来实现这一点，securin是一种叫做separase的巯基蛋白酶的抑制性伴侣。一旦被激活，分离酶就会切割一种多蛋白复合体的Scc1亚单位，这种复合体被称为凝集素，它将姐妹染色单体结合在一起。APC/C同时通过破坏有丝分裂细胞周期蛋白触发有丝分裂的退出，这些细胞周期蛋白是细胞周期依赖性激酶Cdk1的调节亚单位。APC/C失活导致两种酵母的细胞(Irniger等人，1995年)和秀丽隐杆线虫中期被捕(Furuta等人，2000年;Golden等人，2000年). 在后期发病前不久，APC/C对安全蛋白和细胞周期蛋白的泛素化依赖于一种不稳定的调节性β-推进器蛋白，称为Cdc20(Visintin等人，1997年)在有丝分裂结束时被破坏(Shirayama等人，1999年). Cdc20绑定APC/C(Pfleger和Kirschner 2000;Hilioti等人，2001年;Pfleger等人，2001年)也可能是它的靶蛋白。

发现B型细胞周期蛋白在G期被APC/C快速降解1相位提高了它在非有丝分裂细胞中也具有重要功能的可能性(Amon等人，1994年;布兰迪斯和亨特1996;Irniger和Nasmysy 1997). 在酵母中，APC/C在G1不依赖于Cdc20，而是依赖于一种叫做Cdh1的相关蛋白(Visintin等人，1997年;Zachariae等人，1998年a). Cdc20和Cdh1的活动是互补的。Cdc20在有丝分裂期间是活性的，而Cdh1在G期是活性的1，当Cdk1处于非活动状态时。Cdk1对Cdh1的磷酸化阻止其在大部分细胞周期中与APC/C结合(Schwab等人，2001年). 因此，Cdk1和APC–Cdh1的活动是相互排斥的。一方的活动导致另一方的不活动，反之亦然。G期间APC–Cdh1的功能1在有丝分裂期间，对APC–Cdc20的理解不如对APC-Cdc20。Cdh1或APC/C的失活导致芽殖酵母细胞在性信息素的存在下进入S期(Irniger和Nasmysy 1997)并在缺乏氮源的情况下分裂酵母细胞(Kominami等人，1998年). Cdk1由于细胞周期蛋白的积累而产生的高活性可能是这些现象的部分原因。

APC/C在静止的哺乳动物细胞中也很活跃。大多数APC/C亚单位和Cdh1样蛋白（如果不是全部的话）都存在于由完全分化细胞组成的组织中(Gieffers等人，1999年). 事实上，可以从成年小鼠脑组织中分离出一种完全活性的复合物。哺乳动物具有几种不同的Cdh1蛋白，这些蛋白具有不同的组织分布和靶点特异性(Wan和Kirschner 2001). 鸡DT40细胞中Cdh1同源物的丢失对细胞增殖几乎没有影响，但会导致有丝分裂细胞周期蛋白在G1并废除G1雷帕霉素介导的逮捕(Sudo等人，2001年). 在果蝇属，Cdh1（称为fzr）是胚胎发生过程中细胞退出有丝分裂周期和有丝分裂后胚胎细胞中有丝分裂细胞周期蛋白破坏所必需的(Sigrist和Lehner 1997). Smad2与Cdh1结合从而促进APC/C泛素化SnoN（TGF-β信号传导抑制剂）的能力的发现表明，APC-Cdh1可能促进TGF-(Stroschein等人，2001年;Wan等人，2001年). 然而，这个过程的生理意义还不清楚。

在这篇论文中，我们用遗传方法研究了APC/C在静止细胞中的功能。我们没有确定在静止细胞中泛素化可能具有生理重要性的潜在底物，而是生成了一个条件等位基因应用程序2这使我们能够灭活非增殖组织中的关键APC/C亚单位。我们发现，废除经常触发静止肝细胞自发进入细胞周期。缺乏APC/C的肝脏更容易对已知的增殖信号作出反应。

结果

条件灭活应用程序2等位基因

为了确定Apc2蛋白的可能同源或副同源，对Apc2进行了NCBI–PSI-BLAST搜索。单鼠Apc2同源基因(XP_130088.1型)未发现任何Paralog（补充图1）。

用于灭活4月2日以有条件的方式应用程序2该位点两侧有液氧磷站点(用鞭子抽打等位基因）。Cre介导的重组导致外显子2-4缺失，导致三个开放阅读框中的终止密码子发生移码。用靶向载体转染后，G418-resistant E14.1 ES细胞克隆中应用程序2通过Southern印迹鉴定靶向结构取代了等位基因。用表达Flpc-重组酶的质粒瞬时转染正确靶向的克隆产生了用鞭子抽打等位基因，而用表达Cre重组酶的质粒转染产生了缺乏外显子2-4的缺失等位基因（Δ等位基因）。两个独立的ES细胞克隆携带用鞭子抽打或缺失等位基因应用程序2注入C57Bl/6囊胚。将嵌合体与C57Bl/6小鼠杂交，以获得任何一种Apc2漂浮或应用程序2Δ等位基因(图1A–E).

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条件等位基因的产生应用程序2. (A类)发电目标策略Apc2漂浮和Δ等位基因。代表应用程序2基因组位点、靶向载体和靶向等位基因。外显子显示为黑盒。对于应用程序2，外显子2-4两侧为液氧磷场地（三角形）。选择磁带Neo-Tk公司显示为红色和绿色框数据传输协议盒式磁带作为蓝色盒子。选择磁带被移除福尔佩-介导重组（虚线）以获得被鞭打的等位基因，以及Cre公司-利用介导重组技术产生Δ等位基因。(B)Southern blot分析检查靶向载体在应用程序2基因组位点。生态RV限制场所4月2日使用外部探针a1。(C类)Southern blot用于确定第三个整合液氧磷通过EcoRI限制性最大位点，并与内部探针b1杂交。(D类)靶向ES细胞瞬时转染后的Southern印迹福尔佩-或Cre公司-重组质粒以删除选择盒或产生Δ等位基因。诊断部位为EcoRV，c1为内部探针。(E类)Southern blot证实Apc2流量以及带有EcoRV消化DNA和内部探针c1的Δ等位基因。

中断应用程序2导致胚胎死亡

确定Apc2是否对小鼠杂合发育至关重要应用程序2Δ/+小鼠进行杂交。无纯合子应用程序2Δ/Δ共有120只活产小鼠出生于应用程序2Δ/+老鼠。应用程序2Δ/+小鼠没有表现出任何异常，出生时具有预期的频率(表1). 胚胎来自APC2接口Δ/+在E6.5和E9.5对交叉进行分析。在E6.5和E9.5中，没有纯合子应用程序2Δ/Δ发现了胚胎(表1). 我们得出结论，Apc2是早期胚胎发生所必需的。小鼠杂合子Apc2漂浮等位基因和Δ等位基因均无异常。携带Apc2漂浮等位基因以及应用程序2Δ/弗洛克斯小鼠没有缺陷，表明用鞭子抽打等位基因应用程序2功能齐全。

表1。

胚胎致死率应用程序2Δ/Δ 老鼠

应用程序2Δ/+×应用程序2Δ/++/++/ΔΔ/Δ总计
E6.5类616022
公式9.5822030
第21页39810120

来自应用程序2Δ/+老鼠，不应用程序2Δ/Δ老鼠出生了。在胚胎期E6.5和E9.5，所有胚胎均为应用程序2+/+或杂合子4月2日Δ等位基因。

静止肝细胞APC/C缺失导致急性肝衰竭

为了解决APC/C在分化细胞中的功能，我们研究了删除应用程序2在成人肝脏静止的肝细胞中。我们使用了Mx-Cre公司转基因系，其中Cre可以通过注射poly（I）poly（C）（pI/C；Kühn等人，1995年). 六周龄小鼠杂合性Mx-Cre公司转基因和携带用鞭子抽打和一个Δ等位基因应用程序2两次注射pI/C。应用程序2Δ/弗洛克斯和应用程序2弗洛克斯/+ Mx-Cre公司对照组为小鼠。Southern和Western blot分析证实，pI/C导致了Apc2漂浮等位基因(图2B、C).

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肝衰竭应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司老鼠。(A类)成人生存曲线应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司和对照小鼠(应用程序2Δ/弗洛克斯和应用程序2弗洛克斯/+ Mx-Cre公司小鼠）。大多数小鼠在第一次pI/C注射后的第11天至第14天之间死亡。(B)Southern blot分析应用程序2Δ/弗洛克斯或应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司肝脏；（np）无表型，（p）有表型。(C类)蛋白质印迹分析应用程序2Δ/弗洛克斯和应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司pI/C注射后肝脏的Apc2蛋白水平。Actin是加载控制；（np）无表型，（p）表型。(D类)南瓜来自应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司肝脏。73%的有丝分裂细胞处于前中期样状态，染色体浓缩。(E类)肝脏苏木精/伊红染色应用程序2Δ/弗洛克斯和应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司老鼠。应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司肝细胞看起来更大并且有浓缩的染色体。

大多数应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司小鼠在第一次注射pI/C后的第二周内死亡(图2A). 对死亡前不久取出的肝脏进行的组织学分析显示，6例肝脏发生了显著变化，但10例中有4例没有差异应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司老鼠。异常肝脏的苏木精/伊红染色显示，大多数肝细胞大大增大，缺乏核膜，并含有浓缩染色体(图2E). 在来自的南瓜上应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司72%的有丝分裂肝细胞处于前中期状态，染色质浓缩。单个染色体的形状不明确(图2D). 有这种变化的动物被称为受影响动物，而肝脏没有变化的动物则被称为未受影响动物。Southern印迹显示肝缺损的发生率与肝移植的效率之间没有相关性应用程序2删除(图2B; 数据未显示）。PAS染色显示病变肝细胞应用程序2Δ/弗洛克斯MxCre公司小鼠也缺乏糖原(图4A（见下文）。患者肝酶丙氨酸氨基转移酶（ALT）和谷氨酸脱氢酶（GLDH）水平以及胆红素水平均显著升高应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司小鼠，表明肝细胞功能受损。这些小鼠死于急性肝衰竭。In未受影响应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司小鼠和应用程序2Δ/弗洛克斯小鼠的ALT、GLDH和胆红素均在正常范围内（补充图2）。

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应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司肝细胞不能维持肝功能并阻止有丝分裂。(A类)PAS染色。大多数应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司染色缺失表明肝细胞呈PAS阴性。(B)Ki67和(C类)pH3染色应用程序2Δ/弗洛克斯和应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司注射pI/C后第11天的肝脏。大多数应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司肝细胞处于有丝分裂状态。箭头指向Ki67或pH3阳性细胞。

Apc2缺乏小鼠的快速和严重骨髓再生障碍

因为Mx-Cre公司-介导的重组也发生在造血细胞中，我们测量了血红蛋白水平。四只肝脏正常的小鼠都患有严重贫血，血红蛋白水平低于5 g/dL，这可能是它们死亡的原因。在两只肝脏异常的小鼠中也观察到严重贫血。pI/C引起的严重贫血应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司小鼠是由应用程序2在骨髓细胞中。为了进一步研究这一点，我们使用FACS分析（数据未显示）和胞浆分析pI/C注射后的造血细胞。严重的骨髓再生障碍通常在注射pI/C后4天内发生。到第4天，包括成红细胞在内的大多数有核细胞已经从骨髓中消失，骨髓中主要含有红细胞和少数淋巴细胞(图3A). 在注射pI/C后的第3天，我们观察到应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司小鼠与应用程序2Δ/弗洛克斯对照小鼠。这些发现表明，造血细胞APC/C的取消导致中期停滞，继而导致细胞死亡。这一过程发生得非常迅速，因此我们从未观察到有丝分裂细胞的急剧积累。然而，目前尚不清楚有丝分裂阻滞引起的细胞死亡是否能解释骨髓细胞的快速消失。

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移植肝2/3切除术应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司小鼠引起中期停药。(A类)注射1×400μg pI/C后第3天和第4天的骨髓细胞胞浆。在应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司pI/C后第3天，骨髓中有丝分裂细胞（箭头）数量增加应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司骨髓。(B)苏木精/伊红染色应用程序2Δ/弗洛克斯和应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司未受影响者2/3肝切除术后72h的肝脏应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司老鼠。在应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司小鼠70%的肝细胞增大，50%的细胞处于中期。(C类)南瓜来自应用程序2+/+和4月2日Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司肝切除2/3后48h。(一–克)有丝分裂应用程序2+/+肝细胞。(一)前期；(b条)早期前中期，NEB，但没有染色体的生物定向；(c（c）)前中期晚期，并非所有染色体都在赤道板对齐；(d日)中期，侧视，所有染色体在赤道板排列；(e（电子）)后期，姐妹染色单体向相反的两极分离；(（f）)末期；(克)早期G1. (小时–我)有丝分裂应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司肝细胞。(小时)前期，与应用程序2+/+肝细胞；(我)中期前，个体染色体的形状出现模糊；(j个)染色质浓缩的前中期样细胞；(k个)中期，极视图；(我)中期样细胞，染色质浓缩，但未见单个染色体。

2/3肝切除术后未受影响Apc2缺陷肝细胞的中期阻滞

在Western blot分析中，受影响肝脏和未受影响肝脏的Apc2蛋白水平均降低，并且未观察到蛋白水平的差异（图。​（图2C2摄氏度和​和5E第五版（见下文）。研究是否有任何功能性Apc2蛋白存在于小鼠的肝细胞中，这些小鼠的肝脏在其肝细胞中应用程序2基因，我们研究了2/3肝切除导致细胞周期重新进入的后果。为了避免贫血导致的死亡，104月2日Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司小鼠和10只应用程序2Δ/弗洛克斯小鼠从应用程序2+/+室友。然后在移植后4周注射2×400μg/只小鼠的pI/C，但必须确保血细胞计数正常。三应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司但没有应用程序2Δ/弗洛克斯注射pI/C后8周内，小鼠死于肝衰竭（数据未显示）。在幸存的七个人中应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司小鼠，2/3肝切除术在3-5天内导致死亡。组织学分析表明，这些小鼠70%的有丝分裂肝细胞在中期停滞(图3B)，尽管操作前看起来正常（数据未显示）。南瓜来自应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司肝脏证实，它们的染色体是浓缩的，并且经常以类似于中期的方式排列应用程序2+/+老鼠。然而，缺乏Apc2的中期细胞的染色体过度收缩，95%的细胞的中期板小于对照细胞。(图3C、k和l).应用程序2Δ/弗洛克斯小鼠存活下来，其肝细胞与野生型小鼠没有什么不同。这些发现表明，Apc2蛋白确实已从未受影响的肝脏中去除应用程序2基因已被删除。他们还证明APC/C对哺乳动物细胞后期的发生至关重要。

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APC/C目标的级别应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司肝细胞。的冷冻应用程序2Δ/弗洛克斯和4月2日Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司用间接免疫荧光法对肝脏进行分析。(A类)我们发现50%–70%的应用程序2Δ/弗洛克斯Mx克里肝细胞Ki67染色，表明它们从静止状态进入增殖状态。约1%的Ki67阳性细胞在应用程序2Δ/弗洛克斯肝细胞。(B)应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司染色体浓缩的肝细胞有丝分裂标记物pH3阳性。在中发现少量pH3阳性细胞应用程序2Δ/弗洛克斯肝脏。(C类)APC/C Cdc20的有丝分裂调节因子表达于应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司具有浓缩染色体的肝细胞。核膜破裂后定位于纺锤体和细胞质（箭头）。(D类)有丝分裂中发现细胞周期蛋白A2应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司纺锤体和细胞质中的肝细胞（箭头）。低百分比应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司染色体未凝聚的细胞以及1%的应用程序2Δ/弗洛克斯肝细胞周期蛋白A2阳性。(E类)肝提取物的Apc2、cyclin A2、cyclin-B1、cyclinD1、securin、p27、SnoN、Plk和Cdc20的Western blot分析。作为阳性对照，使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。这些MEF通过双胸苷阻断同步化，并释放到诺卡唑中。生命来自应用程序2+/+,应用程序2Δ/弗洛克斯、和应用程序2弗洛克斯/+ Mx-Cre公司将小鼠与来自应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司无表型（np）和有表型（p）小鼠。Tubulin是装载控制装置。

Apc2缺陷肝细胞APC/C底物分析

接下来，我们描述了肝脏中肝细胞的细胞周期状态，这些肝细胞明显仅受基因缺失的影响应用程序2更加详细。很少应用程序2Δ/弗洛克斯（<2%）但50%–70%应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司肝细胞Ki67和pH3阳性(图4B). 原位免疫荧光(图5A-D)显示Ki67、pH3、Cdc20和cyclin A2阳性细胞比例较高。在有丝分裂细胞中，由于核膜破裂（NEB），细胞周期蛋白A2和Cdc20均与纺锤体相关并分布在细胞质中。受影响的肝脏还含有尚未进入有丝分裂的肝细胞，但细胞核内仍含有高水平的细胞周期蛋白A2。蛋白质印迹(图5E)显示删除应用程序2大大减少了受影响和未受影响肝脏中Apc2蛋白的数量。受影响但未受影响的肝脏具有高水平的蛋白，即APC/C底物。G的水平1-底物cyclin D1和SnoN以及有丝分裂底物cylicn A2、cyclin B1、securin、Plk和Cdc20与用诺康唑处理过的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的底物相当。细胞周期蛋白激酶抑制剂p27在受累肝脏中下调。生命明显不受删除应用程序2具有低水平APC/C靶点和高水平p27。Cyclin E和Cdc6在受影响和未受影响的肝细胞中表达4月2日Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司老鼠以及来自应用程序2Δ/弗洛克斯小鼠的表达水平没有差异（数据未显示）。这些结果表明，删除应用程序2通过Mx-Cre公司诱导部分而非全部肝脏的肝细胞进入增殖状态，导致有丝分裂阻滞。肝细胞的细胞周期再进入应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司Cre重组酶的延伸表达不会导致小鼠DNA损伤(Loonstra等人，2001年;银牌和利文斯顿2001)因为pI/C没有引起Ki67阳性肝细胞数量的显著增加应用程序2弗洛克斯/+ Mx-Cre公司老鼠。少于3%的肝细胞来自应用程序2弗洛克斯/+ Mx-Cre公司或应用程序2Δ/弗洛克斯在pI/C注射后第3、7和28天，肝脏Ki67阳性。（补充图4）。

删除应用程序2仅在肝细胞中导致其增殖和有丝分裂阻滞

发现删除4月2日通过Mx-Cre公司导致肝细胞增殖表明APC/C活性可能是维持肝细胞静止状态所必需的。这将是泛素蛋白连接酶的一种新的活性，迄今为止，泛素连接酶参与促进后期。然而，我们观察到应用程序2缺失导致贫血和肝功能衰竭，增加了肝细胞增殖可能是凋亡的次要作用的可能性。为了解决这个问题，我们分析了应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司和应用程序2Δ/弗洛克斯用TUNEL法测定pI/C注射后第0、1、2、3、4和5天的小鼠。在应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司小鼠在注射pI/C后3-4天内出现贫血。Cre介导的应用程序2缺失未导致TUNEL阳性细胞增加（补充图3A）。然而，我们确实发现6%的TUNEL阳性细胞应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司死亡前不久的肝脏（补充图3B）。这些发现与凋亡可能是细胞增殖刺激的概念不一致应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司老鼠。

为了进一步探讨缺氧是否是静止肝细胞重新进入细胞周期的原因，我们研究了删除应用程序2仅在肝细胞中使用TTR Cre公司转基因。在TTR-Cre公司转基因小鼠，从转甲状腺素启动子两侧是小鼠雌激素受体的两个激素结合域。这种形式的Cre在通过注射4-羟基他莫昔芬（4-OHT）诱导之前保持不活性。将4-OHT添加到携带TTR-Cre公司因此，转基因只能在肝细胞中引起Cre介导的重组(Tannour-Louet等人，2002年). Southern和Western blot显示，每天10次4-OHT注射应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯TTR Cre公司小鼠引起的应用程序2以及Apc2蛋白的缺失。在40%的患者中，4-OHT导致与肝衰竭相关的死亡（通常在首次注射后3周内）应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯TTR-Cre公司老鼠(n个=26）但没有应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯老鼠(图6A). 死亡时的肝细胞与Mx-Cre删除APC/C后产生的肝细胞具有相同的外观，即它们显著增大并在中期停滞(图6D). 因为TTR-Cre不会删除应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯TTR-Cre公司在肝脏中，我们观察到成纤维细胞增殖是对肝细胞死亡增加的反应(图6D)以及Southern和Western印迹上的残留条带(图6B、C). 由于这些小鼠没有发生骨髓再生障碍（数据未显示），因此可以排除缺氧对增殖的刺激作用。我们得出结论，删除应用程序2在40%的小鼠中，仅肝细胞就足以触发它们进入细胞周期。60%应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯TTR-Cre公司小鼠，4-OHT没有效果，尽管有相当水平的应用程序2删除(图6B、C). 此外，这些未受影响小鼠的肝脏组织学看起来正常（数据未显示）。

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Apc2缺陷肝细胞重新进入细胞周期是细胞自主的。(A类)生存曲线应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯和应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯TTR-Cre公司老鼠。40%的小鼠在每周五次腹腔注射1 mg/只4-OHT并每隔一周重复注射一次后14天内死于肝衰竭。(B)Southern杂交分析显示被鞭打的等位基因TTR-Cre公司注射4-OHT后。(C类)Western blot分析显示，Apc2蛋白水平下调；（np）无表型，（p）表型。(D类)组织学分析应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯并受到影响应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯TTR-Cre公司肝脏苏木精/伊红染色。

低增殖刺激足以诱导未受影响的Apc2缺陷肝细胞重新进入细胞周期

这个发现应用程序2缺失经常导致静止的肝细胞进入细胞周期，这表明APC/C在限制细胞周期进入中起着关键作用。然而，在半数Apc2缺乏小鼠中，肝细胞保持静止。对这种表型变异的一种解释是，APC/C的废除降低了细胞周期进入的“阈值”。在一些小鼠中，内源性有丝分裂信号现在能够触发细胞周期进入，但在其他小鼠中则不能。

这个想法预测，无症状Apc2缺陷的肝细胞应该更容易被有丝分裂信号刺激进入细胞周期，而有丝分裂通常不会超过促进增殖所需的阈值。因此，我们比较了应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯和无症状应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯TTR-Cre公司肝脏切除1/4。在第一次注射4-OHT一个月后，对存活的小鼠进行1/4肝切除术。在此阶段，肝脏组织学异常的小鼠也被排除在外。所有肝脏表面正常但Apc2缺乏的小鼠在1/4肝切除术后12至15天死于肝衰竭，而对照组存活下来(图7A). 组织学分析显示，他们的大部分肝细胞处于有丝分裂状态（数据未显示）。为了更直接地比较野生型和Apc2缺乏小鼠，我们测量了肝切除术后24、48和72小时Ki67阳性肝细胞的分数。为了测量DNA复制，每24小时注射一次BrdU。Apc2缺陷小鼠的Ki67和BrdU阳性细胞在48小时时增加，但对照组没有增加(图7B、C). 这些数据表明，1/4的肝切除术会导致Apc2缺乏，但不会应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯肝细胞进入细胞周期。假手术（不切除部分肝脏的手术，n个=2）不会导致重新进入细胞周期4月2日弗洛克斯/弗洛克斯TTR-Cre公司肝细胞。我们得出的结论是，APC/C的取消使所有肝细胞更容易受到有丝分裂信号的刺激，这有时会导致它们在没有任何明显外部刺激的情况下进入细胞周期。

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1/4肝切除术诱导未受影响者重新进入细胞周期应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯TTR-Cre公司肝脏。(A类)生存曲线应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯和应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯TTR-Cre公司小鼠1/4肝切除后。应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯TTR-Cre公司小鼠在肝功能衰竭1/4肝切除后第二周内死亡。(B)1/4肝切除术后24小时、48小时和72小时Ki67-和BrdU-阳性细胞的定量。对于每个时间点，三个应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯和三个应用程序2弗洛克斯/弗洛克斯TTR-Cre公司使用小鼠。(C类)1/4肝切除术后48小时Ki67染色。

讨论

除了在细胞增殖过程中的关键调节功能外，APC/C在有丝分裂后分化的细胞中也很活跃(Gieffers等人，1999年). 然而，这项活动的重要性尚不清楚。为了研究APC/C在静止细胞中的作用，我们有条件地删除了它的一个亚基，Apc2、，在活体肝细胞中。

后期需要哺乳动物APC/C

遗传学研究表明，APC/C在多种真核生物中触发后期。影响APC/C或其激活剂Cdc20的突变引起酵母(Irniger等人，1995年)，飞(Sigrist和Lehner 1997)、和蠕虫(Furuta等人，2000年;Golden等人，2000年)细胞停滞在具有未分离的姐妹染色单体的中期样状态。注射CDC16/APC6和CDC27/APC3特异性抗体在哺乳动物组织培养细胞中产生类似的表型(Tugendreich等人，1995年). 然而，抗体注射实验很难解释，而且从未用遗传学研究过灭活哺乳动物细胞中APC/C的效果。由于小鼠基因失活的结果通常与组织培养实验中预期的结果不同，因此确定APC/C是否对活体动物的有丝分裂至关重要。

我们无法检测应用程序2Δ/ΔE6.5之间杂交产生的胚胎应用程序2Δ/+小鼠暗示APC/C对胚胎发育至关重要。这与小鼠APC/C亚单位Apc10失活是早期胚胎致死的发现一致(Pravtcheva and Wise 1996年). 使用Mx-Cre系统，我们成功删除了应用程序2在静止的肝细胞中。2/3的肝切除术导致这些Apc2缺乏的细胞开始增殖，但其他方面明显正常的静止细胞开始增殖。我们的发现是，在2/3肝切除术后3至5天，这些细胞中的大多数处于中期样状态，这表明APC/C在哺乳动物体内的后期是必要的。

肝细胞APC/C缺失导致细胞周期重新进入

APC/C的废除对静止的肝细胞也有显著的影响。2周内应用程序2由于pI/C刺激Mx-Cre转基因引起的缺失，大多数小鼠死亡。在某些情况下，这似乎是由骨髓中APC/C丢失导致的严重贫血引起的。然而，在大多数情况下，死亡似乎是由肝细胞在有丝分裂状态下停止而导致的肝功能衰竭引起的，在此期间不能维持正常的肝功能。至关重要的是，删除应用程序2仅在肝细胞中（使用4-羟基他莫西芬诱导的TTR-Cre公司转基因）产生类似的表型，因此不可能是骨髓衰竭的继发后果。目前尚不清楚删除应用程序2骨髓中的细胞凋亡是由有丝分裂阻滞引起的，或是对细胞生存的一些更直接的影响引起的。

肝脏病理学是由大量肝细胞自发进入细胞周期引起的，在缺乏APC/C的情况下，这些肝细胞会以有丝分裂样状态停滞。APC/C的几种已知底物，如有丝分裂细胞周期蛋白、安全蛋白和SnoN，在这些细胞中积累到较高水平，而其他S期促进蛋白，如Cdc6和细胞周期蛋白E，在野生型肝细胞中的表达水平相同。这一发现表明APC/C在静止的肝细胞中起着关键作用，即抑制其重新进入细胞周期。APC/C可以通过抑制细胞外有丝分裂原的产生或更直接地通过抑制能够促进增殖生长的细胞内蛋白质的积累来发挥这一功能。

令人惊讶的是4月2日在大约一半的小鼠中没有引起增殖反应。尽管Apc2蛋白消失，但这类小鼠的肝细胞仍处于静止状态，与野生型非常相似。然而，这些无症状Apc2缺陷的肝细胞处于一种改变的状态，因为它们比野生型更容易受到刺激，开始DNA复制。在48小时内，1/4肝切除导致许多Apc2缺乏的肝细胞Ki67阳性并进入S期。我们的结论是，APC/C的废除导致静止肝细胞状态的重大改变，从而更容易刺激它们开始细胞增殖。它们进入细胞周期的准备状态允许它们自发或响应有丝分裂信号。坏死或凋亡可以被排除为重新进入细胞周期的刺激，因为APC/C的耗竭也会导致肝细胞明显不受应用程序2删除以在1/4肝切除后进入细胞周期。破坏SnoN的失败似乎不太可能是原因，因为SnoN水平虽然在APC/C缺乏的细胞中明显升高，但在无症状APC/C缺陷的肝脏中却没有显著升高。我们还发现其他APC/C底物（如细胞周期蛋白B1、安全蛋白、Plk和Cdc20）的水平没有明显变化，并且只有非常小的细胞周期蛋白A2水平的增加。

虽然没有其他研究直接涉及APC/C在静止细胞中的作用，但我们的发现是，APC/C的废除促进了细胞周期的进入，这与以下发现一致：果蝇属缺乏泡沫相关（Cdh1）的胚胎通过额外的细胞周期进展(Sigrist和Lehner 1997)并且发现缺乏特定Cdh1基因的鸡组织培养细胞不太可能在G1雷帕霉素(Sudo等人，2001年). 这些数据和我们的数据都表明APC/C在抑制增殖以及促进有丝分裂后期的关键作用。

材料和方法

NCBI–PSI-BLAST搜索应用程序2

蛋白质来自智人、小家鼠、黑腹果蝇、秀丽隐杆线虫、裂殖酵母 葡萄，酿酒酵母、和拟南芥由NCBI–PSI-BLAST搜索选择(Schaffer等人，2001年)带有全长酿酒酵母nr数据库中的Apc2(e（电子）-模型中包含的值阈值：0.005，10轮），并使用taxonomy workbench按分类法排序(Wildpaner等人，2001年). 每个物种集都经过筛选，与cd-hit有90%的一致性(Li等人2001)，其余蛋白质与T-Coffee对齐(Notredame等人，2000年). 使用PHYLO_WIN创建了系统发育树(Galtier等人，1996年).

的生成应用程序2弗洛克斯 和应用程序2Δ 老鼠

鼠标4月2日使用来自dbEST的cDNA探针从129/Sv BAC文库（研究遗传学）中分离出基因组DNA宽13204.BAC克隆396K23用于构建应用程序2目标载体。一种含有一种聚合物的聚合物液氧磷该站点被插入pBluescript II KS（–）（Stratagene）的BSSHII站点。对于正选择和负选择用鞭子抽打和frted pKNeo-HSVTk公司磁带被插入。MCI数据分析用于选择随机积分。对于靶向结构，使用1.5-kb NotI和6-kb NdeI片段作为短同源区和长同源区。一个2-kb的XhoI片段包含用鞭子抽打外显子2-4的序列。

通过电穿孔15μg AscI线性化靶向结构在E14.1 ES细胞中进行基因靶向。为了进行选择，使用300μg/mL G418，并使用约350-bp外部探针通过EcoRV消化ES细胞DNA的Southern blot分析筛选克隆。正确整合目标向量的目标频率应用程序2基因组位点为1/58。第二个的存在液氧磷通过使用EcoRI消化物和第二个C末端外部探针确认了该位点。阳性克隆用25μg pCAGGS FlpeIRESpuro（F.Stewart）或25μg pMC Cre（H.Gu）电穿孔，并用2μM甘环韦进行阴性选择。对克隆进行筛选，以防选择盒丢失(福尔佩)或删除选择磁带和用鞭子抽打部分(Cre公司)通过使用内部探针对EcoRV消化物进行Southern blot分析，生成Δ等位基因。Apc2漂浮获得频率为1/8的等位基因和频率为1/24的Δ等位基因。通过将两个独立的靶向ES细胞克隆注射到C57Bl/6囊胚中创建嵌合小鼠。将嵌合小鼠与C57Bl/6野生型动物杂交，并保持在C57B1/6和129/Sv的混合遗传背景下。

BAC文库高密度过滤杂交和Southern杂交分析

将BAC文库高密度过滤器在1mM EDTA/0.5M NaPi（pH 7.2）、7%SDS中预杂交1小时。然后加入50ng32添加4-5个过滤器的P标记探针，并在65°C下杂交过夜。过滤器在40 mM NaPi（pH 7.2）/1%SDS中清洗两次，并暴露过夜。

对于Southern blot分析，细胞或组织在50 mM Tris-HCl（pH 8）、100 mM NaCl、1%SDS和0.5 mg/mL蛋白酶K中培养过夜。碎片在0.5%琼脂糖凝胶上分离，用0.25 N HCl脱尿10 min，在0.2 N NaOH/0.6 M NaCl中变性30 min，并在0.5 M Tris-HCl（pH 7.5）/1.5 M NaCl.中中和。在转移到尼龙膜并预混合后，将印迹在1 mM EDTA/0.5 M NaPi（pH 7.2）/7%SDS中与25 ng32P标记探针过夜，在40 mM NaPi（pH 7.2）/1%十二烷基硫酸钠中清洗两次，然后暴露。

蛋白质印迹分析

在提取缓冲液（1:1吐温20:NP-40缓冲液）中对组织进行均质。吐温20缓冲液：50 mM HEPES，pH 7.5，150 mM NaCl，10 mM EDTA，0.2%吐温20。NP-40缓冲液：1%NP-40，50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，10 mM EDTA），补充磷酸酶和蛋白酶抑制剂。然后将每条通道100μg蛋白质装载在8%和13%的凝胶上，并转移到PVDF膜（Millipore）上。用于检测针对细胞周期蛋白B1（1:1000；Upstate Biotechnology）、细胞周期蛋白A2（1:1000，英国剑桥大学Mark Carrington赠送）、Apc2和Cdc20（1:1000）的蛋白质抗体；奥地利维恩克里斯蒂安·吉弗斯（Christian Gieffers）、德国马丁斯里德神经生物学MPI Edgar Kramer赠送）、SnoN（5μg/mL；Cascade Bioscience）、cyclin D1、Plk（1:250；Zymed）和p27（1:100；Santa Cruz）、actin（1:100，Sigma）和tubulin（1:1000；Sigma。

免疫荧光

组织在液氮中冷冻并嵌入OCT组织TEC中。然后切割10μm冰冻切片，并将其固定在4%多聚甲醛中20分钟。切片在50 mM NH中培养4/PBS中的Cl和0.1%Triton-X保持3分钟。PBST中的3%BSA阻断非特异性结合1小时。为了稀释初级和次级抗体，使用阻断溶液并培养切片1小时。在PBST中清洗三次后，用1μg/mL DAPI对载玻片进行染色并贴装（Vectashield h-1000；Vector Laboratories）。对于Apc2染色，组织在4%多聚甲醛中固定20分钟，并在0.25%Triton-X中培养10分钟。使用抗细胞周期蛋白A2（来自Mark Carrington的礼物）和Cdc20（来自Edgar Kramer的礼物）的一级抗体，浓度为1:50。针对微管蛋白（Sigma）、pH3（Upstate Biotechnology）和Ki67（Novocastra Laboratories）的抗体，浓度分别为1:1000和1:250（Christian Gieffers赠送）。二级抗体为抗鼠抗体（1:1000）或抗兔抗体-Alexa 488 1:400（分子探针）。

免疫组织化学和TUNEL分析

组织在4%多聚甲醛中固定过夜，脱水，并包埋在石蜡中。然后切割5μm石蜡切片，重新水化，并在10 mM NaCitrat（pH 6）中煮沸13分钟。在0.5%H中培养可减少非特异性结合2O（运行）2在3%BSA/PBS中封闭15分钟后，用抗Ki67（1:1000；Novocastra Laboratories）或抗pH3-抗体（1:1000，Upstate Biotechnology）对切片进行过夜染色。使用ABC和DAB染色试剂盒（Vector Laboratories）进行二级抗体培养和酶反应。切片用苏木精复染3分钟。

为了检测凋亡细胞，在0.1%柠檬酸钠和0.1%Triton-X预处理冰冻切片上使用原位细胞死亡检测试剂盒（Roche）。

细胞分裂素类

对于细胞自旋，5×105细胞/孔在玻片上以700 rpm离心7 min。细胞用Quick染色（Merck）染色。

压榨程序

将肝脏切成小块（1–3 mm3)并立即固定在新制的Carnoy’s（甲醇：乙酸）中。在五次更换固定剂后，将材料储存在–20°C下。细胞学准备时，将小片放在载玻片上，并在水中滴几滴50%的乙酸以软化组织。当组织失去白色时（～30秒），使用滤纸去除大部分液体。接下来，添加三滴乳酸丙酸虎皮素（2%虎皮素在1:1乳酸中：丙酸）2–3分钟。将盖玻片放在顶部，用铅笔尖平稳移动盖玻片，轻轻分散材料。染色1小时后，用滤纸夹住盖玻片的一角，以避免其移动，并用铅笔从材料中心到边缘在盖玻片上画出螺旋。一张滤纸被放在盖玻片上，材料被压扁了。

BrdU染色

对于BrdU染色，在麻醉下注射50μg/g BrdU进行2/3肝切除术，并每24小时重复一次。将肝脏在4%多聚甲醛中固定过夜并脱水。在石蜡包埋后，切下6μm的切片。复水后，切片在2 N HCl中培养45分钟，1×胰蛋白酶培养45分钟和0.5%H2O（运行）2在PBS中的3%BSA中孵育30分钟，阻断非特异性结合，并用抗BrdU抗体（1:100；Zymed）孵育切片过夜。使用ABC和DAB染色试剂盒（Vector Laboratories）进行酶反应。切片用苏木精复染3分钟。

体内Cre的诱导

对于Mx-Cre的表达，静脉注射400μg（1 mg/mL）pI/C（Pharmacia）两次，间隔72h。对于造血细胞的缺失，使用1×400μg pI/C静脉注射。

按照Indra等人的描述进行4-OHT注射(1999). 将4-OHT（Sigma）在100%EtOH中稀释，以获得10 mg/100μL溶液。为了制备10 mg/mL 4-OHT溶液，添加葵花籽油。用Kantes声波仪超声30分钟后，每只小鼠腹腔注射1 mg/100μL 4-OHT溶液，连续五天。在第3、5和7周重复注射。

骨髓移植

应用程序2Δ/弗洛克斯Mx-Cre公司和应用程序2Δ/弗洛克斯用1100 rad照射小鼠。然后，照射后24 h，4×106骨髓细胞来自应用程序2+/+移植后4周通过血液检查评估骨髓重建成功。共注射2×400μg/小鼠pI/C i.p.，间隔72 h。

2/3和1/4肝切除术

用13μL/g 2.5%阿维汀腹腔注射麻醉小鼠，并在剑突下方进行腹部横向切口。对于2/3的肝切除术，结扎并切除左大叶和两个正中叶。对于1/4的肝切除术，切除了左叶。在假手术动物中，大的左叶和两个中间叶被暴露并放回原位，而没有任何组织切除。

致谢

我们感谢Hartmut Beug、Meinrad Busslinger、Jan-Michael Peters、Erwin Wagner及其团队提供的建议和试剂。特别感谢Dónal O’Carroll介绍ES细胞工作，感谢Hans Christian Theussl提供胚泡注射。Christian Gieffers、Edgar Kramer和Mark Carrington提供了抗体，Francis Stewart提供了Flpe-质粒。

在Ralf Kühn、Jamey Marth、Mireille Vasseur Cognet以及Busslinger和Wagner小组的许可下，我们从Wolfgang Wurst获得了Cre转基因小鼠。我们感谢Nicole Firnberg在E6.5分离胚胎，感谢Grzegorz Sumara在肝切除术方面的帮助。Alexander Schleiffer进行了生物信息学搜索。我们感谢哈特穆特·贝格和詹·迈克尔·彼得斯对手稿的批判性阅读和讨论。IMP由伯林格·英格尔海姆（Boehringer Ingelheim）资助，这项工作得到了欧洲共同体对K.N的网络资助（联系电话：QLG1-CT-2001-02026，分摊费用行动U2P2），以及欧洲共同体对R.R.的玛丽·居里（Marie Curie）奖学金的部分支持。，以及德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）为K.G.W.提供的研究奖学金。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。

笔记

补充材料可在http://www.genesdev.org。

文章和出版物位于http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.285404。

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社